CN115993444A - 一种用于人血清脑脊液gfap抗体的双色免疫荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，包括获取待检患者的检验样本和特征信息、检测样本阳性初筛、构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK‑293T细胞模型、利用过表达GFAPα和GFAPε的HEK‑293T细胞模型确证GFAP抗体、构建患者特征信息与阳性率关联的数学模型和评价模型预测性能，根据分类结果计算阳性率步骤。本发明通过构建患者特征信息数据库，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型，可以根据模型的分类结果，通过待检患者的基本信息和临床症状信息预测患者GFAP抗体阳性的概率，并提出新的检测方法以提高GFAP抗体检出的准确性，探究GFAP星形细胞病的诊治方案，对于制定合理的诊治方案具有一定的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及抗体检测技术领域，特别涉及一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法。
背景技术
GFAP是胶质纤维酸性蛋白，是星形胶质细胞活化的标志物。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在。星形胶质细胞具有许多突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用，并参与了血脑屏障的形成。由于星形胶质细胞能产生和分泌某些神经递质以及表达某些神经递质受体，可对一些神经活性物质产生反应。另外，星形胶质细胞能对外源性化合物进行生物转化，并可帮助调节神经元周围的离子微环境。外源性化学物质或外伤损伤中枢神经系统后，损伤区域星形胶质细胞通过增生可形成胶质“瘢痕”。这种增殖多伴随着胶质纤维酸性蛋白的表达增加。因此组织中GFAP升高是中枢神经系统对损伤作出反应的一个标志性信号。GFAP抗体阳性介导的疾病在医学上称为自身免疫胶质纤维酸性蛋白星形细胞病，属于自身免疫性疾病。临床上与其他类型的脑脊髓膜炎相类似，如急性播散性脑脊髓炎以及视神经脊髓炎谱系疾病。但GFAP抗体会攻击星型胶质细胞，患者会出现头痛、发热等刺激症状以及肢体麻木、偏瘫、截瘫甚至智力障碍等。
其中，视神经脊髓炎谱系疾病是一组主要由体液免疫参与，抗原-抗体介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病谱，其发病急，症状重，预后较差，致残率高。抗水通道蛋白4抗体(AQP4-IgG)是其最特异性的血清学标志，为其致病性抗体，在视神经脊髓炎谱系疾病的发病机制中起重要作用。然而，研究发现仍有20％的视神经脊髓炎谱系疾病患者的血清AQP4-IgG抗体呈阴性，且用目前的发病机制尚不能完全解释其病变特征，推测其体内合并其他的病理性抗体和生物标志物。目前认为视神经脊髓炎最本质的病理机制是星形胶质细胞损伤，神经胶质纤维酸性蛋白GFAP是星形胶质细胞的标志性生物标志物。相关研究表明，视神经脊髓炎患者的血清中GFAP浓度明显高于对照组，但这种升高是否与视神经病变或脊髓病变相关，仍需进一步研究，而如何通过分析合并血清GFAP抗体阳性的视神经脊髓炎谱系疾病患者的临床特征，进一步探讨血清GFAP抗体在视神经脊髓炎谱系疾病中的临床意义，对于GFAP抗体阳性的视神经脊髓炎谱系疾病患者的诊疗具有指导性意义，有助于提高医生临床诊断的准确性，为此，我们提出一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，通过构建患者特征信息数据库，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型，可以根据模型的分类结果，通过待检患者的基本信息和临床症状信息预测患者GFAP抗体阳性的概率，并提出新的检测方法以提高GFAP抗体检出的准确性，探究GFAP星形细胞病的诊治方案，对于制定合理的诊治方案具有一定的指导意义，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：
步骤一：获取待检患者的检验样本和特征信息
采集待检患者的血清样本和脑脊液样本，并记录采集时待检患者的特征信息；
血清样本获取方法：采集血液样本，并将其置于不含抗凝剂的试管内；室温下自然凝集30-60min，待血液凝固；以2000-3000rpm的速度离心5-10min，取上清液保存于-80℃冰箱中；
脑脊液样本获取方法：由临床医师进行腰椎穿刺或者从小脑延脑池或侧脑室穿刺采集获得；
步骤二：检测样本阳性初筛
取患者1∶10比例稀释后的血清和脑脊液30μL，加入检测基质中常温下结合3h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合2h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；
步骤三：构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK-293T细胞模型具体步骤为：
S1，构建真核表达载体
