CN116004470A - 一种硫化螺旋菌sg202及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硫化螺旋菌SG202及其应用，所述硫化螺旋菌SG202的分类学命名为Sulfurospirillum sp.，于2022年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:63074。本发明中的硫化螺旋菌SG202具有固氮菌功能，能够将氮气还原为作物可利用的氮肥，从而能够进一步驱动其在农业生产中用于水稻促长等应用，从而减少化学氮肥施用、降低环境污染，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种硫化螺旋菌SG202及其应用。
背景技术
水稻是中国的第一大粮食作物，养活了全球半数以上的人口。氮是水稻产量的主要限制因子之一。在相关技术中，化学氮肥和生物固氮是水稻生长主要氮素来源。
近年来，化学氮肥的施用显著的提高了水稻的产量，但化学氮肥的生产是主要利用Haber-Bosch工艺合成氨，该过程须在高温高压过程中进行，消耗占全球1％的能量，释放出占全球1.4％的CO2产出，而且长期的施用大量氮肥会造成一定程度的环境污染。此外，长期施用化学肥料也容易致使水稻土壤微生物群落结构发生改变，从而降低了水稻田固氮菌多样性。而且，相关技术中还发现关键固氮微生物菌群在长期不施肥的环境下呈系统发育聚集状态，而施肥条件下则呈现随机性状态，说明大量施用化学肥料还会导致其生物固氮功能逐渐退化。
生物固氮是水稻田的一种重要过程，是在微生物固氮酶的作用下将环境中的N2转化为植物可以直接吸收利用的NH4+，该过程能维持水稻田淹水状态下氮素的平衡，减少化学肥料施用，降低环境污染。相关技术表明，生物固氮是可持续环境友好的，被认为是植物氮素来源的最佳选择。生物固氮在生态系统中普遍存在，占全球固氮量的50％以上。
硫化螺旋菌属(Sulfurospirillum)是弯曲杆菌科下的一类严格厌氧、革兰氏阴性细菌。目前，硫化螺旋菌属仅包含8个有效种，关于硫化螺旋菌属资源研究报道甚少。全球可培养微生物约为1％，而厌氧微生物纯培养物占全球可培养微生物不到0.1％，大部分厌氧微生物处于未培养状态。因此，挖掘具有固氮菌功能的微生物新种是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提出一种硫化螺旋菌SG202及其应用。在本发明中，发明人从土壤中发现并分离得到了一株硫化螺旋菌SG202，经多相分类(生理生化、化学和基因型特性)分析证明该SG202菌株为Sulfurospirillum属的新种，命名为Sulfurospirillum oryzae.SG202。且通过试验发现，该菌株具有极好的固氮特性和产酶效果。
本发明的第一个方面，提供一种底部脱硫弧菌(Sulfurospirillum oryzae)SG202，所述硫化螺旋菌SG202的分类学命名为Sulfurospirillum sp.，于2022年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:63074。
保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202为革兰氏阴性细菌。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202菌落形状为边缘光滑，表面光滑，菌落橙色，菌落直径为0.5～1mm。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202是基于无氧条件下的改良R2A培养基筛选得到。
在本发明的一些实施方式中，所述改良R2A培养基为(在固体R2A培养基的基础上添加终浓度为40mM的富马酸钠。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202的生长温度范围为25～37℃。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202的最适生长温度范围为30℃。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202的pH适应范围为6.0～10.5。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202的最适pH适应范围为7.0～8.0。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202的NaCl浓度适应范围为0～0.6％(w/v)。
