CN115997788A - 一种金属-有机硅复合纳米抗菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种金属‑有机硅复合纳米抗菌剂及其制备方法和应用。本发明提供的金属‑有机硅复合纳米抗菌剂的制备方法包括：a)将六水合硝酸锌、3‑氨丙基三乙氧基硅烷和水混合，得到混合液；b)在保护性气氛下，对所述混合液进行60Coγ‑射线辐照，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到锌‑有机硅纳米微球分散液；c)将所述锌‑有机硅纳米微球分散液与AgNO3水溶液混合，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到分散液；d)将步骤c)所得分散液与还原剂溶液混合反应，然后进行固液分离、洗涤和干燥，得到金属‑有机硅复合纳米抗菌剂。该抗菌剂对革兰氏阳性菌及阴性菌均具有优良抗菌效果。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌材料领域，特别涉及一种金属-有机硅复合纳米抗菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
细菌作为自然环境中常见的微生物，广泛存在于土壤、空气、水源等人类的生活领域，其中很多细菌对人类健康及生产生活的各个方面都会产生有害的影响(HonigsbaumM.The Lancet.2018,391,420)。在医药卫生领域，抗生素例如青霉素，链霉素等是一类常用的抗菌剂，但由于抗生素的滥用，某些致病细菌逐渐的对各种抗生素产生耐药性，导致因细菌感染而死亡的人数不断攀升，并出现“超级细菌”。因此细菌的耐药性被认为是本世纪最严重的全球公共威胁之一(Catalano A,Iacopetta D,Ceramella J,etal.Molecules.2022,27,616)。除生物体外，细菌对物品也会造成不可修复的损害，例如石质或纸质文物在保存过程中，附着在其表面或内部的细菌在生长过程会产生有机酸，杂多糖等物质，这些物质能通过酸蚀，菌斑覆盖，氧化变色等作用从而对文物等造成不同程度的损害，即生物劣化现象，给文物保护工作带来了严峻的挑战(Gaylarde C,LittleB.Science of The Total Environment.2022,823,159193)。传统的抗生素类药物和小分子有机抗菌剂(如乙醇)由于存在容易流失、耐药性等问题，难以用到像如文物保护等某些领域，因此非抗生素类抗菌剂的开发对于解决传统抗菌剂容易流失和耐药性问题至关重要。
人类很早就发现重金属离子及其化合物具有优良的广谱抗菌作用。研究表明，重金属离子(如Zn2+，Ag+等)能通过与细菌中蛋白质上的官能团络合，导致蛋白质失去活性。它们也能与DNA的碱基结合，破坏DNA的结构，从而影响细胞的正常代谢过程，阻碍细菌繁殖甚至使细胞凋亡(Zheng K Y,Setyawati M I,Letong D T,et al.Coordination ChemistryReviews.2018,357,1)。不仅如此，重金属离子的存在还会在细胞内引起氧化应激反应，产生活性氧(ROS)，从而杀死细菌(Liao S J,Zhang Y P,et al.International Journal ofNanomedicine.2019,14 1469)。重金属离子的这些抗菌作用机制与抗生素的不同，它不会使细菌产生耐药性，因而能够达到长期有效的抗菌效果。在所研究过的抗菌金属离子中，银离子的抗菌作用尤为显著(Demiric S,Ustaoglu Z,etal.Applied Biochemistry andBiotechnology.2014,172,1652)。但银离子易溶于水或者与环境中的有机物发生络合反应，所以单纯以银离子形式使用时易流失，抗菌效率低下。
纳米银是一种粒径在100nm以下的银单质粒子，具有表面效应，量子尺寸效应等，能够直接进入菌体，通过氧气分子氧化，水溶解等作用有效持续的在细菌体内释放银离子，破坏细菌的呼吸酶和DNA等，从而表现出高效的抗菌作用(Hahn A,Brandes G,etal.Journal of Controlled Release.2011,154,164)。因此近几年来，纳米银在生物抗菌领域的应用越来越多。但是银纳米粒子表面活性高，容易团聚，导致其在介质中的分散性差，抗菌性能下降。对纳米银进行表面修饰或将其负载到合适的载体上，可以有效避免银纳米粒子的团聚。但直接对纳米银进行表面修饰，纳米银表面的配体往往会阻隔纳米银与氧气分子的接触，从而减缓Ag+的释放速率和ROS的产生速率，导致抗菌性能的下降(Xue P,Shan Y X,et al.New Journal of Chemistry.2019,43,2870)。因此理论上，将纳米银进行负载可以在不减弱纳米银抗菌作用的前提下避免纳米银的团聚，并尽可能保留较多的活性表面。但是实际制备中，对载体的要求较高，除能够高效固定纳米银之外，还有许多其它方面的要求，否则容易影响产物的抗菌效果。因此，如何获得真正能够带来优异抗菌效果的抗菌剂面临较大技术挑战。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种金属-有机硅复合纳米抗菌剂及其制备方法和应用。本发明制备的金属-有机硅复合纳米抗菌剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优良的抗菌效果，而且制备方法简单、节能环保。
