CN116003419B - 大环化合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大环化合物，其通过共价键连接，固定化合物中吲哚片段，限制化合物的构象变化范围，通过活性实验得到化合物对EGFR突变型癌细胞的半数抑制浓度值(IC50)，证明了化合物对EGFR突变型细胞具有好的选择性抑制，对正常细胞的毒性远远低于现有的奥希替尼，具有抗肿瘤候选药物的潜力。本发明还提供了制备大环化合物的方法，其从已知可得的原料出发，通过多步反应合成出具有良好应用前景的大环化合物。
Description
技术领域
本发明涉及环状化合物技术领域，具体涉及大环化合物及制备方法。
背景技术
大环化合物在化学领域有着特殊的地位。在过去十年中，在生物信息学和合成方法学的进步的支持下，它们的化学多样性显著扩大。对于相同数量的重原子，大环具有比其无环类似物更少的可旋转键数，这是口服生物利用度的一个有益特征，因此，大环比其无环类似物在构象上更受限制，这可能会带来更高的目标结合和选择性，并提高口服生物利用度。拓扑上，大环化合物具有跨越大表面积的独特能力，同时与同等分子量的无环分子相比，其构象仍然受限。
现有文献报道，奥希替尼和靶点蛋白EGFR结合的晶体结构显示，在野生型蛋白和突变型蛋白中药物分子有不同的构象，药物分子的吲哚片段朝向有明显的不同。野生型存在于健康细胞组织中，而突变型只存在于肿瘤细胞中，所以，对于野生型靶点的抑制，奥希替尼很容易产生副作用。因此，通过限制构象研发新的大环化合物来提高药物对靶点的选择性，来降低患者对药物的不良反应具有非常重要的研究价值。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种大环化合物，其通过活性IC50实验证明了对EGFR突变型细胞具有好的选择性，细胞毒性远远低于现有的奥希替尼，具有抗肿瘤候选药物的潜力。
本发明还有另外一个目的是提供一种制备大环化合物的方法，其从已知可得的原料出发，通过多步反应合成出具有良好应用前景的大环化合物。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种大环化合物，其具有如下式（I）的结构：
（I）
其中，A为芳环，X为卤素。
优选的是，其中，A为或/>。
优选的是，其中，X为Cl。
本发明的目的还可以进一步由大环化合物的制备方法来实现，包括如下步骤：
步骤一、中间体式（II）化合物的合成
以吲哚类化合物为原料，进行烷基化和Heck反应或者引入醛基和维悌希反应得到式（II）化合物；
步骤二、中间体（III）化合物的合成
将所述步骤一得到的式（II）化合物作为中间体依次进行钯碳还原反应、傅-克反应、SnAr反应、取代反应、水解反应、还原反应以及酰胺关环反应制备得到式（I）化合物；
(II)。
优选的是，其中，所述步骤一中进行烷基化和Heck反应具体包括如下步骤：
S1，将5-溴吲哚溶于丙酮中，冰盐浴降温到0°C，加入KOH，然后滴加碘甲烷，油浴升温到40°C搅拌反应5小时；
S2，减压蒸除溶剂丙酮，萃取、干燥、减压蒸除溶剂得黄色油状液体；
S3，在氩气保护下，将醋酸钯和三苯基膦加到步骤S2所得的黄色油状液体和三乙胺的甲苯溶液中，油浴反应8～10小时，萃取、干燥、柱层析纯化得式（III）中间体；
（III）。
优选的是，其中，所述步骤一中进行引入醛基和维悌希反应具体包括如下步骤:
1）将1-甲基吲哚溶于四氢呋喃中，在氩气保护下，冰盐浴降温到0°C，将正丁基锂滴入上述反应液中，保持0°C搅拌反应30分钟，然后滴加N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反应30分钟；
2）萃取的有机相、干燥、柱层析纯化得白色固体；
3）将步骤2）得到得白色固体和甲氧甲酰基亚甲基三苯基膦溶于甲苯中，油浴升温回流反应2小时，降至室温，减压蒸除溶剂，柱层析纯化得式（VI）中间体；
（VI）。
优选的是，其中，所述步骤S1中，5-溴吲哚与碘甲烷的摩尔比为1:2。
优选的是，其中，所述步骤S3中，油浴反应温度为110°C。
优选的是，其中，所述步骤2）中，柱层析纯化所用溶剂为石油醚与乙酸乙酯，体积比为50:1。
优选的是，其中，所述步骤3）中，白色固体与甲氧甲酰基亚甲基三苯基膦1:1.5。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明大大环化合物通过活性IC50实验证明了对EGFR突变型细胞具有好的选择性，细胞毒性远远低于现有的奥希替尼，具有抗肿瘤候选药物的潜力。
2、本发明的大环化合物的制备方法，其从已知可得的原料出发，通过多步反应合成出具有良好应用前景的大环化合物。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物MD-2-1的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例1中化合物MD-2-2的结构表征图；
图3为本发明实施例1中化合物MD-2-3的结构表征图；
图4为本发明实施例1中化合物MD-2-4的结构表征图；
图5为本发明实施例1中化合物MD-2-5的结构表征图；
图6为本发明实施例1中化合物MD-2-6的结构表征图；
图7为本发明实施例1中化合物MD-2-7的结构表征图；
图8为本发明实施例1中化合物MD-2-9的结构表征图；
图9为本发明实施例2中化合物MD-3-1的结构表征图；
图10为本发明实施例2中化合物MD-3-2的结构表征图；
图11为本发明实施例2中化合物MD-3-3的结构表征图；
图12为本发明实施例2中化合物MD-3-4的结构表征图；
图13为本发明实施例2中化合物MD-3-5的结构表征图；
图14为本发明实施例2中化合物MD-3-6的结构表征图；
图15为本发明实施例2中化合物MD-3-7的结构表征图；
图16为本发明实施例2中化合物MD-3-9的结构表征图；
图17为本发明实施例3中化合物MD-2-9的细胞毒性结果图；
