CN111228500A - Cd146作为治疗靶点在制备治疗哮喘气道重塑的药物中的应用 - Google Patents

Cd146作为治疗靶点在制备治疗哮喘气道重塑的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CD146作为治疗靶点在制备治疗哮喘气道重塑的药物中的应用。CD146作为治疗靶点在筛选治疗哮喘的药物中的应用。抑制CD146表达的物质或拮抗CD146的物质在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用；优选在制备哮喘气道重塑的药物中的应用。本发明公开了检测支气管患者血浆患者的CD146的应用，首次发现CD146在哮喘以及正常人血清中的表达差异，该指标可作为支气管哮喘的血清分子标志物。且本发明研究表明HDM通过CD146加重哮喘气道重塑。因此，可以将CD146作为治疗靶点用于筛选治疗支气管哮喘中的应用。针对CD146的抗体也可以作为支气管哮喘的一种治疗策略。

Description

CD146作为治疗靶点在制备治疗哮喘气道重塑的药物中的 应用
技术领域
本发明属于医学检验领域，涉及CD146作为治疗靶点在制备治疗哮喘气道重塑的药物中的应用。
背景技术
人黏附分子CD146最早被发现于黑色素瘤细胞上，是由646个氨基酸组成的单次跨膜糖蛋白，包含V-VC2-C2-C2免疫球蛋白样结构域，完整跨膜形式包括胞外区、跨膜区和胞质区。目前已发现,CD146存在膜型和可溶性两种形式.膜型CD146分子广泛分布在血管内皮细胞和平滑肌细胞,以及部分活化的淋巴细胞等,参与血管的发生发展、细胞的黏附迁移、免疫应答以及间充质干细胞分化等。除此之外,CD146已被报道在黑色素瘤、血管肉瘤、肝癌等多种肿瘤细胞和几乎所有的实体瘤的肿瘤血管内皮细胞上高表达,并且与癌症的发展进程存在密切关系。可溶性CD146最早发现于1998年，与膜型CD146相比,可溶性CD146缺少胞内区和跨膜区,以游离的形式存在于血清及多种体液中.对可溶性CD146的功能研究表明,其部分生物学功能与膜型CD146类似,如参与病理性血管生成和参与炎症反应等,而深入研究表明,可溶性CD146在人类的病理过程中还发挥着某些与膜型CD146不同的生物学功能，多项研究表明,可溶性CD146 在多种疾病病人的血清中显著升高或降低,可溶性CD146与疾病的关系详见表1。尽管如此，尚未见CD146与哮喘之间关系的报道。
表1
Figure RE-GDA0002453848170000021
发明内容
本发明的目的是提供CD146作为检测靶点在制备哮喘血清检测试剂中的应用。
本发明的另一目的是提供CD146作为治疗靶点在筛选治疗哮喘的药物中的应用。
CD146作为治疗靶点在筛选治疗哮喘的药物中的应用。
所述的应用，优选CD146作为治疗靶点在筛选治疗气道重塑的药物中的应用。
抑制CD146表达的物质或拮抗CD146的物质在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用；优选在制备哮喘气道重塑的药物中的应用。
所述的拮抗CD146的物质优选CD146的抗体。
CD146作为检测靶点在制备哮喘血清辅助诊断试剂中的应用。
检测CD146表达量的试剂在制备哮喘血清辅助诊断试剂中的应用。
有益效果：
本发明公开了检测支气管患者血浆患者的CD146的应用，首次发现CD146在哮喘以及正常人血清中的表达差异，该指标可作为支气管哮喘的血清分子标志物。血浆是比较容易获得的，属于无创性检查，可辅助哮喘的早期诊断。因此，检测CD146表达量的试剂可以应用于制备支气管哮喘诊断试剂。
本发明通过HDM(House dust mite，屋尘螨)刺激MLE-12细胞后CD146表达增高，发生 EMT过程，TGF-β和SMAD3磷酸化水平升高。MLE-12细胞过表达CD146后，同样发生EMT过程。表明HDM通过CD146促进EMT过程，加重哮喘气道重塑。哮喘小鼠肺部CD146表达增高， E-cadherin(上皮细胞钙连蛋白)表达减少，通过Elisa检查发现Collagen I(I型胶原蛋白)表达增高，进一步表明HDM通过CD146加重哮喘气道重塑。因此，可以将CD146作为治疗靶点用于筛选治疗支气管哮喘中的应用。针对CD146的抗体也可以作为支气管哮喘的一种治疗策略。
附图说明
图1哮喘患者和正常人的血浆CD146表达水平
(A)哮喘患者和正常人的血浆CD146表达水平
(B)对所有哮喘患者和正常人的血浆CD146进行ROC曲线分析
图2 HDM通过IL-33/ST2诱导支气管肺泡上皮细胞CD146表达增加
(A)qPCR检测用HDM刺激MLE-12细胞后CD146的表达变化
