CN115991754A - 一种pf12A基因恢复水稻育性的方法及在调控水稻育性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种pf12A基因恢复籼粳水稻杂种育性的方法及在调控水稻籼粳亚种杂种育性中的应用，涉及植物基因工程技术领域。本发明通过构建敲除载体，转化pf12位点为籼型纯合基因型的近等基因系材料BL(pf12‑NJ/NJ)得到了敲除pf12A基因的敲除家系BL(pf12‑pf12AKO‑1/pf12AKO‑1)和BL(pf12‑pf12AKO‑2/pf12AKO‑2)。经试验证实可知，本发明所得的两个敲除家系与pf12位点近等基因系受体亲本材料BL杂交的杂种F1代的结实率均为81％，高于未敲除对照杂种F1的69％结实率，表明本发明所述基因是控制pf12位点杂种育性的必需基因。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种pf12A基因恢复水稻育性的方法及在调控水稻育性中的应用。
背景技术
水稻隶属于禾本科(Gramineae)、禾亚科(Pooideae)的稻属(Oryzeae)，包括二十多种野生稻和两种栽培稻。两种栽培稻可分为亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)和非洲栽培稻(Oryza glaberrima)，亚洲栽培稻又分为籼亚种(ssp.xian)和粳亚种(ssp.geng)。种间、亚种间在生理生态和遗传背景等方面存在着明显的差异，这些差异使其相互之间形成了生殖隔离，结果往往表现为杂交后代不育或半不育(Kato S,Kosaka H,Hara S(1928)On theaffinity of rice varieties as shown by fertility of hybrid plants.Bull SciFac Agric Kyushu Univ,3:132-147；Oka HI(1988)Origin of cultivatedrice.Scientific Societies Press,Tokyo,Japan pp 181–209；Yang J,Zhao X,Cheng K(2012)A killer-protector system regulates both hybrid sterility andsegregation distortion in rice.Science,337(6100):1336-1340.)。多年来水稻育种实践上主要利用的是亚种内的杂种优势，而亚种间、种间具有更大的杂种优势潜力，但杂种不育的存在限制了对其杂种优势的利用。目前已经有遗传定位的水稻杂种不育位点大约50个，而成功克隆的只有13个(谢勇尧，汤金涛，杨博文(2019)水稻育性调控的分子遗传研究进展.遗传，41(08):703-715.)。
水稻杂种不育研究关注的表型包括花粉育性、胚囊育性和小穗育性，pf12主要是通过控制花粉育性而影响小穗育性的。Song xiang等人利用一个三交群体(‘02428’/‘Nanjing11’//‘Balilla’)最先扫描到pf12位点，将其定位至分子标记RM19和RM247之间(Song X,Qiu S Q,Xu C G(2005)Genetic dissection of embryo sac fertility,pollenfertility,and their contributions to spikelet fertility of intersubspecifichybrids in rice.Theoretical and Applied Genetics,110(2):205-211.)；随后朱文银等人利用E47-1/广陆矮4号的F2群体将其定位于分子标记RM19和RM453之间并命名为Se(朱文银，李文涛，丁效华(2008)水稻F1花粉不育基因Se的初步鉴定.华南农业大学学报，(01):1-5.)；Zhang Hua等人利用9311和日本晴的染色体片段替换系材料将其定位于分子标记MS062和MS102之间并命名为qs12(Zhang H,Zhang C Q,Sun Z Z(2011)A major locusqS12,located in a duplicated segment of chromosome 12,causes spikeletsterility in an indica-japonica rice hybrid.Theoretical and applied genetics,123(7):1247-1256.)；Kubo等人利用Asominori和IR24的双向近等基因系材料将其定位于分子标记12c066和12c102之间并命名为S25(Kubo T,Yoshimura A,Kurata N(2017)Genetic characterization and fine mapping of S25,a hybrid male sterilitygene,on rice chromosome 12.Genes&Genetic Systems,92(4):205-212.)。
因此，为了进一步拓宽培育籼粳广亲和基因资源，更多的与水稻籼粳杂种不育相关的基因亟待鉴定。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种pf12A基因恢复水稻育性的方法及在调控水稻育性中的应用，所述pf12A基因是控制pf12位点杂种育性的必需基因。
为解决籼粳杂种不育的问题，本发明提供了以下技术方案：
一种蛋白质在调控水稻籼粳亚种间杂种不育中的应用，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，编码上述蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种提高水稻籼粳亚种间杂种育性的方法，敲除或抑制水稻中上述蛋白的表达和/或活性，选择可以提高水稻籼粳亚种间杂种育性的植株。
优选的，所述敲除或抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中的任意一种。
更优选的，所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
更优选的，所述CRISPR/Cas9方法在水稻基因组靶标区域的DNA序列如SEQ IDNO.4-SEQ ID NO.7中任意一个所示。
本发明还提供了一种用于提高水稻籼粳亚种间杂种育性的试剂盒，包括如下任一种：
(1)能够识别上述靶标区域的RNA分子；
(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA的载体。
优选的，所述的RNA分子的序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.11任意一个所示。
本发明还提供了一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变基因，所述突变基因序列为SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。