在本发明的一些实施方式中，所述硫化螺旋菌SG202的最适NaCl浓度适应范围为0％。
在本发明中，发明人通过验证发现，硫化螺旋菌SG202具有运动能力。
在本发明中，所述硫化螺旋菌SG202具有固氮菌功能，为严格厌氧、革兰氏阴性、运动的细菌。菌落为橙色、圆形。硫酸盐为电子受体，乙酸钠、丙酸钠、富马酸钠、乙醇、乳酸钠、苹果酸钠和丙酮酸钠能作为电子供体，但半胱氨酸和H2不能作为电子供体。
在本发明的一些实施方式中，在以乳酸钠作为电子供体时，富马酸盐、琥珀酸盐、棕榈酸盐、甘油、丙酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、葡萄糖和酵母提取物可以用作电子供体，而柠檬酸盐、苹果酸盐、苯甲酸盐、甲酸盐、乙酸盐、甲醇、乙醇、甲苯、苯酚、苯不能作为电子受体。在缺乏电子受体时，硫化螺旋菌SG202菌株的生长速度明显下降，生长缓慢。而以硫酸钠作为底物时，可观测到硫化螺旋菌SG202菌株有微弱生长，但在以苹果酸盐钠和乳酸钠作为电子供体的情况下则未见硫化螺旋菌SG202菌株生长。且SG202菌株具有产碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、酶脂(C4)和类脂酯酶(C8)的能力。
且经过基因组分析，发现SG202菌株与最相近模式菌株Sulfurospirillummultivorans DSM12446T的16S rRNA基因相似性为98.5％。基因组DNA G+C含量为39.0％，与最相近模式菌株的ANI和dDDH分别为84.4％和23.5％，主要脂肪酸为C16:1ω7c(40.6％),C16:0(33.3％),C18:1ω7c(13.6％)和C14:0(9.0％)，主要呼吸醌组分为MK-6。上述结果均表明菌株SG202为Sulfurospirillum的新种。
本发明的第二个方面，提供一种微生物产品，所述微生物产品中含有本发明第一个方面的硫化螺旋菌SG202。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物产品的剂型包括琼脂菌剂、液体菌剂、冻干菌粉、固体草炭粉剂、油干菌剂、颗粒接种剂、真空渗透接种剂。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他剂型进行使用。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物产品是以本发明第一个方面的硫化螺旋菌SG202为主要活性物质的微生物产品。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物产品中还含有其他辅剂。
在本发明的一些实施方式中，所述辅剂包括填料、粘结剂、分散剂、润湿剂、崩解剂、稳定剂中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物产品包括微生物菌剂、微生物发酵产品。
当然，本领域技术人员也可以基于该硫化螺旋菌SG202的菌种特性，开发得到其他类型的微生物产品，包括但不限于上述微生物菌剂和微生物发酵产品。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的硫化螺旋菌SG202在固氮发酵中的应用。
在本发明中，发明人基于乙炔还原法测定也表明具有较高的固氮酶活性，能够将氮气还原为作物可利用的氮肥。从而能够进一步驱动其在农业生产中用于水稻促长等应用，从而减少化学氮肥施用、降低环境污染，具有良好的应用前景。
在本发明的一些实施方式中，所述固氮发酵包括土壤固氮和有机物发酵。
在本发明中，基于硫化螺旋菌SG202的固氮和发酵效果，该硫化螺旋菌SG202还可以进一步用于制备菌肥，从而用于促进水稻增产或其他农业生产活动中。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的硫化螺旋菌SG202在生物制酶中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述酶选自碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、C4酶脂和C8类脂酯酶。
在本发明中，发明人通过试验验证，硫化螺旋菌SG202具有产碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、酶脂(C4)和类脂酯酶(C8)的能力，不产类脂酶(C14)、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶和β-岩藻糖苷酶