(B)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后CD146的表达变化及其统计学分析
(C)免疫荧光检测原代肺泡上皮细胞上SPD表达情况
(D)Western blot检测用HDM刺激原代肺泡上皮细胞后CD146的表达变化
(E)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后IL-33的表达变化及其统计学分析
(F)Western blot检测用IL-33刺激MLE-12细胞后CD146的表达变化及其统计学分析
图3 HDM通过p65信号通路诱导支气管肺泡上皮细胞CD146表达增加
(A)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后MyD88信号通路的表达变化及其统计学分析
(B)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后p65信号通路的表达变化及其统计学分析
(C)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后p38、JNK、p44/42信号通路的表达变化及其统计学分析
(D)Western blot检测使用p65抑制剂(BAY)后CD146的表达变化及其统计学分析
(E)Western blot检测使用p38抑制剂后CD146的表达变化及其统计学分析
IL-33通过上皮细胞ST2受体激活一系列的下游信号通路,包括MyD88、NF-κB和MAPK通路。
图4 HDM通过CD146促进EMT变化
(A)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后E-cadherin(上皮细胞钙连蛋白)和 N-cadherin(神经钙粘素)的表达变化及其统计学分析
(B)免疫荧光检测HDM刺激MLE-12细胞后E-cadherin的表达变化
(C)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后fibronectin(纤维连接蛋白)和α–SMA (α–平滑肌动蛋白)的表达变化及其统计学分析
(D)Western blot检测用过表达CD146后的EMT变化及其统计学分析
(E)Western blot检测用抑制CD146表达后的EMT变化及其统计学分析
(F)Western blot检测ST2中和抗体使用后E-cadherin的表达变化变化及其统计学分析
图5 CD146通过TGF-β/Smad3号通路诱导支气管肺泡上皮细胞EMT过程
(A)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后TGF-β信号通路的表达变化及其统计学分析
(B)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后Stat3信号通路的表达变化及其统计学分析
(C)Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后Smad3信号通路的表达变化及其统计学分析
(D)Western blot检测使用Smad3抑制剂(SIS3)后E-cadherin的表达变化
图6小鼠慢性哮喘模型图示
图7体内实验证明HDM通过CD146诱导哮喘的EMT过程
(A)通过肺功能仪检测小鼠气道阻力(对照组，哮喘组；WT型：野生型小鼠，CD146KO型： CD146敲除型小鼠)
(B)H&E染色检测小鼠气道炎症反应
(C)Elisa检测小鼠血清中IgE水平
(D)Elisa检测小鼠肺组织研磨上清中各细胞因子水平
(E)Elisa检测小鼠肺组织研磨上清中Collagen I(I型胶原蛋白)水平
(F)PAS染色检测小鼠糖原沉积情况
(G)Sirius Red染色检测小鼠胶原沉积情况
(H)Western blot检测小鼠肺部E-cadherin的表达水平及其统计学分析
(I)免疫组化检测小鼠肺部E-cadherin的表达水平
具体实施方式
以下实施例中的数据均采用GraphPad Prism 5(La Jolla,CA)行统计分析，数据以SEM平均值表示。用ImageJ分析来自western blot或免疫荧光结果。采用t检验或单因素方差分析 (one-way ANOVA)评估其统计学意义。P<0.05为差异有统计学意义(*，P<0.05；**,P<0.01；* **,P<0.001；#,P>0.1)。
实施例1检测哮喘患者和正常人的血浆CD146表达水平
