CN115990220A - 一种止咳的中药组合物及其应用、治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药技术领域,尤其涉及一种止咳的中药组合物及其应用和治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂。本发明提供的中药组合物包括炙麻黄2~10份,青风藤6~12份,厚朴3~10份,前胡3~10份,茯苓10~15份,桂枝3~10份,白术6~12份,炙紫菀5~10份,炙款冬花5~10份,炙甘草2~10份,清半夏3~9份和黄连2~5份。本发明提供的中药组合物组方合理,安全性好,诸药合用,宣降共施,寒温并用,肺脾同治,共奏宣肺疏风、化饮止咳之效,尤其对感染后咳嗽寒饮伏肺证或咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证具有较好治疗作用。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域,尤其涉及一种止咳的中药组合物及其应用、治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂及其制备方法。
背景技术
感染后咳嗽(PIC)是指当呼吸道感染的急性期症状消失后,咳嗽仍然迁延不愈,持续3~8周,X线胸片检查无明显异常者称之为PIC,其中以病毒性感冒引起的咳嗽最为常见,又称为“感冒后咳嗽”。咳嗽变异性哮喘(CVA)是哮喘的一种特殊类型,咳嗽是其唯一或主要临床表现,无明显喘息、气促等症状,但存在气道高反应性。其发病机制至今尚未完全明确。感染后咳嗽、咳嗽变异性哮喘均属于中医学“咳嗽”、“久咳”的范畴。中医对咳嗽的认识历史悠久,对其病因、症状、证候、治疗的认识不断丰富,具有优势。我国于2005年首次发布《咳嗽的诊断与治疗指南》(中华医学会呼吸病学分会哮喘学组),并经多次修订,其中2015及2021版指南中增加了中医药内容。相关研究表明咳嗽常见证候类型包括风邪伏肺、寒饮伏肺、肺脾阳虚、湿热郁肺等。此外,《中药新药用于咳嗽变异性哮喘临床研究技术指导原则》(国家药品监督管理局药品审评中心2019年)也明确列出寒饮伏肺证证候类型,对咳嗽的临床、科研及新药研发等方面起到了重要指导作用。
在咳嗽的中医药治疗方面,可见经典名方、临床验方等疗效观察以及针灸、刮痧、拔罐等特色外治法相关报道。但相关研究多存在疾病诊断、研究方法等规范性方面不足,尤其少见高证据级别的随机对照研究,从而影响了研究成果的科学性评价,难以被推广应用和认可。此外,目前上市的临床常用的温肺散寒止咳的中成药,如通宣理肺丸(片、胶囊、颗粒或口服液)、小青龙胶囊(颗粒)、桂龙咳喘宁片(颗粒)及寒喘祖帕颗粒等,功能主治失于宽泛,病证定位不够准确,安全性、有效性等相关资料不全,或证据级别偏低。缺乏针对感染后咳嗽、咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证的专病专药。因此对其深入研究存在必要性,深入开展感染后咳嗽、咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证的中药治疗与新药研究开发对于提高咳嗽的临床疗效及防治水平具有重要意义,同时治疗药物上的改进也是目前亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于弥补现有技术的不足,提供一种止咳的中药组合物及其应用、治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂及其制备方法,有效治疗咳嗽寒饮伏肺证。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种止咳的中药组合物,包括以下质量份的原料:炙麻黄2~10份,青风藤6~12份,厚朴3~10份,前胡3~10份,茯苓10~15份,桂枝3~10份,白术6~12份,炙紫菀5~10份,炙款冬花5~10份,炙甘草2~10份,清半夏3~9份和黄连2~5份。
优选的,所述中药组合物包括以下质量份的原料:炙麻黄6份,青风藤12份,厚朴6份,前胡10份,茯苓15份,桂枝5份,白术12份,炙紫菀10份,炙款冬花10份,炙甘草9份,清半夏9份和黄连3份。
本发明还提供了上述技术方案所述中药组合物在制备治疗咳嗽的药物中的应用。
优选的,所述咳嗽包括咳嗽寒饮伏肺证。
优选的,所述咳嗽寒饮伏肺证包括感染后咳嗽寒饮伏肺证和/或咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证。
优选的,所述感染后咳嗽寒饮伏肺证和/或咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证由感冒、冷空气、灰尘、油烟等一种或多种因素诱发。
优选的,所述药物的剂型包括胶囊制剂、颗粒剂、片剂、散剂或汤剂。
本发明还提供了一种治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂,所述颗粒剂包括上述技术方案所述的中药组合物和辅料。
