CN115998724B - 布洛芬在抗幻觉作用药物中的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了布洛芬在抗幻觉作用药物中的新用途，本发明经动物实验验证发现所述布洛芬能够特异性地抑制幻觉作用，具有开发成抑制经典致幻剂诱导产生的幻觉作用相关药物的潜能，为本领域抗幻觉作用药物的研发提供了新的思路和新的方向。

Description

布洛芬在抗幻觉作用药物中的新用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及布洛芬在抗幻觉作用药物中的新用途。

背景技术

如今，以抑郁症、焦虑症、创伤后应激障碍（PTSD）等为代表的精神类疾病或已成为仅次于心血管疾病的人类第二大疾病。但在疾病治疗上，长期的临床观察表明，抗抑郁药治疗对多达30%的抑郁症患者不起作用。此外，PTSD患者更是没有专门的药物治疗，只能依靠心理治疗辅助抗抑郁、抗焦虑症相关药物。因此，更为高效的抗抑郁药物及PTSD治疗药物的开发迫在眉睫。近年来，越来越多的研究者开始研究经典致幻剂对精神疾病的治疗作用，例如，天然的经典致幻剂裸盖菇素（Psilocybin，又名赛洛西宾），许多临床试验表明裸盖菇素能够用于快速治疗或缓解抑郁症（包括与癌症相关的抑郁症和焦虑症）；经典致幻剂3, 4-亚甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA），相关研究学者表明MDMA在治疗PTSD方面取得了良好的效果。其中，基于裸盖菇素对重度抑郁症的治疗已经进入II期临床试验，而MDMA辅助治疗PTSD已经进入III期临床试验，可见经典致幻剂在治疗精神类疾病方面具有巨大的潜能。然而，经典致幻剂的致幻副作用极大地限制了其在临床研究和治疗中的应用。

布洛芬（Ibuprofen）是一种常见的非甾体类抗炎药，通过抑制环氧合酶来缓解许多疾病的疼痛和炎症，属于芳基丙酸类非甾体抗炎药，具有镇痛、抗炎、解热作用，其镇痛、抗炎的机制为通过抑制细胞膜的环氧酶，抑制花生四烯酸代谢为炎性介质前列腺素，从而减轻因前列腺素引起的局部组织充血、肿胀，降低周围局部神经对缓激肽等痛觉的敏感性。此外，布洛芬还可通过作用于下丘脑体温调节中心而起到解热作用。适用于感冒、急性上呼吸道感染、急性咽喉炎等疾病引起的发热；缓解类风湿关节炎、风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎等多种慢性关节炎的急性发作期或持续性的关节肿痛症状；可用于非关节性的多种软组织风湿性疼痛或炎症等。目前关于经典致幻剂激活5-HT_2A受体诱导幻觉作用的分子机制仍不明确，亟需发现经典致幻剂诱导幻觉作用的具体分子作用机制及作用靶点，从而特异性地抑制幻觉作用，开发能够用于特异性抑制幻觉作用的药物。

发明内容

为了克服目前经典致幻剂在治疗抑郁症等精神类疾病中存在的不足，本发明提供了Ibuprofen在抗幻觉作用药物中的新用途。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：将Ibuprofen用作抑制幻觉作用的药物或用作抑制幻觉作用的药物的活性成分。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了Ibuprofen在制备特异性抗幻觉作用的药物中的用途。

进一步，所述幻觉作用为5HT_2A受体介导的幻觉作用。

进一步，所述药物包含有效量的Ibuprofen。

进一步，所述药物由Ibuprofen与一种或多种载体和/或辅料经由通用的药剂学方法制成。

进一步，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球、气溶胶。

在本发明中，所述幻觉为5HT_2A受体介导的幻觉，即经典致幻剂作用于5-HT受体，通过激活5-HT_2A受体诱导产生的幻觉作用。所述经典致幻剂包括但不限于：2,5-二甲氧基-4-甲基苯丙胺（DOM）、赛洛西滨（Psilocybin）、赛洛辛（Psilocin）、2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺（DOI）、麦角酰二乙胺（LSD）、N,N-二甲基色胺（DMT）。此外，所述幻觉作用并不局限于经典致幻剂诱导产生的幻觉作用，其他致幻剂（例如，酒精、吗啡、可卡因等）诱导产生的病理性的幻觉作用均在本发明所述的经典致幻剂的保护范围内。