主要试剂：人CD146(Melanoma Cell Adhesion Molecule)ELISA盒子ElabscienceE-EL-H2403c
主要仪器：酶标仪，离心机
主要方法：28例哮喘患者的外周血标本来自于江苏省人民医院和泰州市人民医院，30例健康人的标本来自于江苏省血液中心。外周血收集后放入抗凝管，1000rpm离心收集上层血浆，-80℃保存。运用酶联免疫吸附实验检测人血浆中CD146的表达。
采用双抗体夹心ELISA法检测CD146。用抗人CD146抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人CD146会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人MCAM抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人CD146抗体与结合在包被抗体上的人CD146结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值， CD146浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中CD146的浓度。结果如图 1A所示，与健康对照组相比，哮喘患者可溶性CD146明显增加。对所有哮喘患者和正常人的血浆CD146进行ROC曲线分析,曲线下面积为0.8095,95％可信区间为0.6936-0.9254，大于0.5 具有诊断学意义。因此，CD146可作为检测靶标,其检测试剂可用于制备哮喘血清辅助诊断试剂。并且我们据此推测CD146可能在哮喘中起重要作用。
实施例2 HDM通过IL-33/ST2诱导支气管肺泡上皮细胞CD146表达增加
2.1实时定量pCR检测HDM刺激下MLE-12的CD146表达情况
主要方法：
HDM溶于PBS中，浓度为10mg/ml，-80度保存。0、10、100μg/ml HDM刺激MLE-12 0、6、12、24小时后用trizol或者small RNA提取HDM刺激下MLE-12细胞的总RNA，取等量RNA 反转录后得到cDNA，用相应体积的RNase free水稀释后，SYBR Green方法进行荧光定量PCR 检测CD146表达情况，每个样品3个复孔。不同转录因子以及细胞因子的表达量采用β-actin作为内参标准的ΔΔCT值做统计。引物如下：CD146 forward,5’-GGACCTTGAGTTTGAGTGG -3’(SEQ ID NO.1)；CD146 reverse,5’-CAGTGGTTTGGCTGGAGT-3’(SEQ ID NO.2)；β-actinforward,5’-GAGAAGCTGTGCTATGTTGCT-3’(SEQ ID NO.3)；β-actin reverse, 5’-CTCCAGGGAGGAAGAGGATG-3’(SEQ ID NO.4)。结果见图2A。
2.2 Western Blotting检测HDM刺激下MLE-12的CD146表达情况
主要方法：HDM刺激MLE-12的方法：100μg/ml HDM刺激MLE-12 0、3、6、12、24小时后Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-CD146 antibody(abcam，ab75769)，anti-beta-actin antibody(Cell Signaling Technology,#4970)
主要仪器：电泳仪，转膜槽
2.2.1提取细胞蛋白
2.2.2测定样本蛋白浓度
2.2.3Western blot检测HDM刺激下MLE-12的CD146表达情况
(1)清洗玻璃板，烘干后将玻璃板对齐后放入夹中夹紧，垂直卡在架子上；
(2)制分离胶：按下述的配方配制10％分离胶，加到两层玻璃板中，待胶面至绿带中间高度即可(梳齿下1.0cm处)，然后胶上加水或无水乙醇，室温静置40min以上直到凝胶形成；
(3)当水面和胶之间有一条折线时，可弃去上层液体，用滤纸将水吸干；
(4)制浓缩胶：按配方配制5％浓缩胶溶液，在分离胶上层加入浓缩胶溶液至玻璃板顶端，然后将梳子插入浓缩胶中，注意插梳子时要保持水平，避免气泡产生，室温静置30min直至凝胶形成；
(5)待浓缩胶凝固后，取下玻璃板，将其放入电泳槽中，槽内外侧都加入电泳液，并拔下梳子；
(6)电泳：将上述样品及Marker分别加入样品孔内，接入电极，开始电泳，开始使用恒压 80v，待Marker分开后调至恒压120v；
(7)电泳结束后取下玻璃板，在流水下轻轻撬开玻璃板，按所需分子量切割分离胶并将需要的分离胶从玻璃板上分离下来放置转膜液中；