本发明还提供了一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示。
本发明的优点及有益效果如下：
本发明提供了一种pf12A基因在恢复籼粳水稻杂种育性中的应用，通过构建敲除载体，转化近等基因系材料BL(pf12-NJ/NJ)得到了敲除pf12A基因的敲除家系BL(pf12-pf12AKO-1/pf12AKO-1)和BL(pf12-pf12AKO-2/pf12AKO-2)。经试验证实可知，本发明所得的敲除家系与pf12位点近等基因系受体亲本材料BL杂交的杂种F1代的结实率均为81％，相对于对照pf12位点为正常籼粳杂合基因型材料BL(pf12-BL/NJ)69％的结实率显著上升，表明本发明所述基因是控制pf12位点杂种育性的必需基因。
附图说明
图1为本发明基因pf12A的鉴定流程。
图2为CRISPR表达盒与载体框架。
图3为pf12A基因的结构和CRISPR靶点。
图4为pf12A的图位克隆和转基因验证结果，A，通过四次分离群体的定位将pf12位点定位至40kb的区间内；B，重组单株的育性考察和pf12位点候选基因的比较分析；C，pf12A基因的阳性编辑材料与BL杂交F1代的花粉育性和小穗育性考察以及其F2代基因型的分离情况统计。
具体实施方式
一种蛋白质在调控水稻籼粳亚种间杂种不育中的应用，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明中，编码上述蛋白质的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。利用本发明所述蛋白质可以调控水稻的育性，从而使水稻亚种间、种间强大的杂种优势得以发挥，进一步提高水稻的生物学产量。
本发明还提供了一种提高水稻籼粳亚种间杂种育性的方法，敲除或抑制水稻中上述蛋白的表达和/或活性，选择可以提高水稻籼粳亚种间杂种育性的植株。
本发明中，所述敲除或抑制蛋白表达和/或活性的方法优选的包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中的任意一种；所述基因编辑优选的采用CRISPR/Cas9方法。本发明中，所述CRISPR/Cas9方法在水稻基因组靶标区域的DNA序列优选的如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.7中任意一个所示。
本发明还提供了一种用于提高水稻籼粳亚种间杂种育性的试剂盒，包括如下任一种：
(1)能够识别上述靶标区域的RNA分子；
(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA的载体。
本发明中，所述的RNA分子的序列优选的如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.11任意一个所示。
本发明还提供了一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变基因，所述突变基因序列为SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。本发明还提供了一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示。
在本发明的具体实施例中，所述近等基因系材料BL(pf12-NJ/NJ)是以南京11(NJ11，NJ)为供体亲本、巴利拉(Balilla，BL)为轮回亲本，通过多世代的回交和自交构建得到。本发明中，所述南京11(NJ11，NJ)优选为江苏农科院育成的中籼品种，属胜利籼衍生品系；所述巴利拉(Balilla，BL)为引自意大利的粳型品种。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
分离克隆包含有pf12A基因区段的DNA片段
1.利用图位克隆技术鉴定水稻杂种不育基因pf12A
以NJ11为供体亲本、BL为轮回亲本，通过多世代的回交和自交构建了一个近等基因系BL(pf12-NJ/NJ)，使其自交产生了包含791个单株的BC8F2群体。2014年武汉夏季开始对791株材料进行初定位和精细定位。随后利用BL(pf12-BL/NJ)的种子继续做了三次大群体精细定位。2014年海南冬季通过对5472株个体的基因型鉴定和表型考察，将目标区间缩小至83.6kb的范围，2015年武汉夏季通过对6516株个体的基因型鉴定和表型考察，将目标区间缩小至53.6kb的范围，2017年武汉夏季通过对10080株个体的基因型鉴定和表型考察，结合所有定位结果最终依据8株重组株提供的重组信息从而将目标区间缩小至40kb的范围。
DNA的抽提按Murray和Thompson的CTAB法进行(Murray M G,Thompson W F(1980)Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucl Acids Res.8:4321-4325)。使用的分子标记包括InDel标记、SSR标记和KASP标记，通过对基因型和表型的联合分析，最终将pf12A基因限定在分子标记KS491和KS561之间40kb的范围，结果如表1所示。
表1pf12A基因的精细定位结果
| individuals | F854L0.295 | KS491 | KS561 | F906R1.82 | phenotype |
| FM16D05 | B | B | H | H | S |
| PH82A03 | N | N | H | H | S |
| PH06G03 | N | N | H | H | F |
| PH29F08 | N | N | H | H | F |
| PH49C08 | H | H | N | N | F |
| PH71B04 | H | H | N | N | F |
| FM31G10 | H | H | N | N | F |
| PH82F05 | H | H | B | B | S |
其中，B：pf12-BL/BL；N：pf12-NJ/NJ；H：pf12-BL/NJ；S：sterility or semi-sterility；F：fertility。
2.遗传转化载体的构建及转基因植株的表现
本发明基因pf12A属于一个典型的籼粳杂合时籼型配子存活、粳型配子败育，从而表现为显著偏分离现象的位点。即由pf12-xian/pf12-xian、pf12-geng/pf12-geng形成的合子育性正常，而由pf12-geng/pf12-xian组成的合子，则表现为不育或半不育。因此，采取敲除pf12A基因的策略，通过考察转基因后代植株的育性表型来验证其功能。
敲除载体的构建方法是：根据籼稻NJ11的基因组序列和华南农大刘耀光老师实验室提供的单子叶植物CRISPR载体系统设计引物：
pf12AU6AF：GCCGATCAGTCGTCCGTTCCAGC(SEQ ID NO.16)；