在本发明中，所述Ibuprofen是指布洛芬，在本发明的具体实施方案中，所述Ibuprofen优选为购自于上海陶术生物科技有限公司、货号为T1394的Ibuprofen。

进一步，在本发明的具体实施方案中，本发明以经典致幻剂DOM或Psilocin诱导的甩头小鼠模型为例，代表性地研究了本发明所述的Ibuprofen对致幻剂诱导的幻觉作用的影响，所述致幻剂并不局限于本发明所列出的具体致幻剂，只要是能够引起幻觉作用的致幻剂均在本发明的保护范围内。在本发明的具体实施方案中，所述致幻剂优选为作用于5-HT受体通过激活5-HT_2A受体诱导产生幻觉作用的经典致幻剂。

进一步，本发明所采用的甩头小鼠模型是目前本领域最常用的研究致幻行为的动物模型。甩头反应（HTR）是一种头部快速的左右旋转行为，在给予大鼠和小鼠5-羟色胺能致幻剂或其他5-HT_2A激动剂后出现，甩头反应被广泛用作5-HT_2A受体激活的行为测定。小鼠的甩头反应效果和人类致幻效果之间存在很强的正相关性，也即甩头反应能够指征幻觉行为的产生。

进一步，本发明所述的药物可以被配制为固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶。本发明所述的药物可以通过制药领域中公知的方法制备。例如，旨在注射给药的药物可以通过将本发明所述的Ibuprofen或其药学上可接受的盐或前药与灭菌的蒸馏水组合来制备，从而形成溶液剂。可添加表面活性剂以促进形成均匀溶液或混悬液。制备药物的实际方法为本领域技术人员所已知的方法，例如可参见The Science and Practice of Pharmacy(制药科学与实践)，20^th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)。

进一步，本发明所述药物的给药途径包括但不限于：口服、局部、经皮、肌肉、静脉、吸入、肠胃外、舌下、直肠、阴道及鼻内。例如，适合口服给药的剂型包括胶囊、片剂、颗粒剂以及糖浆等。这些制剂中包含的本发明所述的Ibuprofen可以是固体粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液或是混悬液；油包水或水包油的乳剂等。上述剂型可由活性化合物（本发明所述的Ibuprofen）与一种或多种载体或辅料经由通用的药剂学方法制成。上述的载体需要与活性化合物或其他辅料兼容。对于固体制剂，常用的无毒载体包括但不限于：甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、葡萄糖、蔗糖等。用于液体制剂的载体包括但不限于：水、生理盐水、葡萄糖水溶液、乙二醇和聚乙二醇等。活性化合物可与上述载体形成溶液或是混悬液。具体的给药方式和剂型取决于化合物本身的理化性质以及所应用疾病/病症的严重程度等。本领域技术人员能够根据上述因素并结合其自身具有的知识来确定具体的给药途径。例如可参见：李俊，《临床药理学》，人民卫生出版社，2008.06；丁玉峰，论临床剂型因素与合理用药，医药导报，26(5), 2007; Howard C. Ansel, Loyd V. Allen, Jr, NicholasG. Popovich著，江志强主译，《药物剂型与给药体系》，中国医药科技出版社，2003.05。