本发明提供了一种金属-有机硅复合纳米抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
a)将六水合硝酸锌、3-氨丙基三乙氧基硅烷和水混合，得到混合液；
b)在保护性气氛下，对所述混合液进行60Coγ-射线辐照，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到锌-有机硅纳米微球分散液；
c)将所述锌-有机硅纳米微球分散液与AgNO3水溶液混合，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到分散液；
d)将步骤c)所得分散液与还原剂溶液混合反应，然后进行固液分离、洗涤和干燥，得到金属-有机硅复合纳米抗菌剂。
优选的，步骤a)中，所述六水合硝酸锌∶3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1∶(9～15)。
优选的，步骤b)中，所述辐照的条件为：剂量率9～76Gy/min，辐照时间2～24h，总吸收剂量1～110kGy。
优选的，步骤c)中AgNO3水溶液中的AgNO3∶步骤a)中3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为(0.05～0.5)∶1。
优选的，步骤d)中，所述还原剂溶液为NaBH4水溶液。
优选的，步骤d)中，所述还原剂溶液中还原剂∶步骤c)中AgNO3水溶液中AgNO3的摩尔比为(2～5)∶1。
优选的，步骤a)中，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷∶水的体积比为1∶(25～50)。
优选的，步骤d)中，所述干燥为冷冻干燥。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的制备方法制得的金属-有机硅复合纳米抗菌剂。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的金属-有机硅复合纳米抗菌剂作为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的抗菌剂的应用。
本发明提供的制备方法，在室温下利用60Coγ-射线，辐照含有特定组成比例的APTES和硝酸锌的水溶液，得到粒径为50～200nm的锌/有机硅复合纳米微球，以此为载体，通过化学还原法原位负载6～15nm的银纳米粒子，从而得到一种高效的金属-有机硅复合纳米抗菌微球。本发明制得的金属-有机硅复合纳米抗菌微球对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优良的抗菌效果。所制备的抗菌微球也可以很好的分散在伤口敷料或者涂层中，因此，在医药抗菌、文物保护等领域具有潜在的应用。
试验结果表明，本发明提供的复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对铜绿假单胞菌的抑菌率是AgNO3的1.8倍以上，对铜绿假单胞菌的杀菌率是AgNO3的1.5倍以上；复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对枯草芽孢杆菌的抑菌率是AgNO3的1.03倍以上，对枯草芽孢杆菌的杀菌率是AgNO3的1.5倍以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1中锌-有机硅纳米微球载体(Zn/oSiNP)的TEM图；
图2为实施例1中锌-有机硅纳米微球载体(Zn/oSiNP)的红外光谱图；
图3为实施例1中锌-有机硅纳米微球载体(Zn/oSiNP)的X射线光电子能谱图；
图4为实施例1所得负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的TEM图；
图5为实施例1所得负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的XRD图；
图6为实施例1中有机硅载体(Zn/oSiNP)、复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和实心SiO2微球对铜绿假单胞菌的抗菌性测试效果图；
图7为实施例1中各试剂在不同质量浓度下对铜绿假单胞菌的抗菌效果测试图；其中，图7(a)为不同质量浓度有机硅载体(Zn/oSiNP)的抗菌效果测试图，图7(b)为不同质量浓度复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的抗菌效果测试图，图7(c)为不同质量浓度AgNO3水溶液的抗菌效果测试图；
图8为不同质量浓度复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的铜假绿单胞菌菌液在琼板上培养24h的细菌生长情况测试图；其中，图8a～8f分别为0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、600μg/mL时的效果图；
图9为不同质量浓度AgNO3的铜假绿单胞菌菌液在琼板上培养24h的细菌生长情况测试图；其中，图9a～9f分别为0μg/mL、6μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL时的效果图；
图10为实施例1中有机硅载体(Zn/oSiNP)、复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和实心SiO2微球对枯草芽孢杆菌的抗菌性测试效果图；