利用PCR技术获取目的基因，PCR反应条件如下：98℃变性15s，58℃退火15s，68℃延伸90s，共30个循环；68℃延伸5min，1.5％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，分别取GFAPα和GFAPε的PCR回收产物，用BamHI/XhoI双酶切，pcDNA3.1+载体连接，连接产物分别加入至50μLDH5α感受态细胞中，质粒酶切鉴定阳性克隆，阳性质粒去测序确定；
S2，细胞转染
当细胞株进行传代至汇合度为70％～80％时，使用Opti-MEM培养基，并采用Lipofectamine2000转染试剂对细胞进行转染36h后收样，通过western blotting方法检测GFAP蛋白的表达；
步骤四：利用过表达GFAPα和GFAPε的HEK-293T细胞模型确证GFAP抗体
取经步骤二中初筛阳性的患者1∶10比例稀释后血清和脑脊液各15μL，与过表达的细胞在常温下结合1h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合1h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；
步骤五：构建患者特征信息与阳性率关联的数学模型
S1，构建患者特征信息数据库，对数据库中的特征信息数据进行数据归一化处理；
S2，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型
具体步骤为：
S21，通过简单交叉验证方法对样本随机划分为训练子集和测试子集，其中训练集样本为80％，测试集为20％；
S22，通过sklearn库方法对特征进行重要性评估，并根据评分对特征降序排序，运行SWSFS过程筛选最优变量数；
S23，利用网格搜索的方式对随机森林在局部范围内找出最优参数；
S24，建立决策树，并根据所有决策树的投票结果决定数据的分类；
步骤六：评价模型预测性能，根据分类结果计算阳性率
根据分类结果获取阳性率值，使用混淆矩阵进行预测结果的分类，并通过计算模型预测的准确性，对模型的预测性能进行量化评价，计算公式为：
其中acc为模型预测的准确性值；TP为特征信息数据库中真正例个数；TN为特征信息数据库中真反例个数；FP为特征信息数据库中伪正例个数；FN为特征信息数据库中伪反例个数。
进一步的，所述的特征信息包括患者基本信息和临床症状信息，基本信息包括年龄、性别；临床症状信息包括是否头痛、是否发热、是否视力下降、是否肢体无力、是否肢体感觉障碍、是否出现癫痫、是否精神异常、是否二便异常。
进一步的，所述步骤二中的检测基质为确诊阳性的小鼠小脑和海马冰冻切片样本。
进一步的，所述步骤二中GFAP抗体初筛阳性的结果判断方法为：一，抗体结合于海马与脑干之间的软脑膜和海马脑实质各层胶质细胞；二，抗体结合于小脑组织不同层面，结合位点位于胶质细胞胞体与突起，在分子层表现为Bergmann状放射状。
进一步的，所述步骤三中目的基因GFAPα的扩增引物序列如下：GFAPBamHIF：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3'；GFAPαXhoIR：5'-CCGCTCGAGTCACATCACATCCTTGTGCTCCTGCTTG-3'；
目的基因GFAPε的扩增引物序列如下：GFAPBamHIF：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3'；GFAPεNotIR：5'-ATAAGAATACGGCCGCCTAACCGCGAGCCGGCGGCGTTCCATT-3'。
进一步的，所述步骤四中GFAP抗体阳性的结果判断方法为：一，抗体只结合于转染成功的细胞，未转染成功的细胞和空白细胞未见荧光；二，PBS对照阴性。
进一步的，所述步骤五中特征信息数据归一化方法为：所述基本信息中的年龄的归一化采用如下公式：
其中，xscale代表数据集当前数据的值；xmin代表待检患者中年龄的最小值，xmax代表待检患者中年龄的最大值；其余特征信息取是为1，否为0，其中性别为男性时取1，性别为为女性时取0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用本发明提出的检测方法，基于间接荧光免疫法，通过检测基质可以检测样本中GFAP抗体表达位置，利用PCR技术获取目的基因，并分别取GFAPα和GFAPε的PCR回收产物，利用过表达GFAPα，GFAPε的HEK-293T细胞模型确证GFAP抗体在细胞中的表达水平，通过对检测结果进行分析，有助于提高检测患者GFAP抗体检出的准确性，探究GFAP星形细胞病的诊治方案，对于制定合理的诊治方案具有一定的指导意义；
(2)通过构建患者特征信息数据库，并对数据库中的特征信息数据进行数据归一化处理，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型，可以根据模型的分类结果，通过待检患者的基本信息和临床症状信息预测患者GFAP抗体阳性的概率。
附图说明
图1为本发明一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本发明的限制，为了更好地说明本发明的具体实施方式，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸。
实施例1
如图1所示，一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，检测方法包括以下步骤：
步骤一：获取待检患者的检验样本和特征信息
采集待检患者的血清样本和脑脊液样本，并记录采集时待检患者的特征信息；
步骤二：检测样本阳性初筛