进一步，本发明所述的药物以符合医学实践规范的方式配制，定量和给药。本发明所述的化合物Ibuprofen的治疗有效量由要治疗的具体病症、治疗的个体、病症的起因、药物的靶点以及给药方式等因素综合决定。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指本发明所述的化合物Ibuprofen的量，当本发明所述的化合物Ibuprofen被施用于哺乳动物（例如人）时，该量足以有效地治疗/改善哺乳动物（例如人）的疾病/病症。构成“治疗有效量”的本发明所述的化合物Ibuprofen的量取决于所用的具体化合物的本身的性质、要治疗的具体病症、病症的起因、药物的靶点、疾病的严重程度、给药方式以及待治疗的哺乳动物（例如人）的年龄、体重、身体状况等，但可常规地由本领域技术人员根据其自身的知识及本申请公开的内容而决定。

如本文中所使用的，术语“幻觉”是指在缺乏具有真实感知质量的外部刺激的情况下的感知。在一些实施例中，幻觉可以是生动的、实质的、并且被认为位于外部客观空间中。如本文所用的，幻觉可以以任何感觉形态发生，包括但不限于：视觉、听觉、嗅觉、味觉、触觉、本体感受、平衡感受、痛觉、热觉和时间感。在一些实施例中，所述幻觉选自幻视、幻听、幻嗅、幻味、幻触、本体感受幻觉、平衡感受幻觉、痛觉幻觉、热觉幻觉、时间感幻觉及其任何组合。在本发明的具体实施方案中，所述幻觉优选为5HT_2A受体介导的幻觉。

本发明的第二方面提供了特异性抗幻觉作用的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包含有效量的Ibuprofen。

进一步，所述药物组合物还可包含用于治疗幻觉的第二活性成分。

进一步，所述第二活性成分包括典型抗精神病药物和非典型抗精神病药物。

进一步，所述典型抗精神病药物包括氯丙嗪、氟奋乃静、氟哌啶醇、奋乃静、硫利达嗪、替沃噻吨、三氟拉嗪。

进一步，所述非典型抗精神病药物包括阿立哌唑、月桂酰阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、伊潘立酮、鲁拉西酮、奥氮平、帕潘立酮、喹硫平、利培酮、匹莫范色林、齐拉西酮。

进一步，本发明所述的药物组合物可包含Ibuprofen或其在药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，所述药物组合物包括但不限于：口服剂型、胃肠外给药剂型、外用剂型和直肠给药剂型。在一些实施方式中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、粉剂、缓释制剂、溶液和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液，或者用于直肠给药的栓剂。在一些实施方式中，所述药物组合物施用于哺乳动物。在其它实施方式中，所述哺乳动物是人。在其它实施方式中，所述药物组合物还包含药物载体、赋形剂和/或助剂。在其它实施方式中，所述药物组合物还包含至少一种其他用于治疗/辅助治疗幻觉的治疗剂。

如本文中所使用的，术语“赋形剂”是指药学上可接受的赋形剂，包括但不限于任何被相关的管理部门许可为可接受供人类或家畜使用的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

如本文中所使用的，术语“前药”表示可在生理学条件下被水解而被转化成本发明的活性化合物（Ibuprofen）的化合物。因此，术语“前药”是指本发明所述的化合物Ibuprofen的药学上可接受的代谢前体。但被给予有需要的个体时，前药可以不具有活性，但在体内能够被转化成本发明所述的活性化合物（Ibuprofen）。前药通常在体内迅速转化，而产生本发明的母体化合物，例如通过在血液中水解来实现。前药化合物通常在哺乳动物生物体内提供溶解度、组织相容性或缓释的优点。

如本文中所使用的，术语“施用”包括处方施用以及实际施用，并且包括由所治疗的受试者或另一个人的物理施用。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指任何受试者、患者或个体，诸如患有幻觉或处于患幻觉风险、或者经典致幻剂诱导的患有幻觉或经典致幻剂诱导的处于患幻觉风险的受试者，在本文中，所述“受试者”、“患者”和“个体”可互换使用。术语“受试者”、“患者”和“个体”包括哺乳动物，优选为人。

附图说明

图1为经典致幻剂DOM和Psilocin、非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride和TBG腹腔给药小鼠后大脑皮层中Nogo-A和RhoA蛋白表达量变化的结果图；