图11为实施例1中各试剂在不同质量浓度下对枯草芽孢杆菌的抗菌效果测试图；其中，图11(a)为不同质量浓度机硅载体(Zn/oSiNP)的抗菌效果测试图，图11(b)为不同质量浓度复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的抗菌效果测试图，图11(c)为不同质量浓度AgNO3水溶液的抗菌效果测试图；
图12为不同质量浓度复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的枯草芽孢杆菌菌液在琼板上培养24h的细菌生长情况测试图；其中，图12a～12d分别为0μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、600μg/mL时的效果图；
图13为不同质量浓度AgNO3的枯草芽孢杆菌菌液在琼板上培养24h的细菌生长情况测试图；其中，图13a～13e分别为浓度0μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL时的效果图；
图14为实施例2中锌-有机硅纳米微球载体(Zn/oSiNP)的TEM图；
图15为实施例2中所得负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的TEM图。
具体实施方式
本发明提供了一种金属-有机硅复合纳米抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
a)将六水合硝酸锌、3-氨丙基三乙氧基硅烷和水混合，得到混合液；
b)在保护性气氛下，对所述混合液进行60Coγ-射线辐照，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到锌-有机硅纳米微球分散液；
c)将所述锌-有机硅纳米微球分散液与AgNO3水溶液混合，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到分散液；
d)将步骤c)所得分散液与还原剂溶液混合反应，然后进行固液分离、洗涤和干燥，得到金属-有机硅复合纳米抗菌剂。
本发明提供的制备方法，在室温下利用60Coγ-射线，辐照含有特定组成比例的APTES和硝酸锌的水溶液，得到粒径为50～200nm的锌/有机硅复合纳米微球，以此为载体，通过化学还原法原位负载6～15nm的银纳米粒子，从而得到一种高效的金属-有机硅复合纳米抗菌微球。本发明制得的金属-有机硅复合纳米抗菌微球对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优良的抗菌效果。所制备的抗菌微球也可以很好的分散在伤口敷料或者涂层中，因此，在医药抗菌、文物保护等领域具有潜在的应用。
关于步骤a)：
a)将六水合硝酸锌、3-氨丙基三乙氧基硅烷和水混合，得到混合液。
本发明中，所述六水合硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的来源没有特殊限制，为市售商业品即可。本发明中，所述六水合硝酸锌∶3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比优选为1∶(9～15)，具体可为1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15。
本发明中，所述水优选为去离子水。本发明中，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷∶水的体积比优选为1∶(25～50)，具体可为1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50。
本发明中，将六水合硝酸锌、3-氨丙基三乙氧基硅烷和水进行混合的方式优选为：a1)将六水合硝酸锌溶于水中，得到溶解液；a2)向所述溶解液中逐滴滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷并混合均匀，得到混合液。其中，步骤a1)中，具体的，将六水合硝酸锌和水混合，搅拌至完全溶解，得到溶解液。步骤a2)中，向溶解液中滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷，在磁力搅拌条件下搅拌至混合液变为澄清透明，从而得到均匀混合液。
关于步骤b)：
b)在保护性气氛下，对所述混合液进行60Coγ-射线辐照，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到锌-有机硅纳米微球分散液。
本发明中，步骤b)中先形成保护性气氛条件，具体的，可通过以下方式实现：将步骤a)所得混合液置于样品瓶中，然后通入保护性气体并密封。本发明对提供保护气氛的保护性气体种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规保护性气体即可，如氮气或氩气等。