(8)转膜：用剪刀裁剪与胶相同大小的PVDF膜，将其放置甲醇中浸泡30s，然后将其放入转膜液中，先将转膜夹打开，在白色的一面依次放转膜液浸泡的海绵、厚滤纸、PVDF膜、胶、厚滤纸、海绵。在此过程中PVDF膜和胶之间避免气泡产生。然后将转膜夹放置转膜槽中，加上转膜液，置于冰上并于恒流法(300mA)转膜(20+分子量)min；
(9)封闭：待转膜结束将PVDF膜浸在5％脱脂牛奶中，室温摇床封闭1h；
(10)根据目的蛋白分子量的大小裁剪PVDF膜，并做上标记；
(11)一抗：将上述条带按分子量分别放入中兔源一抗液YM-1中(1：1000)中4℃摇床过夜；
(12)TBST洗3次，每次5min；
(13)二抗：将条带放入HRP标记的羊抗兔(1:5000-10000),室温摇床2h；
(14)操作同12；
(15)曝光：按1:1现配曝光液A液和B液，并用凝胶成像系统；
(16)灰度值分析：将胶片进行拍照，用凝胶图像处理系统分析目的条带及β-actin的灰度值，结果见图2B。
2.3免疫荧光检测原代上皮细胞SPD
主要方法：细胞接种到Glass-bottom–dish，2％多聚甲醛固定，5％goat serum封闭，加入一抗4度过夜后，加入二抗。
主要试剂：Glass-bottom–dish，2％多聚甲醛，5％goat serum，DAPI，anti-SPDantibody (abcam，ab220422),Alexa Fluor 647donkey anti-rabbit IgG(H+L)
主要仪器：倒置荧光显微镜/共聚焦显微镜观察
2.3.1原代肺泡上皮细胞的培养
(1)小鼠麻醉，眼球摘除取血，分离血清
(2)从腹部切口，打开腹膜到胸腔，剪断双侧颈动脉和肾动脉，右心房心室PBS灌注除去血液
(3)暴露气管套管插入气管固定，用2ml注射器打入2ml消化酶(0.1％胶原酶+0.25％胰酶， 1:1)，使肺叶能够充分扩张，换1ml注射器逐渐灌入0.5ml 45度的液化琼脂糖。
(4)保持注射器在插管上防止液体回漏，立即将冰和无菌纸巾(纱布)盖在肺上2分钟，让琼脂糖凝胶。
(5)拿掉纸巾冰块注射器和套管，取下肺部，心脏和胸腺。在培养皿中用PBS冲洗肺。去除心脏和胸腺及残余的气管
(6)将肺放入2ml的消化酶中(50ml离心管中)，37度振荡孵育20min
(7)将肺叶转移到10cm培养皿中,加入7ml DMEM以及10ul DNaseI(储存液浓度5000U/ml), 用镊子将肺叶撕碎，将肺叶及液体转移到新的50ml离心管中，在37度振荡摇床上摇晃 10min
(8)用100um的细胞筛后过70um，40um的细胞筛。仔细用DMEM冲洗每个网眼和管子器皿来减少细胞损失。
(9)将液体收集到离心管内4度160g离心15min，去除上清。用2ml红细胞裂解液)重悬细胞后迅速用DMEM 13ml终止。将液体转移到15ml离心管中2000rpm 4度离心5min。
(10)IgG包被培养皿的制备：10mg小鼠IgG，加入到20ml无菌PBS，充分溶解后过滤(0.45um滤器)，分装，每管1ml，保存在-20度。每次使用1管，滴加在直径10cm的培养皿中，晃动平皿使得IgG溶液可以铺满平皿底部。将多余的IgG溶液转移到第2 个10cm平皿中，同上使得IgG溶液可以铺满平皿底部；依次类推准备第3个平皿。在 37℃温箱中孵育3h，倒去IgG溶液，无菌PBS漂洗2次，再用无血清的DMEM培养基冲洗1次后待用。
(11)将8～10ml细胞悬液加入1号培养皿中，在37℃、5％CO2条件下培养30分钟，轻轻吹打吸取未贴壁细胞转移到2号培养皿，孵育30分钟；轻轻吹打，吸取悬浮细胞到3号培养皿；30分钟后，轻轻吹打，吸取悬浮细胞，2000rpm离心5min，弃上清液。
(12)用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数后以1.0×106/ml的细胞数接种至 6孔板中，每孔2ml。【如果细胞数量不够，可以考虑接种到24孔板中，每孔5*105个细胞/1ml 即可)
2.3.2免疫荧光检测原代上皮细胞上的SPD
(1)将原代肺泡上皮细胞接种到Glass-bottom–dish，每小皿接种密度为0.5-1*10^6，共2皿。(加入2ml培养基)，待长成细胞单层后，弃掉培养基，PBS冲洗两遍。
(2)固定：2％多聚甲醛(4度预冷)固定15min。PBS轻柔漂洗3次(PBS沿着培养皿的玻璃底室的边缘加进去)。
(3)封闭：在培养皿的玻璃底室中加入200ul 5％goat serum,37度湿盒中避光孵育30分钟。PBS轻柔漂洗3次(PBS沿着培养皿的玻璃底室的边缘加进去)。
(4)一抗孵育：在培养皿的玻璃底室覆盖200ul稀释一抗(无菌PBS稀释)，另一个不加入一抗，4度湿盒中避光孵育过夜。PBS轻柔漂洗3次(PBS沿着培养皿的玻璃底室的边缘加进去)。