图2为经典致幻剂DOM和Psilocin、非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride和TBG腹腔给药小鼠后大脑皮层中Nogo-A和RhoA蛋白磷酸化变化的结果图；

图3为Ibuprofen对经典致幻剂DOM诱导的小鼠甩头行为的影响结果图，其中，每组n=8-10，数据表示为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，数据使用单因素方差分析（One way ANOVA）和Dunnett's检验进行分析；

图4为Ibuprofen对经典致幻剂Psilocin诱导的小鼠甩头行为的影响结果图，其中，每组n=8-10，数据表示为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，数据使用单因素方差分析（One way ANOVA）和Dunnett's检验进行分析；

图5为P75 NTR抑制剂TAT-Pep5对经典致幻剂DOM诱导的小鼠甩头行为的影响结果图，其中，每组n=6，数据表示为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，数据使用单因素方差分析（One way ANOVA）和Dunnett's检验进行分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1 Western Blot检测致幻剂作用后Nogo-A、RhoA的变化

1、实验材料

本实施例中使用到的实验试剂、实验抗体和实验仪器分别见下表1-3。

本实施例中主要试剂配置：

10×电泳液running buffer：将电泳液：双蒸水按1：9配置。

10×电转液transfer buffer：将电转液：甲醇：双蒸水按1：2：7配置。

10×TBST：将TBST：双蒸水按1：9配置。

5%脱脂奶粉：取2 g脱脂奶粉，加40 mL的1×TBST充分溶解。

5% BSA：取2 g BSA，加40 mL的1×TBST充分溶解。

过硫酸铵：取1.00g过硫酸铵，溶于10 mL双蒸水中。

2、Western Blot检测致幻剂作用后Nogo-A、RhoA的变化

本实施例所采用的样品为经典致幻剂DOM（1 mg/kg）和Psilocin（0.5 mg/kg）和非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride（T61065-上海陶术生物科技有限公司）（0.1 mg/kg）和TBG（军事医学研究院毒物药物研究所合成）（20 mg/kg）腹腔给药小鼠（斯贝福(北京)生物技术有限公司，C57，雄性，18-22 g，6-8周）后10 min时大脑皮层的蛋白提取物。采用Western Blot实验检测上述样品中Nogo-A和RhoA蛋白的表达量变化。具体Western Blot实验方法如下：

（1）制胶

①选下缘平滑的玻璃板，清洗玻璃板和梳子后使用蒸馏水冲洗并吹干。

②厚、薄两块玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子。操作时要使两块玻璃板下边缘对齐，以免漏胶。

③按聚丙烯酰胺凝胶配方配制所需的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。10%分离胶配方见下表4，5%浓缩胶的配方见下表5。

（2）灌胶与上样

①灌胶时，用枪沿玻璃板一侧加入，待胶面升到距离短板上沿15 mm左右即可。然后加一层水，液封后的胶面凝的更快。灌胶时开始可快一些，胶面快达所需高度时要放慢速度。胶水液封是要很慢并且从左到右均匀一层，否则胶会被冲变型。

②当水和胶之间有一条折线时（室温下，大约20 min），说明胶已凝。再等3 min使胶充分凝固就可倒去上层水并用滤纸吸干。

③按聚丙烯酰胺凝胶配方配制5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间从一侧加入灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。插梳子要使梳子一侧先插下去，再缓慢将另一侧插下，最后检查梳子是否水平。

④胶凝后，用蒸馏水冲洗一下凝胶，将其放入电泳槽中。薄玻璃板在内侧，厚玻璃板在外侧。若只跑一块胶，电泳槽的另一边要放置一块替代玻璃板的塑料板。

⑤将内槽加满新的电泳液后开始准备上样，内槽电泳液至少要没过内侧玻璃板，外槽加约3 cm高电泳液没过玻璃板下沿即可。两手分别捏住梳子的两边垂直向上轻轻将其拔岀，用l mL移液枪对加样孔进行吹打冲洗，加样是用移液器吸取样品，枪尖插至加样孔上方两板间隙处缓慢加入样品。未加样的孔需用1×loading buffer补齐。