本发明中，在保护性气氛下，对所述混合液进行60Coγ-射线辐照，具体的，将装有混合液的样品瓶放入钴源室中，在60Coγ-射线辐射场中进行辐照。本发明中，所述辐照的条件优选为：剂量率9～76Gy/min，辐照时间2～24h，总吸收剂量1～110kGy。其中，所述剂量率具体可为9Gy/min、10Gy/min、15Gy/min、20Gy/min、25Gy/min、30Gy/min、35Gy/min、40Gy/min、45Gy/min、50Gy/min、55Gy/min、60Gy/min、65Gy/min、70Gy/min、75Gy/min、76Gy/min。所述辐照时间具体可为2h、4h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h。所述总吸收剂量具体可为1kGy、5kGy、10kGy、15kGy、20kGy、25kGy、30kGy、35kGy、40kGy、45kGy、50kGy、55kGy、60kGy、65kGy、70kGy、75kGy、80kGy、85kGy、90kGy、95kGy、100kGy、105kGy、110kGy。本发明中，上述辐照处理的温度条件没有特殊限制，在室温下进行即可，可为10～35℃，具体可为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。在辐照处理过程中，高能射线通过与水或3-氨丙基三乙氧基硅烷分子的相互作用，促进了被锌离子络合的3-氨丙基三乙氧基硅烷的水解缩合反应，从而在体系中形成锌-有机硅复合纳米微球(记为Zn/oSiNP)。
本发明中，经辐照处理后，得到的是含有锌-有机硅纳米微球的混合液，本发明对其进行固液分离和洗涤处理。其中，所述固液分离的方式优选为离心处理。所述离心处理的速率优选为8～12krpm，具体可为8krpm、9krpm、10krpm、11krpm、12krpm；所述离心处理的时间优选为5～10min，具体可为5min、6min、7min、8min、9min、10min。所述洗涤优选为水洗。经以上处理后，得到锌-有机硅复合纳米微球固体产物。本发明中，所述锌-有机硅纳米微球的粒度为50～200nm。
本发明中，经以上处理后，将所得固体产物分散于水中，从而得到锌-有机硅纳米微球分散液。其中，所述水优选为去离子水。步骤a)中3-氨丙基三乙氧基硅烷∶步骤b)中水的体积比优选为1∶(25～50)，具体可为1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50。经以上处理后，得到锌-有机硅纳米微球分散液。
现有技术中，制备有机硅纳米微球的方法基本都需要较高的温度或者添加乳化剂，且通常需要多步反应，增加了成本以及后续对乳化剂等杂质的处理，而本发明通过上述辐照法合成锌-有机硅纳米微球，在常温下进行即可，且无需乳化剂，而且一步辐照反应即可制得，而且得到的是尺寸、稳定性、骨架结构等适宜的纳米微球，能够在后续制备中与银达到较好的适配性，从而有利于提高抗菌效果。
关于步骤c)：
c)将所述锌-有机硅纳米微球分散液与AgNO3水溶液混合，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到分散液。
本发明中，所述AgNO3水溶液的浓度优选为0.01～0.08mol/L，具体可为0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L、0.08mol/L。本发明中，所述AgNO3水溶液中AgNO3∶步骤a)中3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比优选为(0.05～0.5)∶1，具体可为0.05∶1、0.10∶1、0.15∶1、0.20∶1、0.25∶1、0.30∶1、0.35∶1、0.40∶1、0.45∶1、0.50∶1。
本发明中，将锌-有机硅纳米微球分散液与AgNO3水溶液进行混合的方式优选为：向锌-有机硅纳米微球分散液中逐滴滴加AgNO3水溶液，在避光条件下进行搅拌混合。其中，所述搅拌的速率优选为200～500rpm，具体可为200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm。所述搅拌的时间优选为4～12h，具体可为4h、6h、8h、10h、12h。在上述混合过程中，银离子充分吸附到锌-有机硅纳米微球载体上。
本发明中，经上述混合处理后，进行固液分离和洗涤。其中，所述固液分离的方式优选为离心处理。所述洗涤优选为水洗，通过水洗去除未被吸附的银离子。经以上处理后，得到吸附银离子的锌-有机硅纳米微球固体产物。
本发明中，经以上处理后，将所得固体产物分散于水中，从而得到分散液。其中，所述水优选为去离子水。步骤a)中3-氨丙基三乙氧基硅烷∶步骤c)中水的体积比优选为1∶(50～75)，具体可为1∶50、1∶55、1∶60、1∶65、1∶70、1∶75。
关于步骤d)：
d)将步骤c)所得分散液与还原剂溶液混合反应，然后进行固液分离、洗涤和干燥，得到金属-有机硅复合纳米抗菌剂。
本发明中，所述还原剂溶液为还原剂的水溶液。其中，所述还原剂优选为NaBH4，即还原剂溶液为NaBH4水溶液。本发明中，所述还原剂溶液的浓度优选为0.04～0.2mol/L，具体可为0.04mol/L、0.08mol/L、0.12mol/L、0.16mol/L、0.2mol/L。本发明中，所述还原剂溶液中还原剂∶步骤c)中AgNO3水溶液中AgNO3的摩尔比优选为(2～5)∶1，具体可为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。
本发明中，将步骤c)所得分散液与还原剂溶液进行混合的方式优选为：向步骤c)所得分散液中逐滴滴加还原剂溶液。所述混合及反应的温度优选为-2～4℃，具体可在冰水浴中进行。本发明中，滴加完后继续反应的时间优选为15～40min，具体可为15min、20min、25min、30min、35min、40min。在上述反应过程中，锌-有机硅纳米微球上吸附的银离子还原成银纳米粒子，从而使银纳米粒子成功负载到锌-有机硅纳米微球上。