图18为本发明实施例3中化合物MD-3-9的细胞毒性结果图；
图19为本发明实施例3中奥西替尼的细胞毒性结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
大环化合物MD-2-9，其结构式如下：
具体合成路线如下：
具体合成步骤如下：
1）化合物MD-2-1的合成
将5-溴吲哚（5.0 g, 25.5 mmol）溶于100 mL 丙酮中，冰盐浴降温到0°C，加入KOH（5.27 g, 101.9mmol），然后滴加碘甲烷（7.24 g, 51.1 mmol），大约5分钟加完，油浴升温到40°C搅拌反应5小时，TLC显示反应完全，减压蒸除溶剂，加入乙酸乙酯（100 mL）和100 mL水，萃取分液，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤掉干燥剂，取滤液减压蒸除溶剂，得到黄色油状液体MD-2-1（5.1 g, 产率 94%，Rf = 0.4，石油醚/乙酸乙酯= 5/1）。1H NMR (400MHz, Chloroform-d) δ 7.73 (t,J= 1.6 Hz, 1H), 7.32 – 7.22 (m, 1H),7.16 (d,J=8.6 Hz, 1H), 7.02 (dd,J= 3.2, 1.4 Hz, 1H), 6.40 (d,J= 3.1 Hz, 1H), 3.75 (s,3H). 化合物MD-2-1核磁共振氢谱图见图1。
2）化合物MD-2-2的合成
在氩气保护下，将醋酸钯（0.43 g，1.9 mmol）和三苯基膦 （1.00 g，3.8 mmol）加到MD-2-1（7.93 g，37.7 mmol）和三乙胺（7.63g, 75.4 mmol）的30 mL甲苯溶液中，油浴升温到110°C搅拌反应过夜，TLC显示反应完全，加入乙酸乙酯（100 mL），水洗（100 mL×2），取有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，取滤液减压蒸除溶剂，柱层析纯化（PE/EA=30/1，体积比），得淡黄色固体MD-2-2（6.1 g，产率75%，Rf = 0.3，石油醚/乙酸乙酯= 5/1，体积比）。1HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.84 (d,J= 15.9, 1H), 7.77 (d,J= 1.6, 1H), 7.44(d,J= 8.6, 1H), 7.30 (d,J= 8.6, 1H), 7.06 (d,J= 3.1 Hz, 1H), 6.51 (d,J= 3.1,1H), 6.41 (d,J= 15.9 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H).13C NMR (151 MHz,Chloroform-d) δ 168.1, 146.8, 137.9, 130.0, 128.7, 126.0, 122.6, 121.1,114.4, 109.7, 102.1,51.5, 33.0. MS: calcd for C13H14NO2[M+H]+216.10, found216.09. 化合物MD-2-2的核磁共振氢谱图见图2A，核磁共振碳谱图见图2B，质谱图见图2C。
3）化合物MD-2-3的合成
将MD-2-2（6.10 g 28.4mmol）溶于100 mL甲醇和100 mL四氢呋喃混合液中，加入0.60 g无水钯碳，然后用氢气球置换气体，保持氢气环境常温搅拌反应过夜（8～10小时），TLC显示反应完全，减压过滤，取滤液减压蒸除溶剂，得橙色固体MD-2-3（5.80 g，产率94%）。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 7.44 (s, 1H), 7.24 (d,J= 6.6 Hz, 1H), 7.07(dd,J= 8.3, 1.7 Hz, 1H), 7.02 (d,J= 3.1 Hz, 1H), 6.42 (d,J= 3.1 Hz, 1H), 3.76(s, 3H), 3.67 (s, 3H), 3.09 – 3.02(m, 2H), 2.72 – 2.64 (m, 2H).13C NMR (151MHz, Chloroform-d) δ 173.8, 135.7, 131.5, 129.2, 128.8, 122.3, 120.1, 109.3,100.7, 51.6, 36.8, 32.9, 31.3. MS:calcd for C13H16NO2[M+H]+218.12, found218.11. 化合物MD-2-3的核磁共振氢谱图见图3A，核磁共振碳谱图见图3B，质谱图见图3C。
4）化合物MD-2-4的合成
将2,4-二氯嘧啶（3.98 g，26.7 mmol）溶于20 mL1，2-二氯乙烷中，然后加入无水三氯化铝（3.56 g, 26.7 mmol），室温搅拌反应5分钟，加入MD-2-3（5.80 g, 26.7 mmol），油浴升温到80°C，搅拌反应2小时，TLC显示反应完全，加入100 mL二氯甲烷稀释，水洗（100mL×2），取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤取滤液，减压蒸除溶剂，柱层析纯化（PE/EA=2/1，体积比），得黄色固体MD-2-4（3.61 g，产率40%）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ8.44 (d,J= 5.5, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.94 – 7.88 (m, 1H),7.49 – 7.42 (m, 1H),7.30 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 7.18 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.67 (s, 3H),3.13 (t,J= 7.7 Hz, 2H), 2.72 (t,J= 7.8 Hz, 2H).13C NMR (151 MHz, Chloroform-d)δ 173.6, 164.4, 161.5, 158.5, 137.0, 134.6, 133.0, 126.0, 123.9, 120.8,114.0, 112.2, 110.3,51.7, 36.6, 33.6, 31.4. MS: calcd for C17H17ClN3O2[M+H]+330.10, found 330.09. 化合物MD-2-4的核磁共振氢谱图见图4A，核磁共振碳谱图见图4B，质谱图见图4C。