pf12AU6AR：AAACGCTGGAACGGACGACTGAT(SEQ ID NO.17)；
pf12AU6BF：GTTGAGACCAATACTCGAGTATC(SEQ ID NO.18)；
pf12AU6BR：AAACGATACTCGAGTATTGGTCT(SEQ ID NO.19)。
将各组接头分别组合起来与其对应的gRNA表达盒连接，再将各表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH载体进行连接转化入大肠杆菌，接着将连接成功并测序正确的阳性克隆质粒转入农杆菌，然后用农杆菌转化受体材料获得转基因水稻。所述表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH载体框架见附图2。
将表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH连接成功的载体转化大肠杆菌DH10β(购自Invitrogen公司)，筛选正确阳性克隆。采用农杆菌介导的方法将阳性克隆质粒转化至受体材料即pf12的近等基因系BL(pf12-NJ/NJ)，农杆菌菌株为超毒力菌株EHA105(Sun X,CaoY,Yang Z,Xu C,Li X,Wang S,Zhang Q(2004)Xa26,a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv.oryzae in rice,encoding aLRR receptor kinase-likeprotein.Plant J 37:517-527)。
本发明使用上述农杆菌进行遗传转化的主要步骤、培养基及其配制方法如下所述：
(1)试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)
(2)主要溶液配方
1)N6培养基大量元素母液[按照10倍浓缩液(10X)配制]
将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。
2)N6培养基微量元素母液[按照100倍浓缩液(100X)配制]
将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)
将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)和2.78克FeSO4·7H2O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)
加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
7)2,4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取2,4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。
8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：
秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制：
秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
2)继代培养基
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
3)预培养基
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
4)共培养基
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。
5)悬浮培养基
加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。
使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
6)选择培养基
加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。其中，第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升。
7)预分化培养基
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
8)分化培养基
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
9)生根培养基
加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤
4.1愈伤诱导
1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；
2)用灭菌水洗种子4-5次；
3)将种子放在诱导培养基上；
4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
4.2愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
4.3预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
4.4农杆菌培养
1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；
2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
4.5农杆菌侵染
1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；
2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；
3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。
4.6愈伤洗涤和选择培养
1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
2)浸泡在含400毫克/L潮霉素的灭菌水中30分钟；
3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。
4.7分化
1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；
2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
4.8生根
1)剪掉分化时产生的根；
然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
4.9移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