本发明中，经上述反应后，得到的是含有上述复合纳米微球的反应液，本发明对其进行固液分离、洗涤和干燥。其中，所述固液分离的方式优选为离心处理。所述洗涤优选为水洗，通过水洗去除多余的还原剂。所述干燥优选为冷冻干燥。经以上处理后，得到负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(记为Zn/oSiNP@Ag)，即金属-有机硅复合纳米抗菌剂，其中，整体复合微球的粒度为50～200nm，负载的银纳米粒子的粒径为6～15nm。在本发明的一些实施例中，锌-有机硅纳米微球载体的粒度为70～120nm，负载的银纳米粒子的粒径为8～12nm。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的制备方法制得的金属-有机硅复合纳米抗菌剂。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的金属-有机硅复合纳米抗菌剂作为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的抗菌剂的应用。其中，所述革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌等；所述革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌等。
本发明提供的制备方法，在室温下利用60Coγ-射线，辐照含有特定组成比例的APTES和硝酸锌的水溶液，得到粒径为50～200nm的锌/有机硅复合纳米微球，以此为载体，通过化学还原法原位负载6～15nm的银纳米粒子，从而得到一种高效的金属-有机硅复合纳米抗菌微球。本发明制得的金属-有机硅复合纳米抗菌微球对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优良的抗菌效果。所制备的抗菌微球也可以很好的分散在伤口敷料或者涂层中，因此，在医药抗菌、文物保护等领域具有潜在的应用。
试验结果表明，本发明提供的复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对铜绿假单胞菌的抑菌率是AgNO3的1.8倍以上，对铜绿假单胞菌的杀菌率是AgNO3的1.5倍以上；复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对枯草芽孢杆菌的抑菌率是AgNO3的1.03倍以上，对枯草芽孢杆菌的杀菌率是AgNO3的1.5倍以上。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
1、制备抗菌剂微球
1.1、制备Zn/oSiNP微球载体
a)称取30mg六水合硝酸锌溶于10mL去离子水中，搅拌至完全溶解，得到溶解液。随后，吸取200μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(六水合硝酸锌∶3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比优选为1∶9)，逐滴滴加入上述溶解液中，磁力搅拌至变为澄清透明，得到混合液。
b)将上述混合液置于样品瓶中，通入氮气后密封，然后将样品瓶放入钴源室中，室温下在60Coγ-射线辐射场中进行辐照，条件为：剂量率76Gy/min，辐照时间24h，总吸收剂量109.44kGy。经辐照处理后，得到含有锌-有机硅纳米微球的混合液。然后，在离心机中进行离心分离(离心速率10krpm，离心时间5min)，用去离子水洗涤二次后，分散于10mL去离子水中，得到锌-有机硅纳米微球分散液。
表征：
锌-有机硅纳米微球(Zn/oSiNP)的形貌用透射电子显微镜(TEM，Hitachi H7650，100kV)表征，如图1所示，图1为实施例1中锌-有机硅纳米微球载体(Zn/oSiNP)的TEM图，可以看出，所得微球载体为粒径70～120nm的球状粒子。锌-有机硅纳米微球(Zn/oSiNP)的红外光谱(FTIR，Bruker TENSORII)如图2所示，1008cm-1附近强而宽的吸收峰是Si-O-Si反对称伸缩振动峰，755cm-1处的吸收峰为Si-C伸缩振动产生的，-NH2的面内弯曲振动峰在1600cm-1。锌-有机硅纳米微球(Zn/oSiNP)的X射线光电子能谱(XPS，ESCALAB 250Xi)如图3所示，表明Zn2+是以与氨基络合的形式存在的。
1.2、制备Zn/oSiNP@Ag微球
c)向步骤b)所得锌-有机硅纳米微球分散液中逐滴滴加AgNO3水溶液(浓度0.04mol/L，共5mL，即AgNO3∶步骤a)中3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为0.25∶1)，在避光条件下于400rpm磁力搅拌8h，然后进行离心分离、用去离子水洗涤三次，然后将所得固体产物分散于15mL去离子水中，得到分散液。
d)向分散液中逐滴滴加NaBH4水溶液(浓度0.2mol/L，共5mL，即NaBH4∶步骤c)中AgNO3水溶液中AgNO3的摩尔比为5∶1)，滴加完后继续在冰水浴中反应30min。然后，将所得反应液进行离心分离、去离子水洗和冷冻干燥，得到棕色固体产物，即负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)。
表征：