优选的,所述辅料包括麦芽糊精。
本发明还提供了上述技术方案所述的颗粒剂的制备方法,包括如下步骤:
将中药原料混合,得到中药混合物;
将所述中药混合物和体积百分含量60%的乙醇溶液按照1:3的质量比混合,浸泡4h后,得到待提取液;
将所述待提取液和体积百分含量60%的乙醇溶液按照1:3的质量比混合,提取1.5h,得第一提取液和第一药渣;
将所述第一药渣和水按照1mg:10mL的质量体积比混合,提取1.5h,得第二提取液;
将所述第一提取液和第二提取液混合,回收乙醇,浓缩、干燥,得提取物;
将所述提取物和辅料按照1:1的质量比混合,制粒,得到所述颗粒剂。
有益效果:
本发明提供了一种止咳的中药组合物,包括炙麻黄2~10份,青风藤6~12份,厚朴3~10份,前胡3~10份,茯苓10~15份,桂枝3~10份,白术6~12份,炙紫菀5~10份,炙款冬花5~10份,炙甘草2~10份,清半夏3~9份和黄连2~5份。本发明提供的中药组合物中,炙麻黄,辛微苦温,主入肺经,善于宣肺止咳;青风藤,苦、辛、平,善于祛风通络,两药相须为用,宣肺疏风,共为君药。炙紫菀、炙款冬花,均为辛苦温之品,润肺降气,化痰止咳,善治肺寒咳嗽;桂枝,辛甘温,温阳化气;茯苓,甘淡平,健脾利湿化饮;白术,甘苦温、健脾祛湿,以上诸药相合,温阳化饮,助君药宣肺化饮、降逆止咳,共为臣药。前胡,苦辛微寒,降气化痰;清半夏,辛温,燥湿化痰;厚朴,苦辛温,降气化痰,以上诸药均入肺经,利肺降气,助君臣药止咳之功。黄连,苦寒,清热燥湿,配清半夏、厚朴以辛开苦降,调畅气机;亦取其苦寒之性,以佐制诸药辛温燥烈之弊。以上诸药,共为佐药。炙甘草,甘平,补脾益气,祛痰止咳,调和诸药,为使药。诸药合用,宣降共施,寒温并用,肺脾同治,共奏宣肺疏风、化饮止咳之效。临床研究表明本发明中药组合物治疗咳嗽寒饮伏肺证具有良好的临床疗效及安全性。实验结果显示,本发明中药组合物可通过抑制NF-κB通路,抑制寒冷刺激通道TRPA1的表达,减轻气道炎症,进而降低咳嗽敏感性,起到止咳作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为应用例1-1造模流程图;
图2为各组豚鼠给药干预结束后第2天咳嗽次数,其中,与寒饮组相比,*P<0.05,**P<0.01;
图3为各组豚鼠给药第1、3、5、7天各组豚鼠咳嗽次数变化趋势;
图4为各组豚鼠肺组织切片HE染色的病理结果(×100),标尺为50μm;
图5为各组豚鼠WB法测定气管组织中TRPA1、SP、NKA的蛋白表达结果;
图6为各组豚鼠WB法测定肺组织中TRPA1、SP、NKA的蛋白表达结果;
图7为应用例2-1各组豚鼠肺组织切片HE染色的病理结果(×100);
图8-1和图8-2为各组豚鼠肺组织中NF-κB、p65、IκB-α蛋白表达检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种止咳的中药组合物,包括以下质量份的原料:炙麻黄2~10份,青风藤6~12份,厚朴3~10份,前胡3~10份,茯苓10~15份,桂枝3~10份,白术6~12份,炙紫菀5~10份,炙款冬花5~10份,炙甘草2~10份,清半夏3~9份和黄连2~5份。
以质量份计,在本发明中,所述止咳的中药组合物包括炙麻黄2~10份,优选为6份。本发明所述炙麻黄为辛微苦温,主入肺经,善于宣肺止咳。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括青风藤6~12份,优选为12份。本发明所述青风藤苦、辛、平,善于祛风通络。
本发明以炙麻黄和青风藤共为君药,相须为用,宣肺疏风。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括炙紫菀5~10份,优选为10份。本发明所述炙紫菀为为辛苦温之品,润肺降气,化痰止咳,善治肺寒咳嗽。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括炙款冬花5~10份,优选为10份。本发明所述炙款冬花为辛苦温之品,润肺降气,化痰止咳,善治肺寒咳嗽。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括茯苓10~15份,优选为15份。本发明所述茯苓甘淡平,健脾利湿化饮。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括桂枝3~10份,优选为5份。本发明所述桂枝辛甘温,温阳化气。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括白术6~12份,优选为12份。本发明所述白术甘苦温、健脾祛湿。