(5)二抗孵育：在培养皿的玻璃底室覆盖200ul稀释二抗(无菌PBS稀释)，37度湿盒避光孵育60分钟。PBS轻柔漂洗3次(PBS沿着培养皿的玻璃底室的边缘加进去)。
(6)DAPI染细胞核及封片：在培养皿的玻璃底室覆盖10ul DAPI溶液(含预防荧光淬灭剂)， 37度湿盒避光孵育30分钟。
(7)倒置荧光显微镜/共聚焦显微镜观察，结果见图2C。
2.4 Western Blotting检测原代肺泡上皮细胞HDM刺激下CD146表达情况主要方法：100μg/ml HDM刺激MLE-12 0、6、12、24小时后Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-CD146 antibody(abcam，ab75769)，anti-beta-actin antibody(Cell Signaling Technology,#4970)
主要仪器：电泳仪，转膜槽
步骤同前，结果见图2D。
2.5 Western Blotting检测HDM刺激下MLE-12的IL-33表达情况
主要方法：Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-IL-33antibody(abcam，ab54385)，anti-beta-actin antibody(Cell Signaling Technology,#4970)
主要仪器：电泳仪，转膜槽
步骤同前，结果见图2E。
2.6 Western Blotting检测IL-33刺激下MLE-12的CD146表达情况
主要方法：0、0.1、1、10、100ng/ml IL-33刺激MLE-12 24小时后Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-CD146 antibody(abcam，ab75769)，anti-beta-actin antibody(Cell Signaling Technology,#4970)
主要仪器：电泳仪，转膜槽
步骤同前，结果见图2F.
2.7 Western Blotting检测HDM刺激下和ST2中和抗体阻断下MLE-12的CD146表达情况主要方法：ST2中和抗体加入1小时后加入HDM5μM刺激24小时。Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-CD146 antibody(abcam，ab75769)，anti-beta-actin antibody(Cell Signaling Technology,#4970)
主要仪器：电泳仪，转膜槽
步骤同前。
HDM提取物吸入呼吸道后可直接刺激肺泡上皮细胞。如图2A所示，HDM提取物增加了小鼠肺泡上皮细胞MLE-12的CD146的RNA表达，这在免疫印迹实验中得到进一步验证(图2B)。提取原代肺泡上皮细胞，证明其SPD表达阳性(图2C)。同样，HDM提取物增加了原代肺泡上皮细胞的CD146的表达(图2D)。HDM提取物增加了肺泡上皮细胞中IL-33的表达，这与既往研究表明哮喘患者IL-33表达增加一致(图2E)。有趣的是IL-33直接促进CD146表达(图2F)，该结果被ST2中和抗体抑制。综上所述，HDM提取物增加了肺泡上皮细胞中CD146的表达，这一结果是通过IL-33及其受体ST2介导的。
实施例3 HDM通过p65信号通路诱导支气管肺泡上皮细胞CD146表达增加
3.1 Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后MyD88、p65、p38、JNK、p44/42信号通路的表达变化
主要方法：HDM刺激MLE-12的方法同上。Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-beta-actin antibody(CellSignaling Technology,#4970)，anti-MyD88 antibody(Cell Signaling Technology,#4283)，anti-p65 antibody(Cell Signaling Technology,#8242)，anti-p65(phospho-Ser536)antibody(Cell Signaling Technology,#3033)，anti-p38(Cell SignalingTechnology,#8690),anti-P38 (phospho-Thr180/Tyr182)antibody(Cell SignalingTechnology,#4511),anti-JNK(Cell Signaling Technology,#9252),anti-JNK(phospho-Thr183/Tyr185)antibody(Cell Signaling Technology,#4668),anti-p44/42(CellSignaling Technology,#4695), anti-P44/42(phospho-Thr202/Tyr204))antibody(CellSignaling Technology,#4370), 主要仪器：电泳仪，转膜槽