本发明的有益效果是：
1.在本发明中，发明人首次发现并分离得到的一株Sulfurospirillum属新菌种Sulfurospirillum oryzae SG202，该菌株为严格厌氧、革兰氏阴性、运动；接触酶反应为阴性，氧化酶反应阳性；菌落为橙色、圆形。硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐和0-5％的氧气为电子受体，富马酸盐、琥珀酸盐、棕榈酸盐、甘油、丙酸盐、丙酮酸盐、葡萄糖和酵母提取物能作为电子供体。
2.本发明中的Sulfurospirillum oryzae SG202具有固氮菌功能，能够将氮气还原为作物可利用的氮肥，从而能够进一步驱动其在农业生产中用于水稻促长等应用，从而减少化学氮肥施用、降低环境污染，具有良好的应用前景。
3.本发明中的Sulfurospirillum oryzae SG202具有产生碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、酶脂(C4)和类脂酯酶(C8)的能力，从而可以有效作为生物制酶的有效备选菌株或母体，以用于进行生物制酶产业的开发和利用。
附图说明
图1为本发明中的Sulfurospirillum oryzae SG202的基于16S rRNA基因的系统发育树图。
图2为本发明中的Sulfurospirillum oryzae SG202的固氮酶活性示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
试验材料
所使用的固体R2A培养基成分为：每升固体R2A培养基中，含有0.5g酵母浸出粉，0.5g蛋白胨，0.5g酪蛋白水解物，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g磷酸二氢钾，0.024g无水硫酸镁，0.3g丙酮酸钠，15.0g琼脂，蒸馏水1000mL，pH7.0。
所使用的液体R2A培养基成分为：每升液体R2A培养基中，含有0.5g酵母浸出粉，0.5g蛋白胨，0.5g酪蛋白水解物，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g磷酸二氢钾，0.024g无水硫酸镁，0.3g丙酮酸钠，pH7.0。蒸馏水1000mL。
所用的液体R2A培养基成分为：每升液体R2A培养基中，含有0.5g酵母浸出粉，0.5g蛋白胨，0.5g酪蛋白水解物，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g磷酸二氢钾，0.024g无水硫酸镁，0.3g丙酮酸钠，pH7.0。蒸馏水1000mL，制备方法为：将上述成分混合后加入蒸馏水1000mL，充分溶解，高温灭菌后即可使用。
硫化螺旋菌SG202的分离与纯化
在本实施例中，土壤样品取自福建省福州市福建农林大学水稻试验田。
取10g的水稻土壤样品，加入100mL的无菌水，制得新鲜土壤悬浮液。
取200μL梯度稀释的上述新鲜土壤悬浮液(稀释液为水，稀释倍数分别为10-4、10-5和10-6)，将不同稀释度的新鲜土壤悬浮液分别涂布于改良的R2A平板(在固体R2A培养基的基础上添加终浓度为40mM的富马酸钠)上，30℃严格厌氧培养14天。挑取平板上所长出的单菌落，采用连续划线法进行纯化。所有纯化的菌株采用10％ DMSO保菌液于-80℃保藏。其中，上述所有操作均是在厌氧手套箱工作台中进行，以保证厌氧环境。
在改良R2A平板上培养7天后，即可发现有菌落产生。其中，硫化螺旋菌SG202的菌落形状为圆形，边缘光滑，表面光滑，菌落橙色，菌落直径在0.5～1mm。
硫化螺旋菌SG202的鉴定与特征分析
1.硫化螺旋菌SG202的生物学特性：
对上述实施例中得到的硫化螺旋菌SG202进行革兰氏染色，具体操作为：
使用革兰氏染色液(试剂盒，购自索莱宝)，按照说明书操作要求，取对数期的硫化螺旋菌SG202菌液一滴于载玻片上，通过火焰进行固定，滴加结晶紫染色液停留1分钟，水洗；滴加碘液染色1分钟，水洗；滴加脱色液，摇动玻片脱色20-60s；滴加番红染色液停留1分钟，水洗。空气中晾干后，油镜观察。若为革兰氏阴性菌则观察为红色，反之，则为紫色。
经观察，硫化螺旋菌SG202革兰氏染色后为红色，即硫化螺旋菌SG202为革兰氏阴性细菌。
2.硫化螺旋菌SG202的生理生化特征：
(1)温度适应性：
配制改良R2A培养基平板(在固体R2A培养基的基础上添加固体R2A培养基总质量1.5％的琼脂)，吸取3μL上述实施例中得到的硫化螺旋菌SG202菌液点样至平板上，一式三份，分别放置于6、10、16、20、25、30、35、37、40和42℃条件下进行孵育，每个温度设置3个平行，两周后，测量各平板中菌落的直径。