（3）电泳

①选择恒压80V进行电泳，样品进入分离胶后可将电压调至120V加快速度。电泳至溴酚蓝跑到胶的下边缘即可终止电泳。

（4）转膜

①准备一块PVDF膜，面积略大于所要转印的胶面面积。转印一块胶需要8张薄滤纸或4张厚滤纸（8×10 cm）。如果是PVDF膜，使用前需用甲醇活化30-60 s且转膜液中配方含甲醇。

②在加有电转液的玻璃大皿里放入转膜用的夹子、两块海绵、滤纸和膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵纸，用手按压海绵，赶出气泡，使电转液浸透海绵。在垫子上垫两层厚滤纸，一手固定滤纸一手赶去其中的气泡。

③将玻璃板撬掉后剥，切除下边缘由于挤压变形的胶，将浓缩胶剥离干净。小心剥离分离胶盖于滤纸上，轻轻用手赶去气泡，将膜盖于胶上，盖下后不可移动。再盖上滤纸，海绵，将夹子夹好。

④将夹子放入电转槽中，胶在负极，膜在正极（黑-黑，红-白）。利用冰块使电转体系处于低温环境中，200 mA恒流转移2 h。

⑤转完后用镊子将膜取出，用TBST冲洗1次，从边上倒，防止冲走蛋白。

（5）抗体孵育

①首先将膜置于封闭液（5%脱脂牛奶或BSA）中常温摇动1-4 h或4℃过夜。

②用5%的BSA将一抗按一定比例稀释。加入一抗稀释液，常温摇动1-4 h或4℃过夜。

③回收一抗，用TBST溶液常温下洗膜3-4次，每次5 min。

④用5%的牛奶将二抗按一定比例稀释（常用1：5000），加入二抗稀释液，常温摇床孵育1 h。

⑤弃二抗，用TBST洗3-4次，5 min/次。

（6）显影

①将膜蛋白面朝上置于黑板上，显影液A/B液1：1混匀（换枪头）后滴加在膜上，充分覆盖。

②将黑板放入曝光机器中，在白光条件下拍摄Marker，在自发光条件下曝光目的条带。

（7）数据统计

使用Photoshop、ImageJ以及GraphPad Prism进行数据分析。

3、实验结果

经典致幻剂DOM（1 mg/kg）和Psilocin（0.5 mg/kg）、非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride（0.1 mg/kg）和TBG（20 mg/kg）腹腔给药小鼠后10 min时大脑皮层的蛋白提取物中Nogo-A和RhoA蛋白的表达量变化结果见图1，结果显示，Nogo-A蛋白的变化量不明显，DOM和Psilocin给药后RhoA蛋白的量呈上调趋势。表明RhoA蛋白在经典致幻剂的急性作用中可能通过改变蛋白量而发挥作用，而Nogo-A蛋白可能不是通过改变蛋白量而发挥作用，而是可能通过蛋白修饰或其他形式的变化而发挥作用。