本发明以炙紫菀、炙款冬花、桂枝、茯苓和白术共为臣药,诸药相合,温阳化饮,助君药宣肺化饮、降逆止咳。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括前胡3~10份,优选为10份。本发明所述前胡苦辛微寒,降气化痰。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括清半夏3~9份,优选为9份。本发明所述清半夏辛温,燥湿化痰。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括厚朴3~10份,优选为6份。本发明所述厚朴苦辛温,降气化痰。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括黄连2~5份,优选为3份。本发明所述黄连苦寒,清热燥湿。
本发明以前胡、清半夏、厚朴和黄连共为佐药,前胡、清半夏和厚朴均入肺经,利肺降气,助君臣药止咳之功,黄连配清半夏、厚朴以辛开苦降,调畅气机,亦取其苦寒之性,以佐制诸药辛温燥烈之弊。
在本发明中,以炙麻黄质量份为基准,所述止咳的中药组合物包括炙甘草2~10份,优选为9份。本发明所述炙甘草为使药,甘平,补脾益气,祛痰止咳,调和诸药。
本发明中药组合物原料安全,配方合理,炙麻黄开宣肺气止咳平喘,厚朴理气宽胸,前胡疏风降气化痰,三者合用共奏疏风利肺之效,茯苓、桂枝、白术、炙甘草以温肺化饮,兼温健脾阳,紫苑、款冬花润肺化痰止咳,诸药合用,共奏温肺化饮,疏风止咳之效。
本发明还提供了上述技术方案所述中药组合物在制备治疗咳嗽的药物中的应用。
在本发明中,所述咳嗽优选包括咳嗽寒饮伏肺证,进一步优选包括感染后咳嗽寒饮伏肺证和/或咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证。本发明所述感染优选包括感冒感染、冷空气感染、灰尘感染和油烟感染中的一种或多种;所述药物的剂型优选包括胶囊制剂、颗粒剂、片剂、散剂或汤剂,进一步优选为颗粒剂。本发明以上述技术方案所述的中药组合物为活性成分制备的药物,具有疏风温肺止咳的作用,尤其对感染后咳嗽寒饮伏肺证和咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证具有突出治疗作用。
本发明还提供了一种治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂,所述颗粒剂包括上述技术方案所述的中药组合物和辅料。在本发明中,所述辅料优选包括麦芽糊精。
本发明还提供了上述技术方案所述的颗粒剂的制备方法,包括如下步骤:
将中药原料混合,得到中药混合物;
将所述中药混合物和体积百分含量60%的乙醇溶液按照1:3的质量比混合,浸泡4h后,得到待提取液;
将所述待提取液和体积百分含量60%的乙醇溶液按照1:3的质量比混合,提取1.5h,得第一提取液和第一药渣;
将所述第一药渣和水按照1mg:10mL的质量体积比混合,提取1.5h,得第二提取液;
将所述第一提取液和第二提取液混合,回收乙醇,浓缩、干燥,得提取物;
将所述提取物和辅料按照1:1的质量比混合,制粒,得到所述颗粒剂。
本发明对所述提取的时间没有严格要求,常规操作即可。本发明所述制粒优选为干法制粒,进一步使用干法制粒机。本发明在具体制备所述治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂委托河北晨光神农医药科技有限公司生产。
为了进一步说明本发明,下面结合实施例和附图对本发明提供的止咳的中药组合物及其应用和治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.按照以下质量份备料:炙麻黄6份,青风藤12份,厚朴6份,前胡10份,茯苓15份,桂枝5份,白术12份,炙紫菀10份,炙款冬花10份,炙甘草9份,清半夏9份和黄连3份(具体为炙麻黄7.68kg、青风藤15.36kg、前胡12.8kg、厚朴7.68kg、茯苓19.2kg、白术15.36kg、桂枝6.4kg、炙紫苑12.8kg、炙冬花12.8kg、清半夏11.52kg、黄连3.84kg、炙甘草11.52kg,共计136.96kg)。
2.将上述原料制备成颗粒剂,由河北晨光神农医药科技有限公司生产,具体由如下步骤组成:
将上述原料混合,先加入3倍量体积百分含量60%的乙醇溶液(410.88kg)浸泡4小时,之后又加入9倍量体积百分含量60%的乙醇溶液(1232.64kg),回流提取1.5h,过滤;药渣加入10倍量水(1369.6L)回流提取1.5h,过滤,两次滤液合并,浓缩,干燥成干浸膏,所得干浸膏重量为32.1kg。
将干浸膏进行粉碎得浸膏粉约30.5kg,与麦芽糊精按照1:1的质量比混合后使用干法制粒机进行制粒,得56kg颗粒,按8g/袋进行分装,得到颗粒剂(记为疏风温肺止咳方),最终得到成品7000袋。
对比例1
按照实施例1的方式备料并制备,区别在于,桂枝3份。
对比例2
按照实施例1的方式备料并制备,区别在于,不含青风藤。
应用例1-1
疏风温肺止咳方对感染后咳嗽寒饮伏肺证的治疗效果-动物实验
1实验材料
1.1实验动物
24只2周龄SPF级雄性健康Hartley豚鼠,购于北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2016-0011),体重200~250g,饲养于北京中医药大学东方医院。饲养条件:SPF级动物房,温度22±2℃,湿度60%,光照时间白昼12小时、黑夜12小时。