取患者1∶10比例稀释后的血清和脑脊液30μL，加入检测基质中常温下结合3h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合2h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；
步骤三：构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK-293T细胞模型具体步骤为：
S1，构建真核表达载体
利用PCR技术获取目的基因，PCR反应条件如下：98℃变性15s，58℃退火15s，68℃延伸90s，共30个循环；68℃延伸5min，1.5％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，分别取GFAPα和GFAPε的PCR回收产物，用BamHI/XhoI双酶切，pcDNA3.1+载体连接，连接产物分别加入至50μLDH5α感受态细胞中，质粒酶切鉴定阳性克隆，阳性质粒去测序确定；
S2，细胞转染
当细胞株进行传代至汇合度为70％～80％时，使用Opti-MEM培养基，并采用Lipofectamine2000转染试剂对细胞进行转染36h后收样，通过western blotting方法检测GFAP蛋白的表达；
步骤四：利用过表达GFAPα和GFAPε的HEK-293T细胞模型确证GFAP抗体
取经步骤二中初筛阳性的患者1∶10比例稀释后血清和脑脊液各15μL，与过表达的细胞在常温下结合1h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合1h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；
步骤五：构建患者特征信息与阳性率关联的数学模型
S1，构建患者特征信息数据库，对数据库中的特征信息数据进行数据归一化处理；
S2，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型
具体步骤为：
S21，通过简单交叉验证方法对样本随机划分为训练子集和测试子集，其中训练集样本为80％，测试集为20％；
S22，通过sklearn库方法对特征进行重要性评估，并根据评分对特征降序排序，运行SWSFS过程筛选最优变量数；
S23，利用网格搜索的方式对随机森林在局部范围内找出最优参数；
S24，建立决策树，并根据所有决策树的投票结果决定数据的分类；
步骤六：评价模型预测性能，根据分类结果计算阳性率
根据分类结果获取阳性率值，使用混淆矩阵进行预测结果的分类，并通过计算模型预测的准确性，对模型的预测性能进行量化评价，计算公式为：
其中acc为模型预测的准确性值；TP为特征信息数据库中真正例个数；TN为特征信息数据库中真反例个数；FP为特征信息数据库中伪正例个数；FN为特征信息数据库中伪反例个数。
特征信息包括患者基本信息和临床症状信息，基本信息包括年龄、性别；临床症状信息包括是否头痛、是否发热、是否视力下降、是否肢体无力、是否肢体感觉障碍、是否出现癫痫、是否精神异常、是否二便异常。
步骤二中的检测基质为确诊阳性的小鼠小脑和海马冰冻切片样本。
步骤二中GFAP抗体初筛阳性的结果判断方法为：一，抗体结合于海马与脑干之间的软脑膜和海马脑实质各层胶质细胞；二，抗体结合于小脑组织不同层面，结合位点位于胶质细胞胞体与突起，在分子层表现为Bergmann状放射状。
步骤三中目的基因GFAPα的扩增引物序列如下：GFAPBamHIF：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3'；GFAPαXhoIR：5'-CCGCTCGAGTCACATCACATCCTTGTGCTCCTGCTTG-3'；
目的基因GFAPε的扩增引物序列如下：GFAPBamHIF：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3'；GFAPεNotIR：5'-ATAAGAATACGGCCGCCTAACCGCGAGCCGGCGGCGTTCCATT-3'。
步骤四中GFAP抗体阳性的结果判断方法为：一，抗体只结合于转染成功的细胞，未转染成功的细胞和空白细胞未见荧光；二，PBS对照阴性。
通过采用上述技术方案：采用本发明提出的检测方法，基于间接荧光免疫法，通过步骤二检测样本阳性初筛，利用检测基质可以检测样本中GFAP抗体表达位置，对获取的样本进行阳性初筛，然后利用PCR技术获取目的基因，并分别取GFAPα和GFAPε的PCR回收产物，利用过表达GFAPα，GFAPε的HEK-293T细胞模型确证GFAP抗体在细胞中的表达水平，再次对抗体是否为阳性进行判定，通过对检测结果进行分析，有助于提高检测患者GFAP抗体检出的准确性，探究GFAP星形细胞病的诊治方案，对于制定合理的诊治方案具有一定的指导意义。
实施例2
如图1所示，一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，检测方法包括以下步骤：
步骤一：获取待检患者的检验样本和特征信息
采集待检患者的血清样本和脑脊液样本，并记录采集时待检患者的特征信息；
步骤二：检测样本阳性初筛
取患者1∶10比例稀释后的血清和脑脊液30μL，加入检测基质中常温下结合3h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合2h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；