实施例2 Phos-tag凝胶电泳检测致幻剂作用后Nogo-A、RhoA的变化

1、实验材料

本实施例中使用到的实验试剂、实验抗体和实验仪器分别见下表6-8。

本实施例中的主要试剂配置：

1×电泳液running buffer：将电泳液：双蒸水按1：9配置。

1×电转液transfer buffer：将电转液：甲醇：双蒸水按1：2：7配置。

1×TBST：将TBST：双蒸水按1：9配置。

5%脱脂奶粉：取2 g脱脂奶粉，加40 mL的1×TBST充分溶解。

5% BSA：取2 g BSA，加40 mL的1×TBST充分溶解。

过硫酸铵：取1.00 g过硫酸铵，溶于10 mL双蒸水中。

Phosbind：10 mg Phosbind溶于0.10 mL甲醇和3.2 mL蒸馏水中。

10 mmol/L Mncl²⁺：10 mg溶于5 mL蒸馏水。

10 mmol/L EDTA：350 mg EDTA溶于120 mL电转液中。

2、实验方法

本实施例所采用的样品为经典致幻剂DOM（1 mg/kg）和Psilocin（0.5 mg/kg）和非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride（T61065-上海陶术生物科技有限公司）（0.1 mg/kg）和TBG（军事医学研究院毒物药物研究所合成）（20 mg/kg）腹腔给药小鼠（斯贝福(北京)生物技术有限公司，C57，雄性，18-22 g，6-8周）后10 min时大脑皮层的蛋白提取物。采用Phos-tag凝胶电泳检测上述样品中Nogo-A和RhoA蛋白的磷酸化变化。具体Phos-tag凝胶电泳检测实验方法如下：

（1）制胶

①选下缘平滑的玻璃板，清洗玻璃板和梳子后使用蒸馏水冲洗并吹干。

②厚、薄两块玻璃板对齐后放入夹中卡紧,垂直卡在架子。操作时要使两块玻璃板下边缘对齐，以免漏胶。

③按聚丙烯酰胺凝胶配方配制所需的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。10%分离胶配方见下表9，5%浓缩胶的配方见下表10。

（2）灌胶与上样

①灌胶时，用枪沿玻璃板一侧加入，待胶面升到距离短板上沿15 mm左右即可。然后加一层水，液封后的胶面凝的更快。灌胶时开始可快一些，胶面快达所需高度时要放慢速度。胶水液封是要很慢并且从左到右均匀一层，否则胶会被冲变型。

②当水和胶之间有一条折线时（室温下，大约20 min），说明胶已凝。再等3 min使胶充分凝固就可倒去上层水并用滤纸吸干。

③按聚丙烯酰胺凝胶配方配制5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间从一侧加入灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。插梳子要使梳子一侧先插下去，再缓慢将另一侧插下，最后检查梳子是否水平。

④胶凝后，用蒸馏水冲洗一下凝胶，将其放入电泳槽中。薄玻璃板在内侧，厚玻璃板在外侧。若只跑一块胶，电泳槽的另一边要放置一块替代玻璃板的塑料板。

⑤将内槽加满新的电泳液后开始准备上样，内槽电泳液至少要没过内侧玻璃板，外槽加约3 cm高电泳液没过玻璃板下沿即可。两手分别捏住梳子的两边垂直向上轻轻将其拔岀，用l mL移液枪对加样孔进行吹打冲洗，加样是用移液器吸取样品，枪尖插至加样孔上方两板间隙处缓慢加入样品。未加样的孔需用1×loading buffer补齐。

（3）电泳

①选择恒压80V进行电泳，样品进入分离胶后可将电压调至120V加快速度。电泳至溴酚蓝跑到胶的下边缘即可终止电泳。

（4）洗膜

电泳后，转膜之前，需要使用螯合剂（EDTA）从凝胶中除去锰离子（Mn²⁺）。此步骤可提高磷酸化和非磷酸化蛋白转移到PVDF膜上的转移效率。

①电泳后，将凝胶在含有1-10 mmol/L EDTA的普通转移缓冲液中浸泡至少10分钟，同时轻轻摇动。（10分钟×1-3次）。根据凝胶厚度等调整EDTA缓冲液的处理时间和温度（例如：1.5 mm厚：处理20分钟×两次）。

②将凝胶在不含EDTA的普通转移缓冲液中浸泡10分钟，同时轻轻摇动（10分钟×1次）。

（5）转膜

①准备一块PVDF膜，面积略大于所要转印的胶面面积。转印一块胶需要8张薄滤纸或4张厚滤纸（8×10 cm）。如果是PVDF膜，使用前需用甲醇活化30-60 s且转膜液中配方含甲醇。

②在加有电转液的玻璃大皿里放入转膜用的夹子、两块海绵、滤纸和膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵纸，用手按压海绵，赶出气泡，使电转液浸透海绵。在垫子上垫两层厚滤纸，一手固定滤纸一手赶去其中的气泡