1.2主要实验试剂、药品及仪器
表1主要实验试剂、药品及仪器
2实验方法
2.1动物分组
24只SPF级豚鼠适应性饲养3天后,采用随机数字表的方法将其随机分为空白组、PIC寒饮伏肺模型组(以下简称寒饮组)、西药组、中药组4组,每组6只。正常SPF级豚鼠饲料喂食及喂水。
2.2动物造模
适应性喂养3天后,按照图1流程造模。其中空白组不做任何处理,正常饮食进水,其他各组豚鼠按照以下方法干预。
2.2.1烟熏
造模期间第4~10天,模型组、中药A~C组及西药组放置于自制烟熏箱中,以电动鼓风机持续送烟,烟熏15分钟,13只烟/日,共7天(参照文献1(朱竟赫,赵金明,秦文艳,等.白射干素对烟熏及感染后豚鼠止咳作用及血细胞因子的影响[J].中华中医药学刊,2016,34(12):2902-2904)和文献2(仲坤,齐越,李昭,等.感染后咳嗽大鼠模型建立研究[J].辽宁中医药大学学报,2019(2):4.))。
2.2.2病证结合模型的建立
造模期间第11、14、17天,除去空白组外,将其他各组豚鼠乙醚浅麻醉后0.4mg/mL的脂多糖溶液以1ml/kg的体积滴入鼻腔;造模期间第12、13、15、16天,将各组豚鼠置于自制动物雾化箱内,用0.8mol/L柠檬酸雾化3min,每日1次激发豚鼠咳嗽,综合烟熏、脂多糖滴鼻及柠檬酸雾化法建立感染后咳嗽豚鼠咳嗽高敏感性疾病模型。并在上述操作的基础上适应性喂养第3日结束后将各组豚鼠置于气温为0℃的寒冷环境中3h/天,并持续喂食冰水12小时/天,施加“形寒+饮冷”刺激14天,建立感染后咳嗽寒饮伏肺证病证结合模型。每日观察各组豚鼠状态,并于造模结束后24小时内用0.8mol/L柠檬酸雾化3min,测定5min内的咳嗽次数。
2.3动物给药
给药自豚鼠造模结束后第2天开始,每日1次,连续7日。空白组及寒饮组给予纯水灌胃;西药组予复方甲氧那明4.65mg/kg·d灌胃;中药组灌胃实施例1得到的疏风温肺止咳方,按人豚鼠体表面积换算法,给药量按生药量计算约为5.5g/kg·d。
2.4动物标本制备
豚鼠给药7d后进行如下操作:
2.4.1血清
乌拉坦麻醉豚鼠行气管插管上机测定豚鼠气道阻力后,将豚鼠从小动物用肺功能仪上取出置于鼠板上。打开豚鼠腹腔,暴露腹主动脉,用采血针行腹主动脉取血,采血针另一端连接采血管。静置2h后,4℃离心机3000r/min离心10min,分离血清,-20℃冰箱保存。
2.4.2肺泡灌洗液
腹主动脉取血处死豚鼠后,开胸暴露豚鼠气管及肺脏,止血钳夹闭右侧肺门。5mL注射器吸取5mL0.9%生理盐水后连接气管插管接口,经气管将生理盐水缓慢注入左肺,行左肺肺泡灌洗,注入完毕停留30s后回吸,收集回吸的肺泡灌洗液。重复上述步骤2次,共累计回吸3次肺泡灌洗液,记录回吸总量。将取得的肺泡灌洗液4℃离心机3000r/min离心10min,分离上清
液,-80℃冰箱保存。
2.4.3肺及气管组织
肺泡灌洗液制备结束后,止血钳夹闭左侧肺门,松开右侧肺门。暴露心脏,连接注射器的灌注针插入右心室后用止血钳固定,于左心耳剪一切口,经右心室行肺循环灌流0.9%氯化钠溶液,直至灌流出的液体澄清结束灌注。剪下整个右肺及部分气管,置于培养皿中,分离右肺各叶,取右肺中叶,将其置于4wt.%多聚甲醛溶液中固定48h;将其余各肺叶组织剪成黄豆粒大小放入冻存管中,置于液氮中,后转移至-80℃冰箱保存。
2.5相关指标检测
2.5.1基于病证结合的一般情况观察
各组豚鼠给药干预结束后第2天,西药组饲养过程中死亡1只,死亡豚鼠出现毛发凌乱,四肢不温,精神萎靡。并参照(Daoui S,Ahnaou A,Naline E,et al.Tachykinin NK(3)receptor agonists induced microvascμLar leakage hypersensitivity in theguinea-pig airways.[J].European Jour-nal ofPharmacology,2001,433(2-3):199-207.)观察个处理组豚鼠行为学症状和体征,结果如表2所示。
表2各组豚鼠行为学症状和体征严重程度统计
注:(-)表示无此症状和体征,(+)表示有此症状和体征,(+)个数越多表示该症状越严重,(+-)表示此症状体征在(-)和(+)之间,(++-)表示严重程度介于(+)和(++)之间。
根据表2可以看出,空白组的症状体征未见任何异常,寒饮组诸症状体征均出现明显异常征象,兼具感染后咳嗽疾病模型及寒饮伏肺证型模型特点,根据这一症状体征的综合评价模式首先可验证造模成功。其次中药组与西药组的形体消瘦、精神萎靡等疾病常见症状体征严重程度无明显区别,咳嗽症状中药组也较西药组轻,程度差异主要集中在四肢不温、口鼻白色粘性分泌物、小便清长、大便稀溏等寒饮伏肺的相关表现上。从中药组与西药组的差异可看出,西药组(阿斯美)可解决以咳嗽为主要症状特征的疾病组学状态,仅针对疾病,而对寒饮伏肺证相关状态特征改善不明显;而中药组对疾病及证型相关症状体征状态均有显著疗效,也说明本发明得到的颗粒剂既针对疾病又针对证型,对疾病及证型具有双重靶点。
2.5.2咳嗽次数