所得负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的透射电子显微镜(TEM，Hitachi H7650，100kV)和X射线衍射谱图(XRD，SmartLab)分别如图4-5所示，图4为实施例1所得负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的TEM图，图5为实施例1所得负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的XRD图，其中分别展示了Ag、步骤b)中锌-有机硅纳米微球(Zn/oSiNP)、步骤d)所得负载银纳米粒子的锌-有机硅纳米复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的XRD谱，可以看出，银纳米粒子成功负载到载体上，且银纳米粒子的粒径为8～12nm。Zn/oSiNP@Ag复合纳米微球的电感耦合等离子发射光谱(ICP，Optima7300DV)的结果表明复合纳米微球中银纳米粒子的负载率L(Ag)，即银纳米粒子质量占复合纳米微球载体的质量的百分比，为1.86％。
2、抗菌性测试(革兰氏阴性菌——铜绿假单胞菌)
2.1、不同试剂的抗菌性
分别将有机硅载体(Zn/oSiNP)、复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)、实心SiO2微球(通过法用TEOS自制，粒径120nm)与LB培养基混合均匀，加入500μL的108CFU/mL的铜绿假单胞菌菌液，使初始菌液浓度为106CFU/mL，然后在30℃下共同培养24h，通过记录不同时间处的菌液在600nm波长处的吸光度(OD600)来测试三者的抗铜绿假单胞菌的效果，并分别设置只接种细菌(未添加抗菌剂)阴性对照组和不接种细菌的阳性对照组。结果参见图6，图6为实施例1中有机硅载体(Zn/oSiNP)、复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和实心SiO2微球对铜绿假单胞菌的抗菌性测试效果图。可以看出，与实心SiO2微球组相比，有机硅载体(Zn/oSiNP)组具有一定抗菌性，而复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)具有显著的抗菌性，明显提高抗菌效果。
2.2、不同试剂抑菌率的比较
分别将不同浓度有机硅载体(Zn/oSiNP)、复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)、AgNO3水溶液，分别与LB培养基混合均匀，加入500μL的108CFU/mL铜绿假单胞菌菌液，使初始菌液浓度为106CFU/mL，然后在30℃下共同培养24h，记录不同时间处菌液的OD600值，结果如图7所示，图7为实施例1中各试剂在不同质量浓度下对铜绿假单胞菌的抗菌效果测试图，其中，图7(a)为不同质量浓度有机硅载体(Zn/oSiNP)的抗菌效果测试图，图7(b)为不同质量浓度复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的抗菌效果测试图，图7(c)为不同质量浓度AgNO3水溶液的抗菌效果测试图，各图体现出了OD600值随时间变化关系。由图7(b)和图7(c)可知，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和AgNO3的抗铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度MIC(Zn/oSiNP@Ag)和MIC(AgNO3)分别为100μg/mL和6μg/mL。由图7(a)和图7(b)的对比可以看出，有机硅载体(Zn/oSiNP)的抗菌效果相对Ag+可以忽略，因此，根据公式MIC(Ag)＝MIC(抗菌剂)×L(Ag)，可以得到，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和AgNO3的中Ag对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度MIC分别为1.86μg/mL和3.81μg/mL，因此，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对铜绿假单胞菌的抑菌率是AgNO3的2.05倍。
2.3、培养一定时间后的杀菌率测试
在LB培养基培养24h后，将OD600值基本不发生变化的菌液转移至固体培养基上继续培养24h，进行抗铜绿假单胞菌的最小杀菌浓度MBC的表征，结果如图8-9所示，图8为不同质量浓度复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的铜假绿单胞菌菌液在琼板上培养24h的细菌生长情况测试图，其中，图8a～8f分别为0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、600μg/mL时的效果图；图9为不同质量浓度AgNO3的铜假绿单胞菌菌液在琼板上培养24h的细菌生长情况测试图，其中，图9a～9f分别为0μg/mL、6μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL时的效果图。可以得到，MBC(Zn/oSiNP@Ag)和MBC(AgNO3)分别为300μg/mL和15μg/mL。由图7(a)和图7(b)的对比可知，有机硅载体(Zn/oSiNP)的抗菌效果相对Ag+可以忽略，因此，根据公式MBC(Ag)＝MBC(抗菌剂)×L(Ag)，可以得到，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和AgNO3的中Ag对铜绿假单胞菌的最小杀菌浓度MBC分别为5.57μg/mL和9.53μg/mL，因此，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对铜绿假单胞菌的杀菌率是AgNO3的1.71倍。