步骤同前，，结果见图3A-C。
3.2 Western blot检测使用p65抑制剂(BAY)、p38抑制剂后MLE-12上CD146的表达变化主要方法：p65抑制剂(BAY)、p38抑制剂加入1小时后加入HDM刺激24小时。LysisBuffer 裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-beta-actin antibody(CellSignaling Technology,#4970)，anti-CD146 antibody(abcam，ab75769)
步骤同前，结果见图3D-E。
由图3可见，IL-33通过上皮细胞ST2受体激活一系列的下游信号通路,包括MyD88、NF-κB 和MAPK通路。如图3A所示，HDM提取物激活了MLE-12细胞中的MyD88。同样,HDM提取增加了磷酸化NF-κB(p65)(图3B)。在MAPK信号通路中，HDM提取物处理的MLE-12细胞中， p38而非JNK和p42被激活(图3C)。更重要的是,p65抑制剂引起HDM提取物诱导的CD146表达的下调(图3D),强调的重要性NF-κB在促进CD146的表达中的作用。与p65抑制剂相比， p38抑制剂对HDM提取物处理的MLE-12细胞中CD146的表达有微弱的影响(图3E)。因此,肺泡上皮细胞治疗CD146 HDM提取可能受NF-κB(p65)。
实施例4 HDM通过CD146促进EMT变化
4.1 Western Blotting检测HDM刺激下MLE-12的EMT变化情况
主要方法：Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-E-cadherin antibody(abcam，ab76055)， anti-N-cadherin antibody(abcam，ab 76011)，anti-α-SMA antibody(abcam，ab7817)， anti-fibronectin antibody(Proteintech,15613-1-AP)
主要仪器：电泳仪，转膜槽
步骤同前，结果见图4A和图4C。
4.2免疫荧光检测HDM刺激下MLE-12的E-cadherin表达情况
主要方法：细胞接种到Glass-bottom–dish，2％多聚甲醛固定，5％goat serum封闭，加入一抗4度过夜后，加入二抗。
主要试剂：Glass-bottom–dish，2％多聚甲醛，5％goat serum，DAPI，anti-E-casherin antibody(abcam，ab76055),Alexa Fluor 555donkey anti-mouse IgG(H+L)
主要仪器：倒置荧光显微镜/共聚焦显微镜观察
步骤同前，结果见图4B。
4.3 Western blot检测用CD146过表达或抑制后的E-cadherin表达情况
4.3.1 CD146过表达或抑制
主要方法：细胞接种到六孔板后，换成不含双抗的培养基，过夜后用脂质体将CD146过表达或沉默质粒转入细胞中。
主要试剂：脂质体(翊圣)，无血清细胞培养基主要仪器：细胞培养箱，
步骤：
(1)MLE-12接种到六孔板中，贴壁后换成不含双抗的培养基
(2)过夜后，取过表达质粒或沉默质粒或空质粒(每孔2微克)，脂质体每孔4-6微升，在无血清细胞培养基中混合25min，加入到细胞中，转染48h
(3)有需要的话，在转染前24h加入HDM或PBS
(4)提取细胞蛋白步骤同前
(5)Western blot步骤同前
结果见图4D和图4E。
本实施例在用HDM提取物处理的MLE-12细胞中诱导了EMT过程。HDM提取物降低了E-cadherin 的表达，增加了N-cadherin的表达(图4A-B)。此外,HDM提取增加MLE-12细胞的纤连蛋白和α-SMA表达(图4C),这表明HDM诱导了肺泡上皮细胞的EMT过程。为了探讨CD146在HDM诱导的EMT中的作用，MLE-12细胞中的CD146通过表达质粒过表达(图4D)，也可以通过siRNA 质粒沉默(图4E)。E-cadherin表达与CD146呈负相关，提示CD146可能对肺泡上皮细胞EMT 具有正向调节作用。除了HDM提取物增加肺泡上皮细胞的IL-33和阻断CD146表达的ST2中和抗体外，ST2中和抗体也减轻了EMT过程。用HDM提取物和ST中和抗体处理的MLE-12细胞中的E-cadherin表达得到增加(图4F)。综上所述，HDM提取物通过IL-33和CD146促进肺泡上皮细胞的EMT过程。