5）化合物MD-2-5的合成
将MD-2-4（3.60 g, 10.9 mmol），4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺（2.0 g, 10.9mmol），TsOH （2.49 g，13.1 mmol）和60 mL叔丁醇加到250 mL的封管中混合，油浴加热升温到100°C，搅拌反应3小时，TLC显示反应完全，降温到室温，抽滤，将滤饼用10 mL叔丁醇洗涤一次，取滤饼通过柱层析纯化（DCM/MeOH=50/1，体积比），得到黄色固体MD-2-5（3.2 g，产率60%）。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 9.85 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 8.42 (d,J= 5.2Hz, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.33 (d,J= 8.4 Hz, 1H),7.22 (d,J= 5.3 Hz, 1H), 7.17 (dd,J= 8.4, 1.6 Hz, 1H), 6.73 (d,J= 12.1 Hz,1H), 4.02 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.12 (t,J= 7.9 Hz, 2H), 2.73(t,J= 7.8 Hz, 2H).13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 173.6, 161.9, 159.0,158.1, 153.0 (d,J= 9.0 Hz), 150.8, 137.1, 133.8, 133.4, 126.6, 126.0, 123.3,123.2, 119.9, 114.4,113.3, 110.4, 109.0, 99.6 (d,J= 26.5 Hz), 56.8, 51.7,36.7, 33.6, 31.5. MS: calcd for C24H23FN5O5[M+H]+408.17, found 408.17. 化合物MD-2-5的核磁共振氢谱图见图5A，核磁共振碳谱图见图5B，质谱图见图5C。
6）化合物MD-2-6的合成
将MD-2-5（3.2 g, 6.7 mmol），N, N, N’-三甲基乙二胺（1.00 g, 9.8 mmol）和DIPEA（2.20 g, 17 mmol）溶于50mL N,N-二甲基乙酰胺中，油浴加热升温到100°C，搅拌反应2小时，TLC显示反应完全，降至室温，加入200 mL二氯甲烷和200 mL水，萃取分液，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤掉干燥剂，取滤液减压浓缩得粗品，粗品通过柱层析纯化（DCM/MeOH=10/1，体积比），得橘红色固体MD-2-6（3.11 g，产率82%）。1H NMR (600 MHz,Chloroform-d) δ 9.58 (s, 1H), 8.39 (d,J= 5.3 Hz, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.92 (s,1H), 7.55 (s, 1H), 7.31 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.17 (d,J= 5.4 Hz, 1H), 7.16 –7.13 (m, 1H), 6.70 (s, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.67 (s, 3H), 3.33(t,J= 7.2 Hz, 2H), 3.11 (t,J= 7.9 Hz, 2H), 2.89 (s, 3H), 2.71 (t,J= 7.9 Hz,2H), 2.67 (d,J= 7.8 Hz, 2H), 2.35 (s, 6H).13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ173.7, 161.8, 159.3, 158.1, 152.4, 142.7, 137.0, 134.5, 133.7, 133.5, 126.1,123.9, 123.1, 120.0, 116.1, 113.5, 110.3, 108.4, 102.2,56.8, 56.3, 53.7,51.7, 45.5, 41.6, 36.7, 33.6, 31.5. MS: calcd for C29H36N7O5[M+H]+562.28, found562.30. 化合物MD-2-6的核磁共振氢谱图见图6A，核磁共振碳谱图见图6B，质谱图见图6C。
7）化合物MD-2-7的合成