结果发现，硫化螺旋菌SG202的生长温度范围25～37℃，最佳为30℃。
(2)pH适应性：
分别配置不同pH(5.0～11.0，梯度为0.5)的改良R2A液体培养基(添加40mM的富马酸钠)，按照5wt％的接种量将上述实施例中得到的硫化螺旋菌SG202菌液加入至改良R2A液体培养基中，一式三份，30℃严格厌氧培养两周后，测定菌液的吸光度(OD600)的变化。
结果发现，硫化螺旋菌SG202的可适应pH范围为6.0～10.5，最佳pH为7.0～8.0。
(3)NaCl浓度适应性：
分别配置不同NaCl浓度(0～1％(w/v)，梯度为0.1％)的改良R2A培养基平板(在固体R2A培养基的基础上添加固体R2A培养基总质量1.5％的琼脂)，吸取3μL上述实施例中得到的硫化螺旋菌SG202菌液点样至平板上，一式三份，30℃严格厌氧培养两周后，测量各平板中菌落的直径。
结果发现，硫化螺旋菌SG202的可适应NaCl浓度范围为0～0.6％(w/v)，最佳NaCl浓度为0％。
(4)需氧性：
将上述实施例中得到的硫化螺旋菌SG202划线于改良R2A平板(在固体R2A培养基的基础上添加固体R2A培养基总质量1.5％的琼脂)上，放置于30℃恒温培养箱非厌氧状态下培养两周。
观察发现硫化螺旋菌SG202未在平板上生长形成菌落，表明氧气条件下硫化螺旋菌SG202不能进行生长。
(5)运动能力：
采用悬滴法检测硫化螺旋菌SG202的运动能力，具体步骤为：取对数生长期的硫化螺旋菌SG202于盖玻片上，后用凹形载玻片倒置于盖玻片上，用少许玻璃胶固定，放置于光学显微镜下镜检。
在镜检中，在排除硫化螺旋菌SG202做无规则的分子运动后，可以清晰的观察到硫化螺旋菌SG202具有运动能力。
(6)产酶特性：
利用API ZYM试剂条检测新种菌株SG202的产酶特性，具体操作步骤按照说明书进行。
结果发现，硫化螺旋菌SG202具有产碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、酶脂(C4)和类脂酯酶(C8)的能力，不产类脂酶(C14)、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶和β-岩藻糖苷酶。
(7)电子供体与电子受体测试：
在电子供体试验中，均以20mM的硫酸盐作电子受体。在电子受体试验中，均以10mM的乳酸钠作电子受体。具体测定方法为：将上述实施例中得到的硫化螺旋菌SG202接种至无氧的无菌基础淡水培养基中，30℃下培养，测定生物量的变化，从而计算电子受体和供体的利用能力。
结果发现，在电子供体试验中，在以硫酸盐为电子受体的情况下，富马酸盐、琥珀酸盐、棕榈酸盐、甘油、丙酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、葡萄糖和酵母提取物可以用作电子供体，而柠檬酸盐、苹果酸盐、苯甲酸盐、甲酸盐、乙酸盐、甲醇、乙醇、甲苯、苯酚、苯则不能用作电子供体。在电子受体试验中，在以乳酸作为电子供体时，硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐和0-5％的氧气可以用作电子受体，而富马酸盐、元素硫不能用作电子受体。
同时，分别在不加电子受体和分别加入硫酸钠、乳酸钠、苹果酸钠作为电子供体的情况下硫化螺旋菌SG202发酵生长情况，环境及培养条件同电子供体与电子受体测试实验。
结果发现，在缺乏电子受体时，硫化螺旋菌SG202生长速度明显下降，生长缓慢。而以硫酸钠作为底物时，可观测到硫化螺旋菌SG202有微弱生长，而苹果酸盐和乳酸钠作为电子供体的情况下则未见硫化螺旋菌SG202生长。
(8)硫化螺旋菌SG202的16S rRNA基因鉴定：
通过细菌16S rRNA基因通用引物27F，序列为：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQID NO:1)和1492R，序列为：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO:2)对硫化螺旋菌SG202进行PCR扩增。其中，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，共30个循环；最后72℃延伸10min。