各组豚鼠给药干预结束后第2天,将其置于自制雾化箱内,雾化吸入0.8mo1/L柠檬酸溶液。豚鼠出现明显的腹部收缩伴伸脚、伸颈、张口甚则伴有清脆咳嗽声等特征性表现时,则可记录咳嗽次数1次,观测记录5min(含雾化时间3min)内咳嗽的总次数,结果如表3和图2,服药第1、3、5、7天各组豚鼠咳嗽次数变化趋势如图3所示。
注:与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与寒饮组比较#P<0.05,##P<0.01;与西药组比较△P<0.05,△△P<0.01,下同。
根据表3和图2~3可以看出,本发明得到的颗粒剂对咳嗽敏感性有显著疗效,中药组及西药组得咳嗽半数缓解天数均小于3天,西药组与寒饮组比较咳嗽次数虽然降低,但不及中药组疗效明显,中药组总体疗效优于西药组。
2.5.3肺组织病理
(1)将取下的新鲜肺组织置于4%多聚甲醛溶液中固定1周后将其取出,置于包埋盒中,流水过夜;(2)脱水:将上步中的肺组织置于脱水机中常规脱水12h左右;(3)石蜡包埋:将脱好水的肺组织放入装有石蜡的包埋盒中,于石蜡包埋机的冷却台上冷却;(4)切片:用切片机将被石蜡包埋好的肺组织切成厚度为5um左右的切片;(5)HE染色:①脱蜡复水:将切片放入二甲苯溶液中脱蜡后经不同浓度乙醇及蒸馏水复水,具体方法:将切片置于二甲苯溶液中浸泡10min,更换二甲苯溶液再浸泡10min,后置于无水乙醇中浸泡3min,更换无水乙醇再浸泡2min,95%乙醇浸泡3min,更换新的95%乙醇再浸泡3min,90%乙醇浸泡3min,85%乙醇浸泡3min,蒸馏水3min,更换蒸馏水再浸泡3min;②染色:将切片先后放入苏木素溶液、伊红溶液中染色:将切片置于苏木素溶液10min,后用清水缓慢冲洗15min,随后将切片置于1%盐酸乙醇溶液10s,见切片变淡红立即用清水冲洗30min使其恢复蓝色,最后将切片置于伊红溶液中30s,取出用清水冲洗30s;③脱水、透明:将切片放入由低到高浓度的乙醇溶液中脱水:85%乙醇2min,90%乙醇2min,95%乙醇2min,无水乙醇5min,更换无水乙醇再浸泡5min,二甲苯溶液5min,更换二甲苯溶液再浸泡5min;④封片:取1滴中性树胶滴于已透明的切片上,盖上盖玻片封片;(6)光镜下观察HE染色后肺组织切片的形态学改变,根据上皮损伤、粘膜下水肿、炎症浸润程度判断炎症严重程度,结果如图4所示。
根据图4可以看出,空白组肺泡壁正常,无明显增厚,肺泡之间的连接结构清晰,未见炎症细胞浸润与出血,支气管管腔内光滑,黏膜上皮较为完整,黏膜壁无增生及炎性细胞浸润。寒饮组肺泡壁增厚,并可见大量炎症细胞浸润,支气管管腔狭窄,局部支气管管壁不完整,有上皮细胞脱落,提示炎症存在,建模成功。西药组及中药组支气管管壁增厚,有炎性细胞浸润,但整体较寒饮组有改善。本发明颗粒剂降低咳嗽敏感性的原因,可能与下气道炎症水平降低有关。
2.5.4ELISA法检测血清中IL-8、IL-1β水平
每组取6只豚鼠,分别采用IL-8、IL-1β试剂盒检测血清IL-8、IL-1β水平,严格按照试剂盒说明书规范操作,结果如表4。
根据表4可以看出,西药组和中药组通过降低血清炎症因子水平达到止咳作用
2.5.5ELISA法检支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中TRPA1、SP、NKA水平
每组取6只豚鼠,分别采用TRPA1、SP、NKA ELISA试剂盒检测BμlF中TRPA1、SP、NKA水平,严格按照试剂盒说明书规范操作,结果如表5。
表5各组豚鼠BALF中TRPA1、SP、NKA水平(X±S)
根据表5可以看出,西药组和中药组西药组及中药组BALF中TRPA1、SP、NKA表达均下降,可对冷通道TRPA1及其介导的气道神经源性炎症有一定抑制作用。
2.5.6RT-PCR法检测气管及肺组织TRPA1、SP、NKAmRNA表达
2.5.6.1按照表4设计引物
表6引物序列
2.5.6.2总RNA提取
(1)取肺或气管组织加入液氮进行充分研磨粉碎;(2)将肺或气管组织研磨充分并向其中加入1mLTrizol混匀后放入1.5mLEP管中,室温静置5分钟,使其完全裂解;(3)加入500μL氯仿至1.5mLEP管中,振荡混匀后,室温静置5分钟;(4)离心机4℃,12000rpm离心10分钟,这时离心管中组织会分为3层,小心吸取上层无色水相于一新的1.5mL不含RNase的EP管中;(5)于EP管中加入异丙醇700μL充分混匀,室温静置10分钟;(6)离心机4℃,12000rpm离心10分钟,弃上清,留取沉淀;(7)于沉淀中加入1mL75%乙醇,振荡混匀,重悬沉淀;(8)离心机4℃,8000rpm离心5分钟,弃掉上清,室温晾干;(9)取50μLDEPC水溶解RNA沉淀,用于RNA质量检测和逆转录。
2.5.6.3总RNA质量检测
2.5.6.3.1RNA浓度和纯度测定