将MD-2-6（3.0 g, 5.34 mmol）溶于50mL四氢呋喃中，加入LiOH（1.28 g, 53.40mmol）的20mL水溶液，再加入10mL甲醇，油浴升温至60°C搅拌反应3h，TLC显示反应完全，减压旋干，加入50mL DCM，20mL氯化铵饱和水溶液和100 mL水,萃取分液，水相再用二氯甲烷萃取（100mL×3），合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤除掉干燥剂，收集滤液并减压蒸除溶剂得橘红色固体MD-2-7（1.61 g，产率58%）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.75 (s,1H), 8.30 (d,J= 5.3 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.38(d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.18 (d,J= 5.3 Hz, 1H), 7.10 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.84 (s,1H), 3.95 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.24 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 2.91 (t,J= 7.5 Hz,2H), 2.81 (s, 3H), 2.77 – 2.67(m, 2H), 2.51 (d,J= 7.1 Hz, 2H), 2.18 (s, 6H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ 175.0, 162.6, 160.4, 157.8, 154.5, 143.8, 137.1,134.3, 134.0, 133.5, 126.2,123.4, 122.9, 121.2, 118.2, 113.0, 110.7, 108.4,103.6, 57.0, 53.4, 46.3, 45.6, 36.8, 33.5, 31.5, 10.5. MS: calcd for C28H34N7O5[M+H]+548.26, found 548.51. 化合物MD-2-7的核磁共振氢谱图见图7A，核磁共振碳谱图见图7B，质谱图见图7C。
8）化合物MD-2-9的合成
将MD-2-7（0.71 g, 1.29 mmol）溶于100 mL四氢呋喃中，加入0.3克无水钯碳，在氢气氛围下，搅拌反应过夜，TLC显示反应完全，过滤取滤液，在另一反应瓶中加入HATU（1.04 g, 2.74 mmol）、Et3N（0.69 g, 6.85 mmol）和100 mL四氢呋喃，在氩气保护下，将上述滤液在40°C下滴入反应瓶，约3小时加完，然后室温反应10小时，TLC显示反应完全，减压蒸除溶剂，加入100 mL二氯甲烷和100 mL水，萃取分液，取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤去除干燥剂，取滤液减压旋蒸浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱层析纯化 (二氯甲烷/甲醇=25/1~10/1，体积比)，得到类白色固体，然后溶于20 mL HCl/EtAc溶液（2N），然后减压蒸除溶剂得到类白色固体MD-3-9（0.18 g，产率 25.9%，Rf = 0.4，二氯甲烷/甲醇=10/1，体积比）。1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 8.43 (s, 1H), 8.27 (d,J= 5.3 Hz, 1H), 8.23 –8.13 (m, 3H), 7.59 (s, 1H), 7.40 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 7.25 (dd,J= 8.8, 4.1 Hz,1H), 7.17 (d,J= 5.3 Hz, 1H), 7.14 – 7.05 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 3.92 (s, 3H),3.84 (s, 3H), 3.19 (s, 4H), 3.09 (t,J= 6.1 Hz, 2H), 2.86 (s, 2H), 2.70 (s,3H), 2.49 (s, 6H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ 173.2, 161.7, 160.7, 158.8,148.9, 141.2, 140.9, 137.2, 125.7, 125.1, 123.4, 122.9, 122.3, 121.3, 119.0,111.6, 111.5, 110.8, 104.6,56.6, 54.2, 49.2, 42.9, 42.4, 33.5, 29.9, 24.4.HRMS: calcd for C28H34N7O2[M+H]+500.2768, found 500.2775. 化合物MD-2-9的核磁共振氢谱图见图8A，核磁共振碳谱图见图8B，质谱图见图8C。
<实施例2>
大环化合物MD-3-9，其结构式如下：
具体合成路线如下：
具体合成步骤如下：
1）化合物MD-3-1的合成