3、抗菌性测试(革兰氏阳性菌——枯草芽孢杆菌)
3.1、不同试剂的抗菌性
分别将有机硅载体(Zn/oSiNP)、复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)、实心SiO2微球(通过法用TEOS自制，粒径120nm)与LB培养基混合均匀，按照2.1中的试验过程执行，只是将铜绿假单胞菌替换为枯草芽孢杆菌。结果如图10所示，图10为实施例1中有机硅载体(Zn/oSiNP)、复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和实心SiO2微球对枯草芽孢杆菌的抗菌性测试效果图。可以看出，与实心SiO2微球组相比，有机硅载体(Zn/oSiNP)组具有一定抗菌性，而复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)具有显著的抗菌性，明显提高抗菌效果。
3.2、不同试剂抑菌率的比较
按照3.2中的试验过程进行，只是将铜绿假单胞菌替换为枯草芽孢杆菌。结果如图11所示，图11为实施例1中各试剂在不同质量浓度下对枯草芽孢杆菌的抗菌效果测试图，其中，图11(a)为不同质量浓度机硅载体(Zn/oSiNP)的抗菌效果测试图，图11(b)为不同质量浓度复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的抗菌效果测试图，图11(c)为不同质量浓度AgNO3水溶液的抗菌效果测试图。由图11(b)和图11(c)可知，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和AgNO3的抗枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度MIC(Zn/oSiNP@Ag)和MIC(AgNO3)分别为300μg/mL和10μg/mL。由图11(a)和图11(b)的对比可以看出，有机硅载体(Zn/oSiNP)的抗菌效果相对Ag+可以忽略，因此，根据公式MIC(Ag)＝MIC(抗菌剂)×L(Ag)，可以得到，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和AgNO3的中Ag对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度MIC分别为5.57μg/mL和6.35μg/mL，因此，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对枯草芽孢杆菌的抑菌率是AgNO3的1.14倍。
3.3、培养一定时间后的杀菌率测试
按照2.3中的试验过程进行，只是将铜绿假单胞菌替换为枯草芽孢杆菌，进行抗枯草芽孢杆菌的最小杀菌浓度MBC的表征，结果如图12-13所示，图12为不同质量浓度复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)的枯草芽孢杆菌菌液在琼板上培养24h的细菌生长情况测试图，其中，图12a～12d分别为0μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、600μg/mL时的效果图；图13为不同质量浓度AgNO3的枯草芽孢杆菌菌液在琼板上培养24h的细菌生长情况测试图，其中，图13a～13e分别为0μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL时的效果图。可以得到，MBC(Zn/oSiNP@Ag)和MBC(AgNO3)分别为400μg/mL和20μg/mL。由图11(a)和图11(b)的对比可知，有机硅载体(Zn/oSiNP)的抗菌效果相对Ag+可以忽略，因此，根据公式MBC(Ag)＝MBC(抗菌剂)×L(Ag)，可以得到，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)和AgNO3的中Ag对枯草芽孢杆菌的最小杀菌浓度MBC分别为7.42μg/mL和12.7μg/mL，因此，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对枯草芽孢杆菌的杀菌率是AgNO3的1.71倍。
实施例2
1、制备抗菌剂微球
1.1、制备Zn/oSiNP微球载体
a)按照实施例1实施，不同的是，增加3-氨丙基三乙氧基硅烷用量并调控水用量，使六水合硝酸锌∶3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1∶15，3-氨丙基三乙氧基硅烷∶水的体积比为1∶30。所得微球形貌如图14所示，粒径为120-200nm。
b)按照实施例1实施，不同的是，辐照条件为：剂量率50Gy/min，辐照时间24h，总吸收剂量72kGy。
1.2、制备Zn/oSiNP@Ag微球
c)按照实施例1实施，不同的是，改变AgNO3水溶液用量，具体为浓度0.08mol/L、共5mL，即AgNO3∶步骤a)中3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为0.5∶1；同时，将磁力搅拌时间改为4h。