步骤三：构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK-293T细胞模型具体步骤为：
S1，构建真核表达载体
利用PCR技术获取目的基因，PCR反应条件如下：98℃变性15s，58℃退火15s，68℃延伸90s，共30个循环；68℃延伸5min，1.5％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，分别取GFAPα和GFAPε的PCR回收产物，用BamHI/XhoI双酶切，pcDNA3.1+载体连接，连接产物分别加入至50μLDH5α感受态细胞中，质粒酶切鉴定阳性克隆，阳性质粒去测序确定；
S2，细胞转染
当细胞株进行传代至汇合度为70％～80％时，使用Opti-MEM培养基，并采用Lipofectamine2000转染试剂对细胞进行转染36h后收样，通过western blotting方法检测GFAP蛋白的表达；
步骤四：利用过表达GFAPα和GFAPε的HEK-293T细胞模型确证GFAP抗体
取经步骤二中初筛阳性的患者1∶10比例稀释后血清和脑脊液各15μL，与过表达的细胞在常温下结合1h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合1h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；
步骤五：构建患者特征信息与阳性率关联的数学模型
S1，构建患者特征信息数据库，对数据库中的特征信息数据进行数据归一化处理；
S2，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型
具体步骤为：
S21，通过简单交叉验证方法对样本随机划分为训练子集和测试子集，其中训练集样本为80％，测试集为20％；
S22，通过sklearn库方法对特征进行重要性评估，并根据评分对特征降序排序，运行SWSFS过程筛选最优变量数；
S23，利用网格搜索的方式对随机森林在局部范围内找出最优参数；
S24，建立决策树，并根据所有决策树的投票结果决定数据的分类；
步骤六：评价模型预测性能，根据分类结果计算阳性率
根据分类结果获取阳性率值，使用混淆矩阵进行预测结果的分类，并通过计算模型预测的准确性，对模型的预测性能进行量化评价，计算公式为：
其中acc为模型预测的准确性值；TP为特征信息数据库中真正例个数；TN为特征信息数据库中真反例个数；FP为特征信息数据库中伪正例个数；FN为特征信息数据库中伪反例个数。
特征信息包括患者基本信息和临床症状信息，基本信息包括年龄、性别；临床症状信息包括是否头痛、是否发热、是否视力下降、是否肢体无力、是否肢体感觉障碍、是否出现癫痫、是否精神异常、是否二便异常。
步骤二中的检测基质为确诊阳性的小鼠小脑和海马冰冻切片样本。
步骤二中GFAP抗体初筛阳性的结果判断方法为：一，抗体结合于海马与脑干之间的软脑膜和海马脑实质各层胶质细胞；二，抗体结合于小脑组织不同层面，结合位点位于胶质细胞胞体与突起，在分子层表现为Bergmann状放射状。
步骤三中目的基因GFAPα的扩增引物序列如下：GFAPBamHIF：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3'；GFAPαXhoIR：5'-CCGCTCGAGTCACATCACATCCTTGTGCTCCTGCTTG-3'；
目的基因GFAPε的扩增引物序列如下：GFAPBamHIF：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3'；GFAPεNotIR：5'-ATAAGAATACGGCCGCCTAACCGCGAGCCGGCGGCGTTCCATT-3'。
步骤四中GFAP抗体阳性的结果判断方法为：一，抗体只结合于转染成功的细胞，未转染成功的细胞和空白细胞未见荧光；二，PBS对照阴性。
步骤五中特征信息数据归一化方法为：基本信息中的年龄的归一化采用如下公式：
其中，xscale代表数据集当前数据的值；xmin代表待检患者中年龄的最小值，xmax代表待检患者中年龄的最大值；其余特征信息取是为1，否为0，其中性别为男性时取1，性别为为女性时取0。
通过采用上述技术方案：在抗体阳性检测完成后，通过构建患者特征信息数据库，对数据库中的特征信息数据进行数据归一化处理，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型，根据模型的分类结果，对模型的预测性能进行量化评价，将患者的临床特征与检测阳性率进行关联，临床诊断中，通过该数学模型可以根据患者的临床特征对其GFAP抗体检测阳性率进行预估，有助于探讨血清GFAP抗体在视神经脊髓炎谱系疾病中的临床意义，对于GFAP抗体阳性的视神经脊髓炎谱系疾病患者的诊疗具有指导性意义，有助于提高医生临床诊断的准确性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：
步骤一：获取待检患者的检验样本和特征信息
采集待检患者的血清样本和脑脊液样本，并记录采集时待检患者的特征信息；
步骤二：检测样本阳性初筛
取患者1∶10比例稀释后的血清和脑脊液30μL，加入检测基质中常温下结合3h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合2h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；
步骤三：构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK-293T细胞模型具体步骤为：