将1-甲基吲哚（5.0 g, 38.1 mmol）溶于100 mL 四氢呋喃中，在氩气保护下，冰盐浴降温到0°C，将15.5 mL 正丁基锂（2.5 M）滴入上述反应液中，约20分钟加完，保持0°C搅拌反应30分钟，然后滴加3.5 mL N, N-二甲基甲酰胺，约5分钟加完，室温搅拌反应30分钟，加入200 mL乙酸乙酯和200mL饱和食盐水，萃取分液， 取有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，取滤液减压旋干，得到暗红色粗产品，将粗产物通过柱层析分离 (石油醚/乙酸乙酯=50/1，体积比)，得到类白色固体3.9 g（产率64.3%，Rf = 0.4，石油醚/乙酸乙酯= 5/1，体积比）。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.95 – 9.86(m, 1H), 7.74 (d,J= 8.1 Hz,1H), 7.49 – 7.33 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 7.18 (t,J= 8.0 Hz, 1H), 4.11 (s, 3H).13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 183.0, 140.9, 135.8, 127.0, 126.4, 123.4,121.0, 117.5, 110.4, 31.6. MS: calcdfor C10H10NO [M+H]+159.08, found 160.06. 化合物MD-3-1的核磁共振氢谱图见图9A，核磁共振碳谱图见图9B，质谱图见图9C。
2）化合物MD-3-2的合成
将MD-3-1（5.0 g，31.4 mmol）和甲氧甲酰基亚甲基三苯基膦（15.7 g，46.9 mmol）溶于250mL甲苯中，油浴升温到回流，搅拌反应约2小时，TLC显示反应完全，降温到室温，减压蒸除溶剂得粗产物，将粗产物通过柱层析纯化 (石油醚/乙酸乙酯= 50/1，体积比)，得到黄色固体MD-3-2（5.3 g，产率 78.4%，Rf = 0.6，石油醚/乙酸乙酯= 5/1，体积比）。1H NMR(600 MHz, Chloroform-d) δ 7.80 (d,J= 15.8 Hz, 1H), 7.61 (d,J= 8.0 Hz, 1H),7.31 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 7.29 – 7.23 (m, 1H), 7.17 – 7.06 (m, 1H), 6.96 (s,1H), 6.48 (d,J= 15.7 Hz, 1H), 3.82 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, Cyclohexane-d 12)δ 167.5, 139.1, 134.9, 132.9, 127.5,123.7, 121.5, 120.5, 117.8, 109.7, 103.8,51.8, 30.1. MS: calcd for C13H14NO2[M+H]+216.10, found 216.08. 化合物MD-3-2的核磁共振氢谱图见图10A，核磁共振碳谱图见图10B，质谱图见图10C。
3）化合物MD-3-3的合成
将MD-3-2（5.3 g, 24.6 mmol）溶于100 mL四氢呋喃和100mL甲醇混合溶剂中，加入0.5 g钯碳，在氢气氛围下室温搅拌反应过夜（8～10小时），次日TLC显示反应完全，过滤，取滤液减压蒸除溶剂得到类白色固体MD-3-3（5.1 g，产率 95.3%，Rf = 0.6，石油醚/乙酸乙酯= 5/1，体积比）。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 7.53 (d,J= 7.8 Hz, 1H),7.30 – 7.23 (m, 1H),7.21 – 7.12 (m, 1H), 7.10 – 6.99 (m, 1H), 6.24 (s, 1H),3.15 – 2.97 (m, 2H), 2.83 – 2.70 (m, 2H).13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ173.1, 139.2, 137.5, 127.8, 121.0, 120.0, 119.4, 108.9, 98.7, 51.9, 32.9,29.5, 22.2. MS: calcd for C13H16NO2[M+H]+218.12, found 218.13. 化合物MD-3-3的核磁共振氢谱图见图11A，核磁共振碳谱图见图11B，质谱图见图11C。
4）化合物MD-3-4的合成
在室温下，将2,4-二氯嘧啶（4.4 g, 29.5 mmol）溶于200 mL 1,2-二氯乙烷中，在磁力搅拌下，缓慢加入三氯化铝（3.9 g, 29.3 mmol），室温搅拌反应5分钟，向上述溶液加入MD-3-3（6.4 g, 29.5 mmol），油浴升温到80°C，搅拌反应2小时，TLC显示反应完全，降温到室温，加入200 mL水，萃取分液，取有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤掉干燥剂，取滤液减压蒸除溶剂得粗产物，将粗产物通过柱层析纯化 (石油醚/乙酸乙酯=2/1，体积比)，得到黄色固体MD-3-4（5.1 g，产率 52.6%，Rf = 0.3，石油醚/乙酸乙酯=1/1，体积比）。1H NMR(600 MHz, Chloroform-d) δ 8.51 (d,J= 4.7 Hz, 1H), 7.91 (d,J= 7.8 Hz, 1H),7.60 (d,J= 5.0 Hz, 1H), 7.39 (d,J= 8.1 Hz, 1H), 7.35 – 7.29 (m, 1H), 7.28 –7.23 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.71 (s,3H), 3.58 – 3.46 (m, 2H), 2.95 – 2.68 (m,2H).13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 173.1, 164.8, 161.1, 158.6, 144.0,137.4,125.7, 122.7, 122.0, 119.2, 116.5, 110.2, 109.6, 51.9, 33.4, 30.0, 21.5. MS:calcd for C17H17ClN3O2[M+H]+330.10, found 330.08. 化合物MD-3-4的核磁共振氢谱图见图12A，核磁共振碳谱图见图12B，质谱图见图12C。