实施例5 CD146通过TGF-β/Smad3号通路诱导支气管肺泡上皮细胞EMT过程
5.1 Western blot检测用HDM刺激MLE-12细胞后TGF-β、STAT3、SMAD3信号通路的表达变化
主要方法：Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-beta-actin antibody(CellSignaling Technology,#4970)，anti-TGF-βantibody(Abcam,ab170874),anti-STAT3antibody (Cell Signaling Technology,#4904)，anti-STAT3(phospho-Tyr705)antibody(Cell Signaling Technology,#9145)，anti-SMAD3 antibody(Cell SignalingTechnology,#9523)， anti-SMAD3(phospho-Ser423/425)antibody(Cell SignalingTechnology,#9520)
主要仪器：电泳仪，转膜槽
步骤同前，结果见图5A-C。
5.2 Western blot检测使用SMAD3抑制剂(SIS3)后MLE-12上E-cadherin的表达变化主要方法：SMAD3抑制剂(SIS3)加入1小时后加入HDM刺激24小时。Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-beta-actin antibody(CellSignaling Technology,#4970)，anti-E-casherin antibody(abcam，ab76055)
步骤同前，结果见图5D
HMD提取物通过TGF-β诱导肺泡上皮细胞的EMT过程(图5)。STAT3和SMAD3是TGF-β的下游分子信号通路，可能诱导EMT过程。HDM提取物对STAT3的激活作用最小(图5B)，但导致肺泡上皮细胞中SMAD3的磷酸化(图5C)。更重要的是,SMAD3抑制剂(SIS3)可以部分地但显著地增加HDM提取物减少的E-cadherin(图5D),这表明TGF-β和SMAD3可能调节HDM提取物诱导的EMT过程。
实施例6体内实验证明HDM通过CD146诱导哮喘的EMT过程
小鼠慢性哮喘模型方法(图6)：将小鼠分为对照组和哮喘组(分别是WT型小鼠，CD146 KO型小鼠)，每周5天滴鼻给HDM，最后一次滴药2天后进行检测.
6.1小鼠气道高反应的检测
主要方法：本实验使用有创测量的方法测定BABL/c小鼠的气道高反应性，依据的参数是LR (lung resistance)。末次激发48h后，用戊巴比妥70mg/kg麻醉小鼠，切开颈部皮肤，行气管插管，然后将小鼠放入FinePointe RC system(Buxco Electronics,Troy,NY,USA)中实时检测气道阻力(cmH2O.m-1·S-1)。Mch(Methyl acetylcholine，甲基乙酰胆碱)激发前，先测量基础值，再依次给小鼠雾化不同剂量的MCh 3.125、6.25、12.5、25mg/mL激发气道高反应性，每个剂量间隔3min。结果见图7A。
6.2小鼠肺组织病理切片H&E染色
行支气管肺泡灌洗后，打开胸腔，右心房冲PBS，至肺变白。取右肺下叶组织，4％中性福尔马林固定过夜。取出肺叶，浸入无水乙醇脱水5分钟，二甲苯中透明化，石蜡包埋，进行H&E 染色，显微镜下观察H&E染色结果，见图7B。
6.3 ELISA检测小鼠肺组织中细胞因子及血清中IgE
运用ELISA法检测小鼠肺组织及血清中IgE水平(Biolegend，美国)，同样方法检测BALF中 IL-4、IL-5、IFN-γ(Biolegend，美国)、IL-13水平(peprotech公司，美国)，各步操作均按照说明书进行，结果见图7C～E。
6.4小鼠肺组织病理切片PAS染色
行支气管肺泡灌洗后，打开胸腔，右心房冲PBS，至肺变白。取右肺下叶组织，4％中性福尔马林固定过夜。取出肺叶，浸入无水乙醇脱水5分钟，二甲苯中透明化，石蜡包埋，进行PAS 染色，在显微镜下观察PAS染色结果，见图7F。
6.5小鼠肺组织病理切片Sirius Red染色