使用核算浓度测定仪测定RNA浓度和纯度,测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零,操作方法如下:(1)抬起样品臂,把样品加到检测基座上;(2)放下样本臂,使用电脑上的软件开始吸光值检测。在上下两个光纤之间会自动拉出一个样品柱,然后进行检测;(3)检测完成后,抬起样品臂,并用干净的无尘纸把上下基座上的样品擦拭干净;(4)浓度测定:样品RNA浓度计算公式为:A260*稀释倍数*40ng/μL;(5)纯度检测:RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法,比值范围1.8到2.0则说明纯度较好。
2.5.6.3.2RNA完整行检测
琼脂糖凝胶电泳法检测检测RNA完整性:
制胶:称取1g琼脂糖加入75mLDEPC水后于微波炉中加热至沸腾30s,中间摇晃数次,待冷却至60℃加入10ml的10×电泳缓冲液、18ml甲醛溶液。灌制凝胶板,凝胶后取下梳子,将凝胶版插入电泳槽中,加入1×电泳缓冲液至超过胶面数毫米。(10×电泳缓冲液:0.4M PH值为7.0的MOPS、0.1M乙酸钠和0.01M EDTA)
准备RNA样品:取3μg RNA,加入3倍体积的甲醛上样染色,加入溴化乙锭至终浓度为10μg/ml。70℃水浴15min使样品变性。
加样前凝胶先预电泳5min,后加入样品至上样孔,7.5V/cm电压2h行稳压电泳,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2~3cm时结束。
电泳结束后凝胶成像系统上拍照观察。
2.5.6.3.3逆转录
本实验使用ABI-Invitrogen的SuperScript III逆转录试剂盒,按照试剂盒说明书规范操作,具体步骤如下:
1)取RNA沉淀200ng、Oligo-dT Primer 1μL、Random Primer 1μL到1.5mLEP管中建立反应体系1,混匀、离心后,将其置于水浴箱中65℃水浴5分钟,结束后置于冰上(RNA沉淀均取200ng,若体积不足10μL,补加ddH2O)。
(2)在反应体系1中加入10uM的dNTP 1μL、0.1M DTT 2μL、5×Buffer 4μL、逆转录酶1μL到1.5mLEP管中建立反应体系2,混匀、短暂离心后,将其置于水浴箱中42℃水浴60分钟,取出后85℃反应10分钟以灭火逆转录酶,反应结束后进行PCR检测或将产物置于-20℃保存待用。
2.5.6.3.4聚合酶链式反应
(1)取cDNA2μL、qPCRmix 10μL、primer F 1μL、primer R 1μL、ddH2O 6μL到1.5μLEP管中建立扩增体系;(2)体系混匀后,瞬离一下,置于荧光定量PCR仪上,按照以下条件进行扩增反应:95℃预变性5min,95℃变性10s,58℃退火20s,72℃延伸20s,共40次循环扩增。扩增反应结束后按95℃反应15s,60℃反应60s,95℃反应15s建立PCR产物的溶解曲线。
2.5.6.3.5计算
采用2-△△CT法计算待测基因的相对表达量:
相对表达量=2a^-[,其中a=-(待测目的基因平均CT值-待测内参基因平均CT值)(对照目的基因平均CT值-对照内参基因平均CT值)],结果如表7和表8。
根据表7和表8可以看出,中药组及西药组TRPA1、SP、NKA基因较寒饮组均降低,可对冷通道TRPA1及气道神经源性炎症相关神经肽有一定的抑制作用,中药组平均作用水平更优。
2.5.7WB法检测肺组织及气管组织TRPA1、SP、NKA蛋白表达
2.5.7.1蛋白提取
取5mm×5mm×5mm左右大小的肺组织,将其剪碎,加入液氮进行研磨,加入5倍体积的蛋白提取液进行肺组织匀浆,裂解30min中,将含有蛋白提取液的组织匀浆装入1.5mL EP管中并加入少量蛋白酶抑制剂,4℃离心机12000r/min离心15min,吸取上清液,分装于0.5ml的离心管中进行蛋白浓度测定。
2.5.7.2蛋白浓度测定
采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度:
(1)用PBS稀释浓度为1.5mg/ml的BSA标准品:最终稀释浓度为0μg/ml,75μg/ml,150μg/ml,300μg/ml,600μg/ml,900μg/ml,1200μg/ml,1500μg/ml。(2)配制BCA工作液:A:B=50:1,工作液的总量=(标准品数+待测样品数量)×复制数×每孔所需的BCA工作液量。(4)取不同浓度的标准品和待测样品稀释液各20μL至各微孔板中,再分别加入200μL工作液,混匀。(5)密封,37℃温浴30min。(6)酶标仪562nm下测定各样品和BSA标准品的吸光度值,以BSA标准品浓度为横坐标,测出的OD值为纵坐标,绘制出标准曲线。样品浓度计算方法:根据测得的样品的吸光值,在标准曲线上找出对应的蛋白含量,除以样品稀释液总体积,乘以样品稀释倍数,即为样品实际浓度。
2.5.7.3SDS-PAGE电泳
(1)将玻璃板清洗干净并风干后,将玻璃板对齐放入夹中卡紧,避免漏胶。
(2)配制10%分离胶10ml:4ml去离子水,2.5mL1.5M LTris-HCI(pH8.8),3.3mL30%丙烯酰胺,100μL 10%过硫酸铵,100μL 10%SDS和4μLTEMED。