5）化合物MD-3-5的合成
将MD-3-4（2.75 g）、4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺（1.55 g）和对甲苯磺酸（0.60 g）加入封管中，然后加入50 mL叔丁醇，密封后油浴加热升温到105°C，搅拌反应2小时，降温到室温，TLC显示反应完全，减压蒸除溶剂得到粗产物，将粗产物通过柱层析纯化 (二氯甲烷/甲醇=50/1，体积比)，得到黄色固体MD-3-5（3.1 g，产率 74.8%，Rf = 0.7，二氯甲烷/甲醇=20/1，体积比）。1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 8.98 (d,J= 8.2 Hz, 1H), 8.51 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.93 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 7.56 (d,J= 8.2 Hz, 1H),7.36 (d,J= 13.2 Hz, 1H), 7.24 (t,J= 6.7 Hz, 2H), 7.16 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 4.02(s, 3H), 3.81 (d,J= 7.4 Hz, 3H), 3.56 (s, 3H), 3.43 (s, 3H), 2.66 (t,J= 8.0Hz, 2H). MS: calcd for C24H23FN5O5[M+H]+480.17, found 480.17. 化合物MD-3-5的核磁共振氢谱图见图13A，质谱图见图13B。
6）化合物MD-3-6的合成
将MD-3-5（1.8 g, 3.75 mmol）、N,N,N’-三甲基乙二胺（0.58 g, 5.68mmol）和DIPEA（1.22 g, 9.44 mmol）混合溶于50 mL DMA中，油浴升温到120°C，搅拌反应3小时，TLC显示反应完全，降温到室温，减压蒸除溶剂得到粗产物，将粗产物通过柱层析纯化 (二氯甲烷/甲醇=25/1)，得到橙色固体MD-3-6（1.3 g，产率 61.7%，Rf = 0.5，二氯甲烷/甲醇=20/1）。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 9.14 (s, 1H), 8.46 (d,J= 5.2 Hz, 1H),7.94 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.37 (d,J= 8.1 Hz, 1H), 7.30 – 7.26 (m,1H), 7.22 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 7.14 (d,J= 5.2 Hz, 1H), 6.70 (s, 1H), 3.99 (s,3H), 3.82 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.62 – 3.56 (m, 2H), 3.29 (t,J= 7.2 Hz, 2H),2.87 (s, 3H), 2.77 – 2.67 (m, 2H), 2.62 (t,J= 7.3 Hz, 2H), 2.32 (s, 6H).13CNMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 172.96, 163.10, 159.79, 157.43, 152.30, 142.43,141.20, 137.21, 135.12, 126.14, 123.59, 122.24, 121.24, 119.56, 116.30,111.73, 111.26,109.68, 102.31, 56.85, 56.21, 53.86, 51.81, 45.57, 41.56,33.98, 29.82, 21.65, 21.21. MS: calcd for C29H36N7O5[M+H]+562.28, found 562.31.化合物MD-3-6的核磁共振氢谱图见图14A，核磁共振碳谱图见图14B，质谱图见图14C。
7）化合物MD-3-7的合成
将MD-3-6（1.20 g, 2.14 mmol）溶于30 mL四氢呋喃中，加入氢氧化锂（0.256g,10.68 mmol）的20 mL水溶液，再加入10 mL甲醇，油浴升温到60°C，搅拌反应3小时，TLC显示反应完全，降温到室温，减压蒸除溶剂，加入500 mL二氯甲烷和20mL饱和氯化铵水溶液，再加入100 mL水，萃取分液，取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤去除干燥剂，取滤液减压旋蒸浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱层析纯化 (二氯甲烷/甲醇=25/1~10/1，体积比)，得到橙色固体MD-3-7（1.60 g，产率 51.3%，Rf = 0.3，二氯甲烷/甲醇=5/1，体积比）。