CRISPR敲除转化结果：根据步骤2中的载体构建方法和转基因方法，通过PCR扩增Cas9序列，扩增引物为Cas9-F:GGTCGCCTACCACGAGAAGTACC(SEQ ID NO.20)，Cas9-R:GTGAGGTCCTGGTGGTGCTCGTC(SEQ ID NO.21)；然后PCR扩增用于敲除pf12A的CRISPR编辑靶点所在的基因组片段并测序，引物为53SJF:GTTGAAGTTCAGGTCTATGTC(SEQ ID NO.22)，53SJR:CCTCAGGCTTGTGGTAAC(SEQ ID NO.23)，从中选择出Cas9阴性、pf12A敲除阳性的两个家系，家系一BL(pf12-pf12AKO-1/pf12AKO-1)的靶点1缺失3bp，靶点2缺失5bp，家系二BL(pf12-pf12AKO-2/pf12AKO-2)的靶点1缺失1bp，靶点2缺失15bp，见附图3。
转基因结果：敲除了pf12A基因的材料与BL杂交得到的F1的杂种育性相对于对照材料BL(pf12-BL/NJ)得到恢复，即两个敲除家系与BL杂交的两个F1家系BL(pf12-BL/pf12AKO-1)、BL(pf12-BL/pf12AKO-2)的结实率分别为81％、81％(标准误差不同)，相对于正常籼粳杂合基因型H材料即BL(pf12-BL/NJ)69％的结实率显著上升(附图4)。随后将F1材料BL(pf12-BL/pf12AKO-1)继续种植下一代获得F2，与对照相比其偏分离现象消失(附图4)，籼型纯合：籼粳杂合：粳型纯合接近1:2:1[χ2(1:2:1)＝0.56]，这两处实验结论证明本发明基因是控制pf12位点杂种育性的必需基因。
3.含有pf12A基因区段的DNA片段的分离克隆
分别使用cDNA末端快速扩增(RACE)和PCR引物延伸的方法获得该基因全长cDNA。使用材料为籼稻南京11的cDNA，液氮冷冻后于-70℃冰箱待用。按照TRIZOL说明书所述步骤提取RNA(注：TRIZOL Reagent，Invitrogen Cat.No.15596-018)，稀释浓度至1μg/μl，-70℃保存待用。
RACE具体步骤：使用Clontech的SMARTer 
5’/3’Kit，步骤参照该试剂盒说明书。
5’端RACE引物535RCE 3：CGGCAGCTAGAACAGATGACTGATC(SEQ ID NO.24)；
3’端RACE引物533RCE 3：TCCGGTTGTTGGTTGATGGAGACGG(SEQ ID NO.25)；
UPM：Long(0.4M)：TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ IDNO.26)；
Short(2μM)：CTAATACGACTCACTATAGGGC(SEQ ID NO.27)。
其中UPM由上述试剂盒提供。
获得RACE-Ready-cDNA后快速扩增cDNA末端的PCR反应条件为：
94℃变性30秒，72℃3分钟，5个循环；
94℃变性30秒，70℃退火30秒，72℃延伸3分钟，5个循环；
94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸3分钟，35个循环；
72℃最终延伸7分钟。
5’RACE使用引物UPM+535RCE 3
3’RACE使用引物UPM+533RCE 3
PCR引物延伸扩增法的具体步骤：反转录采用20μL体系，按照DNaseI说明书所述步骤去除RNA中痕量DNA后，按SuperScriptTM II说明书所述步骤操作，产物于-20℃保存待用。(注：Deoxyribonuclease I,Invitrogen Cat.No.18068-015；SuperScriptTMII ReverseTranscriptase，Invitrogen Cat.No.18064-022)使用上述反转录产物1L为模板做PCR。使用KOD FX(TOYOBO Lot:9503069)做PCR，PCR所用试剂均来自KOD FX包装。
对RACE产物测序获得所需全长基因。
实施例2
pf12A基因的结构分析
实施例1中的第3部分获得的结果是pf12A基因在南京11中的全长cDNA为2911bp，其结构由四个外显子和三个内含子组成(附图3)，并且籼稻中有而粳稻中无(附图4)。pf12A基因编码一个596个氨基酸的蛋白质，BLASTp分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)发现该蛋白属于RNase H type-1domain-containing蛋白。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种蛋白质在调控水稻籼粳亚种间杂种不育中的应用，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
3.一种提高水稻籼粳亚种间杂种育性的方法，其特征在于：敲除或抑制水稻中权利要求1所述蛋白的表达和/或活性，选择可以提高水稻籼粳亚种间杂种育性的植株。
4.根据权利要求3所述提高水稻籼粳亚种间杂种育性的方法，其特征在于：所述敲除或抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中的任意一种。
5.根据权利要求4所述提高水稻籼粳亚种间杂种育性的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
6.根据权利要求5所述提高水稻籼粳亚种间杂种育性的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法在水稻基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.7中任意一个所示。
7.一种用于提高水稻籼粳亚种间杂种育性的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够识别权利要求6中所述靶标区域的RNA分子；
(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA的载体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的RNA分子的序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.11任意一个所示。
9.一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQID NO.12或SEQ ID NO.13所示。
10.一种高水稻籼粳亚种间杂种育性的突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示。
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2022
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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