取5μL PCR扩增产物，点样于1％的琼脂糖凝胶中，以2000bp Marker作为标准分子量，在120V电压条件下电泳15min，用凝胶成像系统观察电泳结果。其中，对检测出有条带的菌株PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。采用ContigExpress软件对测序获得的16S rRNA基因序列进行校对，去除头尾两端杂乱碱基，将获得的有效序列提交至EZBioCloud(https：//www.ezbiocloud.net/)和NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行序列比对分析。若比对结果表明16S rRNA基因相似性高于98.65％，则初步判断认定其与最相近菌株处于同一种水平分类地位；反之，则判断为潜在新分类单元。
结果表明，本发明中获得的硫化螺旋菌SG202与最相近模式菌株Sulfurospirillummultivorans DSM12446T的16S rRNA基因相似性为98.5％，低于原核生物种界定阈值98.65％，为Sulfurospirillum属的潜在新种。
其中，硫化螺旋菌SG202的16S rDNA基因如下所示：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA GAGTGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGATTTAATAAGCTTGCTTATTAAGTTAGTGGCGCACGGGTGAGTAATATATAGCTAACCTGCCCTTTAGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCCCATACTCCTTCTTACCATAAGGTAAGTTGGGAAAGATTTATTGCTAAAGGATGGGGCTTTATTGTATCAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCTATGACGCATACCTGGTCTGAGAGGATGATCAGGCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCAACGCCGCGTGGAGGATGACGCATTTCGGTGTGTAAACTCCTTTTATAAGGGAAGATAATGACGGTACCTTATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGATGCGTAGGCTGGAAATCAAGTCGAGAGTGAAATCCAACGGCTCAACCGTTGAACTGCTCTCGAAACTGGTTACCTAGAATATGGGAGAGGTAGATGGAATTGGTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGATATCACCAGGAATACCGATTGCGAAGGCGATCTACTGGAACATTATTGACGCTGAGGCATGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCACACTAGTTGTTGCGATGCTAGTCATTGCAGTAATGCACTTAACAGATTAAGTGTGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATAGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGATACACGAAGAACCTTACCTGGGCTTGATATCCTAAGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCTAGTTTACTAGAACTTAGAGACAGGTGCTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTGATTAGTTGCTAACAGTTCGGCTGAGCACTCTAGTCAGACTGCCTTCGCAAGGAGGAGGAAGGTGAGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTATGCCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTAGGACAAAGAGACGCGATACTGCGAAGTGGAGCAAATCTTAAAACCTAGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGATATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACTCACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGAATTCACCCGAAGCCGGAATACTAAACTAGTTACCGACCACGGTGGGTTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGAGAACCTGCGGTTGGATCACCT-3′(SEQ ID NO:3)。