1H NMR(600 MHz, Chloroform-d) δ 8.82 (s, 1H), 8.36 (d,J= 4.8 Hz, 1H), 7.87 (d,J=7.8 Hz, 1H), 7.34 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.26 – 7.24 (m, 1H), 7.21(t,J= 7.6 Hz, 1H), 7.18 (d,J= 4.9 Hz, 1H), 6.47 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.83 –3.63(m, 3H), 3.39 – 3.35 (m, 4H), 2.94 (s, 3H), 2.76 – 2.57 (m, 4H), 2.35 (s,6H).13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 176.2, 163.2, 159.9, 157.3, 153.7,142.7, 142.6, 137.3, 134.0, 126.1, 122.9, 121.9, 121.0,120.0, 119.2, 112.2,111.0, 109.5, 102.3, 56.0, 54.0, 53.1, 50.9, 43.8, 40.5, 34.0, 29.7, 21.2.MS: calcd for C28H34N7O5[M+H]+548.26, found 548.46. 化合物MD-3-7的核磁共振氢谱图见图15A，核磁共振碳谱图见图15B，质谱图见图15C。
8）化合物MD-3-9的合成
将MD-3-7（1.5 g, 2.74 mmol）溶于100 mL四氢呋喃中，加入0.5克无水钯碳，在氢气氛围下，搅拌反应过夜，TLC显示反应完全，过滤取滤液，在另一反应瓶中加入HATU（2.08g, 5.47 mmol）、Et3N（1.39 g, 13.70 mmol）和100 mL四氢呋喃，在氩气保护下，将上述滤液在40°C下滴入反应瓶，约3小时加完，然后室温反应10小时，TLC显示反应完全，减压蒸除溶剂，加入100 mL二氯甲烷和100 mL水，萃取分液，取有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤去除干燥剂，取滤液减压旋蒸浓缩得到粗产物，将粗产物通过柱层析纯化 (二氯甲烷/甲醇=25/1~10/1)，得到类白色固体，然后溶于20 mL HCl/EtAc溶液(2N)，然后减压蒸除溶剂得到类白色固体MD-3-9（0.51 g，产率 34.7%，Rf = 0.4，二氯甲烷/甲醇=10/1）。1H NMR (600MHz, DMSO-d 6) δ 10.18 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 8.43 (d,J= 5.2 Hz, 1H), 8.19 (d,J= 2.5 Hz, 1H), 7.77 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.55 (d,J= 8.2 Hz, 1H),7.22 (t,J= 7.7 Hz, 1H), 7.18 – 7.13 (m, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.81 (d,J= 2.0 Hz,1H), 3.86 (d,J= 1.7 Hz, 6H), 3.42 (t,J= 9.2 Hz, 2H), 3.25 (s, 2H), 2.75 (s,6H), 2.68 (s, 2H), 2.59 (d,J= 2.0 Hz, 3H), 2.54 (d,J= 1.9 Hz, 2H), 2.50 –2.45 (m, 2H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ 172.6, 161.1, 160.1, 158.1, 148.3,140.5, 140.3, 136.6, 125.1, 124.5, 122.8,122.3, 121.6, 120.7, 118.3, 111.0,110.9, 110.2, 103.9, 56.0, 54.8, 53.6, 48.6, 42.3, 41.8, 32.9, 29.2, 23.8.HRMS: calcd for C28H34N7O2[M+H]+500.2768, found 500.2775. 化合物MD-3-9的核磁共振氢谱图见图16A，核磁共振碳谱图见图16B，质谱图见图16C。
<实施例3>
本发明实施例1，2合成的大环化合物MD-2-9、MD-3-9和现有抗肿瘤药物奥西替尼的人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）毒性测试实验：
以人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）模拟人体健康细胞，测试化合物对健康细胞的毒性。
将HUVEC细胞接种于含有100μL DMEM(10%胎牛血清和1%抗生素)的96孔板(5000个细胞/孔)中，在37℃的5%二氧化碳气氛下培养24小时。将96孔板中的培养上清液吸掉，每孔分别加入100 μL含有一定浓度（100 μM，200 μM，300 μM，400 μM，500 μM）的化合物的 DMEM溶液，每个浓度平行6个孔，同时设置调零孔（不加细胞，只加培养基），对照孔（只加细胞和培养液，不加药物），每组设定5个复孔。置于37 ℃、5% 二氧化碳培养箱培养4 小时。吸取上层培养基，每孔加入100 μL完全培养基，置于培养箱培养20 小时。避光，每孔加入20 μLMTT溶液（5 mg/mL），再置于培养箱中培养4 小时。避光，吸掉上层液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值，计算存活率 (%) ＝(给药孔-调零孔)/(对照-调零孔)×100%。
化合物MD-2-9的细胞毒性结果图见图17，化合物MD-3-9的细胞毒性结果图见图18，奥西替尼的细胞毒性结果图见图19，从健康细胞毒性实验结果可以看出，现有的奥西替尼对健康细胞的毒性很强，而本发明的大环化合物MD-2-9、MD-3-9对健康细胞的毒性远远低于现有的抗肿瘤药物奥西替尼。
<实施例4>
本发明实施例1，2合成的大环化合物MD-2-9、MD-3-9的对癌细胞的半数抑制浓度（IC50）测定实验。