S1，构建真核表达载体
利用PCR技术获取目的基因，PCR反应条件如下：98℃变性15s，58℃退火15s，68℃延伸90s，共30个循环；68℃延伸5min，1.5％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，分别取GFAPα和GFAPε的PCR回收产物，用BamHI/XhoI双酶切，pcDNA3.1+载体连接，连接产物分别加入至50μLDH5α感受态细胞中，质粒酶切鉴定阳性克隆，阳性质粒去测序确定；
S2，细胞转染
当细胞株进行传代至汇合度为70％～80％时，使用Opti-MEM培养基，并采用Lipofectamine2000转染试剂对细胞进行转染36h后收样，通过western blotting方法检测GFAP蛋白的表达；
步骤四：利用过表达GFAPα和GFAPε的HEK-293T细胞模型确证GFAP抗体
取经步骤二中初筛阳性的患者1∶10比例稀释后血清和脑脊液各15μL，与过表达的细胞在常温下结合1h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合1h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；
步骤五：构建患者特征信息与阳性率关联的数学模型
S1，构建患者特征信息数据库，对数据库中的特征信息数据进行数据归一化处理；
S2，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型
具体步骤为：
S21，通过简单交叉验证方法对样本随机划分为训练子集和测试子集，其中训练集样本为80％，测试集为20％；
S22，通过sklearn库方法对特征进行重要性评估，并根据评分对特征降序排序，运行SWSFS过程筛选最优变量数；
S23，利用网格搜索的方式对随机森林在局部范围内找出最优参数；
S24，建立决策树，并根据所有决策树的投票结果决定数据的分类；
步骤六：评价模型预测性能，根据分类结果计算阳性率
根据分类结果获取阳性率值，使用混淆矩阵进行预测结果的分类，并通过计算模型预测的准确性，对模型的预测性能进行量化评价，计算公式为：
其中acc为模型预测的准确性值；TP为特征信息数据库中真正例个数；TN为特征信息数据库中真反例个数；FP为特征信息数据库中伪正例个数；FN为特征信息数据库中伪反例个数。
2.根据权利要求1所述的一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述的特征信息包括患者基本信息和临床症状信息，基本信息包括年龄、性别；临床症状信息包括是否头痛、是否发热、是否视力下降、是否肢体无力、是否肢体感觉障碍、是否出现癫痫、是否精神异常、是否二便异常。
3.根据权利要求1所述的一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述步骤二中的检测基质为确诊阳性的小鼠小脑和海马冰冻切片样本。
4.根据权利要求1所述的一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述步骤二中GFAP抗体初筛阳性的结果判断方法为：一，抗体结合于海马与脑干之间的软脑膜和海马脑实质各层胶质细胞；二，抗体结合于小脑组织不同层面，结合位点位于胶质细胞胞体与突起，在分子层表现为Bergmann状放射状。
5.根据权利要求1所述的一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述步骤三中目的基因GFAPα的扩增引物序列如下：GFAPBamHIF：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3'；GFAPαXhoIR：5'-CCGCTCGAGTCACATCACATCCTTGTGCTCCTGCTTG-3'；
目的基因GFAPε的扩增引物序列如下：GFAPBamHIF：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGAGAGGAGACGCATCACCTCCG-3'；GFAPεNotIR：5'-ATAAGAATACGGCCGCCTAACCGCGAGCCGGCGGCGTTCCATT-3'。
6.根据权利要求1所述的一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述步骤四中GFAP抗体阳性的结果判断方法为：一，抗体只结合于转染成功的细胞，未转染成功的细胞和空白细胞未见荧光；二，PBS对照阴性。
7.根据权利要求1所述的一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述步骤五中特征信息数据归一化方法为：所述基本信息中的年龄的归一化采用如下公式：
其中，xscale代表数据集当前数据的值；xmin代表待检患者中年龄的最小值，xmax代表待检患者中年龄的最大值；其余特征信息取是为1，否为0，其中性别为男性时取1，性别为为女性时取0。
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2022
- 2022-12-19 CN CN202211690502.2A patent/CN115993444A/zh active Pending
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