(9)硫化螺旋菌SG202的系统发育分析：
基于上述实施例中的EZBioCloud和NCBI数据库比对结果，下载数据库与分离菌株相近的模式菌株的16S rRNA基因序列，利用MEGA X软件，采用Kimura 2-parameter法计算进化距离、构建最大自然法(Maximum Likelihood)系统进化树，进行Bootstrap值为1000次重复验证。
其中，构建得到的系统进化树如图1所示，其再次印证了本发明中的硫化螺旋菌SG202为Sulfurospirillum属的潜在新种。
(10)硫化螺旋菌SG202的基因组ANI和dDDH分析：
使用GGDC(Genome-to-Genome Distance Calculator)在线计算软件估算硫化螺旋菌SG202的数字DNA-DNA杂交(dDDH)情况，利用ANI Calculator计算细菌与其模式菌株间的平均核苷酸一致性(ANI)。
结果发现硫化螺旋菌SG202与最相近模式菌株Sulfurospirillum multivoransDSM12446T的ANI和dDDH分别为84.4％和23.5％，低于原核生物种界定阈值96％和70％。因此，该结果表明硫化螺旋菌SG202是Sulfurospirillum属的1个新种。同时，也测得硫化螺旋菌SG202的基因组大小为2,632,398bp，DNA中G+C含量为39.0％。且基于基因组功能分析，发现硫化螺旋菌SG202具有固氮酶核心基因nifHDK，推测该菌株具有固氮功能。
(11)硫化螺旋菌SG202的脂肪酸检测：
具体步骤为：
挑取约40mg对数期的硫化螺旋菌SG202菌体放入带有螺旋盖的试管中(规格13mm×100mm)。向试管中加入1.0mL的皂化试剂(45g NaOH溶于300mL甲醇：水混合液，甲醇：水＝1：1，v/v)，拧紧盖子，振荡器振荡试管5～10s，沸水浴5min，取出后继续振荡5～10s，再次拧紧盖子，水浴25min，移出试管，室温冷却。向试管中加入2.0mL的甲基化试剂(325mL 6M的盐酸加入到275mL的甲醇中)，拧紧盖子，振荡器振荡5～10s，进行80℃水浴10min，移出试管并快速用自来水冲凉冷却至室温。加入1.25mL的萃取试剂(正己烷与甲基正丁醚1：1混合)，拧紧盖子，快速振荡10min，打开管盖，用移液管吸除试管的下层似水相。向试管中加入3.0mL的洗涤试剂(10.8g NaOH加入到900mL水)，拧紧盖子，快速振荡5min，用注射器吸取出约2/3体积的上层有机体到GC小瓶中，使用气相色谱系统(Agilent 7890N)进行检测。检测程序参数为：设置汽化室的温度250℃，检测器的温度300℃，载气氢气的流速为2mL·min-1，尾吹气氮气的流速为30mL·min-1，进样分流比100：1，柱前压为68.95kPa；色谱柱采用二阶程序升温，从170℃开始升温，每分钟升温5℃，升到260℃时，再每分钟升温40℃，升到310℃时，保持90s；进样量1μL。使用基于微生物细胞脂肪酸成分鉴定的全自动微生物鉴定系统Sherlock MIS4.5(Microbial Identification System)和LGS4.5(Library GenerationSoftware)对数据进行分析。
检测结果表明，硫化螺旋菌SG202的主要脂肪酸为C16:1ω7c(40.6％),C16:0(33.3％),C18:1ω7c(13.6％)和C14:0(9.0％)，与Sulfurospirillum属的脂肪酸种类一致。
(12)对硫化螺旋菌SG202进行醌组分分析：
将培养至对数期的硫化螺旋菌SG202进行离心收集后，用蒸馏水洗涤2～3次，再次离心后进行真空冷冻干燥，备用。称取约100mg冻干的SG127菌体加入40mL的氯仿：甲醇(2:l，v/v)混合溶液，置于暗处进行磁力搅拌10h左右，并于暗处用滤纸过滤，收集菌体。用减压旋转蒸发仪对菌体进行40℃减压蒸馏至干燥。用1～2mL的丙酮重新溶解干燥物，以长条状将样品点于GF 254硅胶板上。以甲苯作为展层剂，展层时间约20min，然后取出并进行风干。打开紫外灯(254nm)观察。Rf＝0.8，在绿色萤光背景下呈暗褐色的带即为甲基萘醌的位置。刮下Rf＝0.8的条带，用1mL的丙酮溶解，然后用细菌过滤器过滤除去硅胶，收集滤液，即得到甲基萘醌的丙酮溶液，将其置于黑暗处4℃保存。采用反相高压液相色谱分析法测定甲基萘醌样品，其中，高效液相色谱仪为Agilent 1100，反相高压液相柱为十八烷基硅烷，流动相为甲醇(色谱纯)：异丙醇(色谱纯)＝67:33(v/v)，流速为l mL·min-1，柱温为40℃。同时于250nm，270nm处进行紫外检测。