将人皮肤鳞癌细胞（A-431）接种于含有100μL DMEM-H (10%胎牛血清和1%抗生素)的96孔板(5000个细胞/孔)中，在37℃的5%二氧化碳气氛下培养24小时。将96孔板中的培养上清液吸掉，每孔分别加入100 μL含有不同浓度（1 μM，10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM，100 μM）化合物的 DMEM-H溶液，每个浓度平行6个孔，同时设置调零孔（不加细胞，只加培养基），对照孔（只加细胞和培养液，不加药物），每组设定5个复孔。置于37 ℃、5% 二氧化碳培养箱培养4 小时。吸取上层培养基，每孔加入100 μL完全培养基，置于培养箱培养20 小时。避光，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），再置于培养箱中培养4 小时。避光，吸掉上层液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值，抑制率(%) ＝1-(给药孔-调零孔)/(对照-调零孔)×100%。通过曲线拟合计算得出半数抑制浓度（IC50）值。
将人非小细胞肺腺癌细胞（NCI-H1975）接种于含有100μL RPMI 1640 (10%胎牛血清和1%抗生素)的96孔板(5000个细胞/孔)中，在37℃的5%二氧化碳气氛下培养24小时。将96孔板中的培养上清液吸掉，每孔分别加入100 μL含有不同浓度（1 μM，10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM，100 μM）化合物的 RPMI 1640溶液，每个浓度平行6个孔，同时设置调零孔（不加细胞，只加培养基），对照孔（只加细胞和培养液，不加药物），每组设定5个复孔。置于37 ℃、5% 二氧化碳培养箱培养4 小时。吸取上层培养基，每孔加入100 μL完全培养基，置于培养箱培养20 小时。避光，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），再置于培养箱中培养4小时。避光，吸掉上层液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值，通过曲线拟合计算得出半数抑制浓度（IC50）值。
实验结果如下表1。
表1化合物MD-2-9、MD-3-9对癌细胞的半数抑制浓度（IC50）
| 细胞系 | NCI-H1975 | A431 |
| 化合物MD-2-9(μM) | 47 | 19 |
| 化合物MD-3-9(μM) | 15 | 7.9 |
从化合物MD-2-9、MD-3-9对癌细胞的半数抑制浓度测定实验可以看出，本发明的化合物MD-2-9、MD-3-9对EGFR突变型细胞具有很好的选择性。从对健康细胞的毒性实验和对EGFR突变型细胞的抑制浓度测定实验可以看出，本发明合成的大环化合物对健康细胞的毒性小，可以有效抑制EGFR突变型细胞，而现有抗肿瘤药物奥希替尼对健康细胞的毒性很大，对于野生型靶点（存在于健康细胞组织中）的抑制，很容易产生副作用。而本发明的大环化合物通过共价键连接，固定化合物中吲哚片段，限制了化合物的构象变化范围，对EGFR突变型细胞具有高选择性。可能会降低患者对药物的不良反应，因此，本发明的大环化合物MD-2-9、MD-3-9具有作为抗EGFR突变型肿瘤药物的潜力。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (5)
1.大环化合物，所述含能化合物具有如下式（I）的结构：
（I）。
2.一种制备权利要求1所述的大环化合物的方法，包括如下步骤：
步骤一、中间体式（II）化合物的合成
以吲哚类化合物为原料，引入醛基和维悌希反应得到式（II）化合物；
步骤二、式（I）化合物的合成
将所述步骤一得到的式（II）化合物作为中间体依次进行钯碳还原反应、傅-克反应、SnAr反应、取代反应、水解反应、还原反应以及酰胺关环反应制备得到式（I）化合物；
(II)。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述步骤一中进行引入醛基和维悌希反应具体包括如下步骤:
1）将1-甲基吲哚溶于四氢呋喃中，在氩气保护下，冰盐浴降温到0°C，将正丁基锂滴入上述反应液中，保持0°C搅拌反应30分钟，然后滴加N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反应30分钟；
2）萃取的有机相、干燥、柱层析纯化得白色固体；
3）将步骤2）得到得白色固体和甲氧甲酰基亚甲基三苯基膦溶于甲苯中，油浴升温回流反应2小时，降至室温，减压蒸除溶剂，柱层析纯化得式（II）中间体。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述步骤2）中，柱层析纯化所用溶剂为石油醚与乙酸乙酯，体积比为50:1。
5.如权利要求3所述的方法，其中，所述步骤3）中，白色固体与甲氧甲酰基亚甲基三苯基膦1:1.5。
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- 2022-11-18 CN CN202211453177.8A patent/CN116003419B/zh active Active
Patent Citations (4)
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| WO2020125513A1 (zh) * | 2018-12-19 | 2020-06-25 | 凯复制药有限公司 | 作为cdk抑制剂的大环化合物、其制备方法及其在医药上的应用 |
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Also Published As
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