行支气管肺泡灌洗后，打开胸腔，右心房冲PBS，至肺变白。取右肺下叶组织，4％中性福尔马林固定过夜。取出肺叶，浸入无水乙醇脱水5分钟，二甲苯中透明化，石蜡包埋，进行Sirius Red染色，显微镜下观察染色结果，见图7G。
6.6 Western blot检测小鼠肺部E-cadherin的表达水平变化
主要方法：Lysis Buffer裂解细胞离心后提取蛋白，定量后进行Western blot。
主要试剂：Lysis Buffer，上样缓冲液,anti-E-cadherin antibody(abcam，ab76055)， anti-N-cadherin antibody(abcam，ab 76011)，anti-α-SMA antibody(abcam，ab7817)， anti-fibronectin antibody(Proteintech,15613-1-AP)
主要仪器：电泳仪，转膜槽
步骤同前，结果见图7H。
6.7免疫组化检测小鼠肺部E-cadherin的表达水平变化
行支气管肺泡灌洗后，打开胸腔，右心房冲PBS，至肺变白。取右肺下叶组织，4％中性福尔马林固定过夜。取出肺叶，浸入无水乙醇脱水5分钟，二甲苯中透明化，石蜡包埋，免疫组化检测小鼠肺部E-cadherin的表达水平变化，结果见图7I。
为了进一步证明CD146在哮喘EMT过程中的作用，本实施例构建了WT小鼠和CD146KO小鼠哮喘模型。如图7A所示，与HDM提取物处理的WT小鼠相比，CD146 KO小鼠的肺阻力降低。在 H&E和PAS染色的肺组织中，CD146 KO小鼠哮喘模型的炎症反应和糖原储存降低(图7B,7C)。HDM提取物处理小鼠血清总IgE明显升高；然而，HDM提取物对WT和CD146 KO小鼠的IgE浓度具有可比性(图7D)。肺细胞因子,包括IL-4、IL-5、IL 13和IFN-γ，CD146 KO小鼠相比 WT小鼠在HDM提取物作用后减少(图7E)。CD146调控肺泡上皮细胞的EMT过程，哮喘CD146KO小鼠胶原沉积减少，通过天狼星红染色(图7F)和胶原I定量(图7G)可见一斑。此外，CD146敲除导致哮喘模型中E-cadherin升高(图7H,7I)，提示CD146可能参与了哮喘EMT过程。
综上所述，HDM通过CD146加重哮喘气道重塑。因此，可以将CD146作为治疗靶点用于筛选治疗支气管哮喘中的应用。针对CD146的抗体也可以作为支气管哮喘的一种治疗策略。
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120> CD146作为治疗靶点在制备治疗哮喘气道重塑的药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaccttgag tttgagtgg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagtggtttg gctggagt 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagaagctgt gctatgttgc t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctccagggag gaagaggatg 20

Claims (7)

1.CD146作为治疗靶点在筛选治疗哮喘的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于CD146作为治疗靶点在筛选治疗气道重塑的药物中的应用。
3.抑制CD146表达的物质或拮抗CD146的物质在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于抑制CD146表达的物质或拮抗CD146的物质在制备哮喘气道重塑的药物中的应用。
5.根据权利要求4或3所述的应用，其特征在于所述的拮抗CD146的物质为CD146的抗体。
6.CD146作为检测靶点在制备哮喘血清辅助诊断试剂中的应用。
7.检测CD146表达量的试剂在制备哮喘血清辅助诊断试剂中的应用。
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ADELHEID KRATZER，等: "Endothelial cell adhesion molecule CD146: implications for its role in the pathogenesis of COPD", 《JOURNAL OF PATHOLOGY》 *

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