结果发现，硫化螺旋菌SG202的主要醌组分为MK-6，与Sulfurospirillum属的醌组分类型相同。
结合上述实施例中的结果，可以判定该硫化螺旋菌SG202为Sulfurospirillum属的一个新种。该SG202菌株(Sulfurospirillum oryzae SG202)于2022年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNO:63074，分类学命名为Sulfurospirillum sp。
硫化螺旋菌SG202的固氮能力
使用乙炔还原法(ARA法)测定SG202菌株的固氮酶活性(主要基于固氮酶可以将C2H2还原为C2H4的原理进行检测)，具体步骤为：将SG202菌株用改良的R2A液体培养基(在液体R2A培养基的基础上添加40mM的富马酸钠)培养至对数期，取20mL菌液转移至无菌厌氧离心管中，6000rpm离心10min，除去上清液。用无氮基础培养基(去除NHCl4 +的基础淡水培养基)漂洗3次后，重悬浮于装有20mL的无氮基础培养基中，用He/C2H2(90：10，v/v)交换的厌氧瓶(先将厌氧瓶与厌氧橡胶塞灭菌，盖上塞子后抽真空，再按比例充入混合气)进行培养。同时，以纯He交换的厌氧瓶作为阴性对照。培养2d后，用气象色谱检测还原乙烯的含量。
同时，对其进行蛋白含量测定：将用于测定固氮酶活性的菌液充分摇匀后，取出5mL菌液于15mL离心管中，利用超声波粉碎机(JY92-ⅡDN，宁波新芝生物科技股份有限公司)进行细胞破碎，利用蛋白含量测定试剂盒(Pierce BCAprotein assay kit)测定破碎菌液中的蛋白含量。
结果如图2所示，结合乙炔还原法的结果表明，SG202菌株具有较高的固氮酶活性，且经过计算其活性可达3470.45μmol C2H4 g-1protein h-1。
硫化螺旋菌SG202菌剂的制备
无菌条件下，按照1％的接种量将SG202菌株的新鲜菌体接种至除氧后无菌的改良R2A液体培养基(在液体R2A培养基的基础上添加40mM的富马酸钠)中，30℃静止培养3～5d，即可制备获得含有SG202菌株的微生物菌剂。
其中，改良的R2A液体培养基需提前利用混合气N2:CO2(80:20，vol/vol)曝气除氧0.5h以形成厌氧环境，铝盖封口后，121℃高压灭菌20min。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种硫化螺旋菌(Sulfurospirillum oryzae)SG202，其特征在于，所述硫化螺旋菌SG202的分类学命名为Sulfurospirillum sp.，于2022年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:63074。
2.根据权利要求1所述的硫化螺旋菌SG202，其特征在于，所述硫化螺旋菌SG202为革兰氏阴性细菌。
3.根据权利要求1所述的硫化螺旋菌SG202，其特征在于，所述硫化螺旋菌SG202菌落形状为圆形，边缘光滑，表面光滑，菌落橙色，，菌落直径为0.5～1mm。
4.一种微生物产品，其特征在于，所述微生物产品中含有权利要求1～3任一项所述的硫化螺旋菌SG202。
5.根据权利要求4所述的微生物产品，其特征在于，所述微生物产品的剂型包括琼脂菌剂、液体菌剂、冻干菌粉、固体草炭粉剂、油干菌剂、颗粒接种剂、真空渗透接种剂。
6.根据权利要求4所述的微生物产品，其特征在于，所述微生物产品包括微生物菌剂、微生物发酵产品。
7.权利要求1～3任一项所述的硫化螺旋菌SG202在固氮发酵中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述固氮发酵包括土壤固氮和有机物发酵。
9.权利要求1～3任一项所述的硫化螺旋菌SG202在生物制酶中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酶选自碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、C4酶脂和C8类脂酯酶。
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