③将玻璃板撬掉后剥，切除下边缘由于挤压变形的胶，将浓缩胶剥离干净。小心剥离分离胶盖于滤纸上，轻轻用手赶去气泡，将膜盖于胶上，盖下后不可移动。再盖上滤纸，海绵，将夹子夹好。

④将夹子放入电转槽中，胶在负极，膜在正极（黑-黑，红-白）。利用冰块使电转体系处于低温环境中，200 mA恒流转移2 h。

⑤转完后用镊子将膜取出，用TBST冲洗1次，从边上倒，防止冲走蛋白。

（6）抗体孵育

①首先将膜置于封闭液（5%脱脂牛奶或BSA）中常温摇动1-4h或4℃过夜。

②用5%的BSA将一抗按一定比例稀释。加入一抗稀释液，常温摇动1-4 h或4℃过夜。

③回收一抗，用TBST溶液常温下洗膜3-4次，每次5 min。

④用5%的牛奶将二抗按一定比例稀释（常用1:5000)，加入二抗稀释液，常温摇床孵育1 h。

⑤弃二抗，用TBST洗3-4次，5 min/次。

（7）显影

①将膜蛋白面朝上置于黑板上，显影液A/B液1：1混匀（换枪头）后滴加在膜上，充分覆盖。

②将黑板放入曝光机器中，在白光条件下拍摄Marker，在自发光条件下曝光目的条带。

（8）数据统计

使用Photoshop、ImageJ以及GraphPad Prism进行数据分析。

3、实验结果

根据Phos-Tag实验原理，如同一种蛋白出现两条距离相近的条带，则上条带为发生磷酸化修饰的蛋白量，下条带为未发生磷酸化修饰的蛋白量。上、下两条条带为总的该蛋白的蛋白量。

检测经典致幻剂DOM（1 mg/kg）和Psilocin（0.5 mg/kg）、非致幻型5-HT2A受体激动剂Lisuride（0.1 mg/kg）和TBG（20 mg/kg）腹腔给药小鼠后，10分钟时小鼠大脑皮层的蛋白提取物样品中Nogo-A和RhoA蛋白的磷酸化变化结果图见图2，结果显示，Nogo-A蛋白仅检测到一条条带，则Nogo-A蛋白的磷酸化变化不明显。RhoA蛋白检测到两条条带，上面为发生磷酸化的蛋白量，下条带为未发生磷酸化变化的蛋白量，可以得到Psilocin组的RhoA磷酸化变化呈下降趋势。表明RhoA蛋白在经典致幻剂的急性作用中可能通过改变蛋白量以及发生磷酸化修饰而发挥作用。而Nogo-A蛋白可能不是通过磷酸化修饰而发挥作用。

实施例3 Ibuprofen对经典致幻剂诱导的幻觉作用的抑制研究

1、实验材料

实验动物：SPF级C57小鼠，雄性，体重20-22 g；由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证，SCXK(京)2019-0010。实验动物饲养于军事医学研究院行为中心，8-10只/笼。12 h昼夜交替室温（22±2℃），湿度（40±20℃）%，自由饮水摄食，实验前适应环境三天。

实验试剂：本实施例中使用到的实验试剂见下表11。

实验器材：本实施例中使用到的实验器材见下表12。

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本实施例中的主要试剂配置：

DOM溶液配置：称取适量样品溶于生理盐水，配置成0.1 mg/mL，适用于小鼠腹腔注射。

Psilocin溶液配置：称取适量样品溶于1% DMSO和99%生理盐水，配置成0.5 mg/mL，使用生理盐水稀释成0.05 mg/mL，适用于小鼠腹腔注射。

Ibuprofen溶液配置：称取适量样品溶于5% DMSO+30% PEG 300+5%吐温80 +60%生理盐水，配置成9 mg/mL，梯度稀释成3 mg/mL和1 mg/mL，用于小鼠侧脑室注射。