d)按照实施例1实施，不同的是，改变NaBH4水溶液用量，具体为浓度0.16mol/L、共5mL，即NaBH4∶步骤c)中AgNO3水溶液中AgNO3的摩尔比为2∶1。
所得Zn/oSiNP@Ag微球的形貌如图15所示，粒径120-200nm，其上负载的银纳米粒子尺寸为10-15nm，负载率L(Ag)＝2.06％。
2、抗菌性测试(革兰氏阴性菌——铜绿假单胞菌)
按照实施例1中2.2的试验过程进行测试，结果显示，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)中Ag对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度MIC为2.06μg/mL，因此，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对铜绿假单胞菌的抑菌率是AgNO3(MIC＝3.81μg/mL)的1.85倍。
按照实施例1中2.3的试验过程进行测试，结果显示，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)中Ag对铜绿假单胞菌的最小杀菌浓度MBC为6.18μg/mL，因此，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对铜绿假单胞菌的杀菌率是AgNO3(MBC＝9.53μg/mL)的1.54倍。
3、抗菌性测试(革兰氏阳性菌——枯草芽孢杆菌)
按照实施例1中3.2的试验过程进行测试，结果显示，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)中Ag对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度MIC为6.18μg/mL，因此，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对枯草芽孢杆菌的抑菌率是AgNO3(MIC＝6.35μg/mL)的1.03倍。
按照实施例1中3.3的试验过程进行测试，结果显示，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)中Ag对枯草芽孢杆菌的最小杀菌浓度MBC为8.24μg/mL，因此，复合纳米微球(Zn/oSiNP@Ag)对枯草芽孢杆菌的杀菌率是AgNO3(MBC＝12.7μg/mL)的1.54倍。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有近似于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种金属-有机硅复合纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将六水合硝酸锌、3-氨丙基三乙氧基硅烷和水混合，得到混合液；
b)在保护性气氛下，对所述混合液进行60Coγ-射线辐照，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到锌-有机硅纳米微球分散液；
c)将所述锌-有机硅纳米微球分散液与AgNO3水溶液混合，然后，进行固液分离、洗涤，将所得固体产物分散于水中，得到分散液；
d)将步骤c)所得分散液与还原剂溶液混合反应，然后进行固液分离、洗涤和干燥，得到金属-有机硅复合纳米抗菌剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中，所述六水合硝酸锌∶3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1∶(9～15)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中，所述辐照的条件为：剂量率9～76Gy/min，辐照时间2～24h，总吸收剂量1～110kGy。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中AgNO3水溶液中的AgNO3∶步骤a)中3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为(0.05～0.5)∶1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中，所述还原剂溶液为NaBH4水溶液。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中，所述还原剂溶液中还原剂∶步骤c)中AgNO3水溶液中AgNO3的摩尔比为(2～5)∶1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷∶水的体积比为1∶(25～50)。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中，所述干燥为冷冻干燥。
9.一种权利要求1～8中任一项所述的制备方法制得的金属-有机硅复合纳米抗菌剂。
10.权利要求9所述的金属-有机硅复合纳米抗菌剂作为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的抗菌剂的应用。
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