P75 NTR抑制剂TAT-Pep5溶液配制：称取适量样品溶于生理盐水，配置成1 mg/mL，梯度稀释成0.2 mg/mL和0.04 mg/mL，用于小鼠侧脑室注射。

2、甩头反应实验验证Ibuprofen对经典抑制剂诱导的幻觉作用的抑制效果

（1）Ibuprofen对经典抑制剂诱导的幻觉作用的影响

甩头反应（HTR）是一种头部快速的左右旋转行为，在给予大鼠和小鼠5-羟色胺能致幻剂或其他5-HT_2A激动剂后出现，甩头反应被广泛用作5-HT_2A受体激活的行为测定。在经典致幻剂研究中，甩头反应是目前最常用的动物模型。小鼠的甩头反应效果和人类致幻效果之间存在很强的正相关性，也即甩头反应能够指征幻觉行为的产生。

本实施例中所述实验小鼠首先使用上述工具药物（Ibuprofen）进行侧脑室给药。等待30分钟后，腹腔注射经典致幻剂DOM或Psilocin。注射完毕后立即放入透明箱中进行甩头反应行为的观察并进行人工计数，行为测试进行15或30分钟。

其中，DOM的药物剂量为1 mg/kg，使用腹腔注射的方式进行注射；Psilocin的剂量为0.5 mg/kg，使用腹腔注射的方式进行注射。工具药物（Ibuprofen）选择低（5 μg/5 μL）、中（15 μg/5 μL）、高（45 μg/5 μL）三个剂量，均使用侧脑室注射的方式进行注射，在致幻剂给药前30 min进行注射。侧脑室注射给药体积为5 μL，腹腔注射给药体积为0.2 mL/20 g。

（2）P75 NTR抑制剂TAT-Pep5对经典抑制剂诱导的幻觉作用的影响

本实施例进一步验证了P75 NTR抑制剂TAT-Pep5对经典致幻剂DOM诱导的小鼠甩头行为的影响。实验中DOM的药物剂量为1 mg/kg，使用腹腔注射的方式进行注射。TAT-Pep5选择低（0.2 μg/5 μL）、中（1 μg/5 μL）、高（5 μg/5 μL）三个剂量，均使用侧脑室注射的方式进行注射，在DOM给药前30 min进行注射。

3、实验结果

Ibuprofen对经典抑制剂诱导的幻觉作用的抑制效果见图3和图4，图3和图4中的左图显示Ibuprofen具有显著的甩头行为抑制作用，且呈现出剂量梯度式的变化，表明Ibuprofen能够显著抑制经典致幻剂诱导的小鼠甩头行为，也即本发明所述的Ibuprofen对经典致幻剂诱导的幻觉作用具有显著的抑制作用；图3和图4中的右图为甩头反应15或30分钟内的甩头次数变化，每5分钟累计计数一次，结果显示在致幻剂给药后大约5到10分钟时Ibuprofen给药组与对照组开始出现明显的甩头次数差异。以上结果进一步表明Ibuprofen能够应用于特异性抑制幻觉作用的药物的制备中。

P75 NTR抑制剂TAT-Pep5对经典致幻剂诱导的小鼠甩头行为影响的结果图见图5，图5中的左图显示低、中和高剂量的TAT-Pep对小鼠的甩头行为都没有明显的抑制或上调作用，表明在Nogo-A/RhoA信号通路中，P75 NTR受体及其下游的RhoA激活并不参与到幻觉效应中；图5中的右图为甩头实验30分钟内的甩头次数变化，每5分钟累计计数一次，可见四组的甩头次数曲线均没有明显的差异，也即并不是抑制Nogo-A/RhoA信号通路中的蛋白均能抑制幻觉作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.布洛芬在制备特异性抗致幻剂诱导产生的幻觉作用的药物中的用途，其特征在于，所述幻觉作用为5HT_2A受体介导的幻觉作用，所述药物由布洛芬与一种或多种载体和/或辅料经由通用的药剂学方法制成。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物包含有效量的布洛芬。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球、气溶胶剂。

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