(3)用1ml移液器将配好的分离胶沿玻璃板右上角缓慢均匀灌胶,注意避免产生气泡,灌胶至距离绿色中间线高度即可。灌胶结束后在胶面上加一层1cm左右厚度的水进行水封,静置30min等待胶凝。当水和胶体之间有一条明显折痕时说明胶已凝,随即把水倒掉,并用滤纸吸干残余去离子水,准备灌注浓缩胶。
(4)配制5%浓缩胶5ml:3.4mL去离子水,0.63mL 1M LTris-HCI(pH 6.8),0.83mL30%丙烯酰胺,50μL 10%过硫酸铵,50μL 10%SDS和5μLTEMED。
(5)浓缩胶制作结束后立即灌胶,将剩余部位填满后插入梳子,静置30min等待凝胶。
(6)凝胶后捏住梳子上部,垂直向上拔出梳子。用去离子水冲洗每个上样孔以排空里面的空气。将SDS-PAGE胶板放入电泳槽内,短板向内,长板向外,内外槽内均加入电泳缓冲液,其中内槽加满,内外槽电泳液要形成高度差。
(7)样品处理:根据蛋白定量结果,将待测样品用与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液混合,95℃水浴5min使蛋白变性,4℃离心机10000r/min离心5min,取上清。
(8)上样:在最右边一孔加入5μLMaker,其余各孔一次加入各样品,每孔10μL。
(9)电泳:上样结束后,电泳仪接通电源,浓缩胶电压选80V,至样品跑至浓缩胶与分离胶分界处时进入分离胶,此时改电压为120V,继续电泳约2h,当观察到染色条带跑至距胶底部0.5cm时停止电泳。
2.5.7.4转膜
(1)准备PVDF膜,并将其放入甲醛溶液中浸泡2min使其活化,依次用水和电转液漂洗2次,每次2min,后置于电转液中备用。
(2)剪与凝胶大小相近的6张滤纸,将它们以及转膜用的夹板、两块海绵垫放入电转液中。
(3)电泳结束后,取下电泳板,小心取出板中的垫片及去掉上层玻璃板,切除浓缩胶,将剩余胶用电转也漂洗一次。
(4)将转膜用的夹板打开,黑色面保持水平,其上依次放入海绵垫(用玻璃棒擀几次,以赶走气泡)、3层滤纸(用玻璃棒赶走气泡)、分离胶(与滤纸对齐,用玻璃棒赶走气泡)、PVDF膜(将膜盖满整个胶面,放下后不可再移动并用玻璃棒赶走气泡)、3层滤纸、另一张海绵垫。放置好后,用玻璃棒擀几下后将关闭夹板。
(5)将转膜夹板放入装有电转液的转移槽中,使夹板黑色面对槽的黑面,夹板的白色棉对槽的红色面,即黑色板按入负极,白色板按入正极。
(6)将槽放入冰水中,接通电源,恒压状态下,100v转膜2h。
(7)将转好的膜对照Maker进行剪裁。
2.5.7.5免疫印记
(1)封闭:用脱脂奶粉和TBST配制5%脱脂奶粉作为封闭液,小心取出转移膜,将其置于封闭液中,室温摇床慢摇1h。
(2)一抗反应:分别以TRPA1 Antibody(货号:NB110-40763,品牌:NOVUS)、Substance PAntibody(货号:DF7522,品牌:Affinity)和NKAAntibody(货号:ab239503,品牌:Abcam)为一抗,用TBST稀释一抗,将封闭之后的膜放入稀释后的一抗中,室温脱色摇床水平摇动15min后置于4℃冰箱过夜。
(3)洗脱:将膜取出,用TBST洗膜,洗去未结合的一抗,洗3次,每次10min。
(4)二抗反应:以GoatAnti-Rabbit IgG H&L(HRP)(货号ab6721,品牌Abcam)为步骤(2)三种一抗的共同二抗,用TBST将二抗稀释300倍,将洗脱后的膜放入二抗稀释液中,室温摇床慢摇1h(注意避光)。
(5)洗脱:将膜从二抗稀释液中取出,用TBST洗膜,洗去未结合的二抗,洗3次,每次10min。
2.5.7.6显影与分析
(1)准别BCL试剂盒,将试剂盒中A液和B液两种显色液在保鲜膜上等体积混匀。
(2)将PVDF膜从二抗稀释液中取出,用TBST洗膜,洗去未结合的二抗,正面朝上放在实验台上,用移液器将混合好的显影液均匀涂在膜上,室温作用4分钟。抖掉膜上液体,将其放入化学发光成像系统成像并拍照,结果图5和图6。
(3)用Image J软件,对将采集好的图片中的目标条带的灰度值进行分析,目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值即为目的蛋白的相对表达量,结果如表9和表10。
根据9和表10可以看出,西药组及中药组均可降低TRPA1、SP、NKA蛋白表达(P<0.01或P<0.05),但从平均水平看,中药组肺及气管组织的TRPA1、SP、NKA蛋白表达表达低于西药组。中药组对冷通道TRPA1及气道神经源性炎症相关神经肽平均抑制作用优于西药组。
应用例1-2
疏风温肺止咳方对感染后咳嗽寒饮伏肺证的治疗效果-临床实验
1、病例来源
2020年12月-2021年11月在北京中医药大学东方医院呼吸科就诊的感染后咳嗽患者,共纳入患者72例。其中试验组36例,对照组36例,由于病例脱落原因,71例患者进入FAS、PPS集、SS集(试验组35例,对照组36例)。具体人口学资料如表11所示。
表11人口学资料(FAS)
2、诊断标准
2.1西医诊断标准
感染后咳嗽诊断参照中华医学会呼吸病学分会哮喘学组发布的《咳嗽的诊断与治疗指南》(2015版)制定。临床表现:刺激性干咳,无痰或少量白粘痰,具体诊断标准如下:
(1)呼吸道急性症状消失后的3-8周,仍表现有刺激性干咳,无痰或少量白粘痰;(2)胸部X线检查无明显异常;(3)排除其他可能引起咳嗽的病因。
2.2中医辨证标准
目前关于感染后咳嗽的寒饮伏肺证型无明确判断标准,根据感染后咳嗽的疾病表现,参照《中医证候鉴别诊断学》、《中华人民共和国国家标准·中医临床诊治术语证候部分》、中华医学会呼吸病学分会哮喘学组发布的《咳嗽的诊断与治疗指南》(2021)中医部分、临床实践及既往研究拟定。
寒饮伏肺证:阵咳,痰少清稀,咽痒,畏寒怕冷,背冷,遇冷易咳,舌淡,苔薄滑,脉紧。由副主任职称以上临床医生根据此标准进行辨证。
3、选择病例的标准
3.1受试者纳入标准
(1)临床诊断为感染后咳嗽;(2)中医辨证为寒饮伏肺证;(3)年龄18~65周岁;(4)自愿参加本项临床试验,并签署知情同意书。
3.2受试者排除标准
(1)其他病因引起的亚急性咳嗽(上气道咳嗽综合征、胃食管反流性咳嗽、嗜酸粒细胞性支气管炎、CVA等);(2)ALT、AST>正常参考值上限1.5倍或Scr>正常参考值上限;(3)有长期酗酒或药物滥用史;(4)合并有严重心血管、脑血管或造血系统等严重疾病;(5)有智力障碍或精神障碍;(6)妊娠、哺乳期妇女;(7)对试验药物成分有过敏史;(8)近1月内服用过与试验药物功能主治类似药物患者;(9)近3月内参加其他药物临床试验者。
4、治疗方案
试验组:服用实施例1制备得到的颗粒剂,1次2袋(1袋8g),1日3次,温开水冲服;
对照组:服用安慰剂(5wt.%实施例1制备得到的颗粒剂和95%基质辅料(调味糖浆粉1.5g、麦芽糊精6.491g和苦味剂0.009g组成)混合颗粒剂),1次2袋(1袋8g),1日3次,温开水冲服,混合颗粒剂由河北晨光神农医药科技有限公司生产;
治疗的时间30天,必要时可延长至45天。
5、治疗效果
5.1根据基线及访视两周咳嗽症状积分表及患者日记卡,评价咳嗽消失/基本消失时间,咳嗽消失/基本消失时间率、止咳起效时间及咳嗽VAS评分,其中
(1)咳嗽症状积分:参照《咳嗽的诊断及治疗指南》(2015版),采用咳嗽症状积分表作为研究工具。从首次服药开始,患者每天对咳嗽严重程度进行2次评价,早晨起床后(7:00~9:00)对前一夜咳嗽严重程度进行评价,晚上睡觉前(19:00~21:00)对白天咳嗽严重程度进行评价。具体评分标准如下表12。
表12咳嗽症状积分表
(2)咳嗽VAS评分:参照《咳嗽的诊断及治疗指南》(2015版)采用咳嗽VAS作为研究工具。由患者根据自己的感受在标记0~10cm的直线上划记相应刻度以表示咳嗽的程度。评价患者近1天的整体情况。每晚睡觉前(19:00-21:00)评价,0表示无咳嗽,10表示患者咳嗽最严重的程度。
评价结果结果如表13~16。
表13咳嗽消失/基本消失时间比较(PPS)
注:咳嗽未消失者按14天计算,下同。
表14止咳起效时间比较(PPS)
表15咳嗽消失率比较(PPS)
表16咳嗽VAS评分比较(PPS)
根据表13~16可以看出,本发明疏风温肺止咳方对感染后咳嗽寒饮伏肺证的咳嗽症状症状疗效明确,咳嗽消失率高,起效及咳嗽消失/基本消失时间明显缩短。
5.2生活质量疗效评价
参照《咳嗽的诊断及治疗指南》(2015版)采用中文版LCQ评分作为研究工具,评分结果如表17~19。
表17中文版LCQ总评分比较(PPS)
表18治疗前后躯体、心理、社交量表评分比较(PPS)
表19同组治疗前后躯体、心理、社交量表评分比较(PPS)
根据表17~19可以看出,治疗7天及治疗14天两组患者的中文版LCQ评分治疗组均较对照组显示出显著差异,可见疏风温肺止咳方在对咳嗽症状有效缓解的同时,也提高了患者的生活质量。
5.3中医证候疗效评价
中医症状评分参照《中医证候鉴别诊断学》、《中华人民共和国国家标准·中医临床诊治术语证候部分》、中华医学会呼吸病学分会哮喘学组发布的《咳嗽的诊断与治疗指南》(2021)中医部分、临床实践及既往研究拟定,具体评分标准如表20,采用50%减分率法及尼莫地平法比较好转率和疗效指数,结果如表21。
表20中医症状评分表
表21临床好转率比较(PPS)
表22疗效指数比较(PPS)
根据表21和22记载的内容可以看出,通过50%减分率法,治疗组的临床好转率为68.60%,对照组为33.33%,经卡方检验,二者统计学具有显著差异,治疗组的临床好转率明显高于对照组;通过尼莫地平法,治疗组痊愈18例、显效3例、好转9例、无效5例,愈显率为60.00%,有效率为83.71%;对照组痊愈6例、显效2例、好转9例、无效19例,愈显率为22.22%,有效率为47.22%,经秩和检验,二者统计学具有显著差异,治疗组的愈显率及有效率均明显高于对照组。本发明实施例1得到的疏风温肺止咳方在中医证候疗效方面明显优于对照组
5.4安全性评价
本应用例实施过程中按照研究方案规定出现反馈的不适症状及反应均及时上报不良事件,认真对待,仔细分析,并立即采取相应的措施保护受试者安全,对出现的不良事件均判断其严重程度,判断其与本实施例药物的因果关系,进行不良事件的记录及安全性数据快速报告。本实验过程中未出现死亡、危及生命等严重不良事件;未出现与药物剂量相关的药物不良反应;也未出现未预期的药物不良反应。本临床试验开展过程中观察到治疗组有1例患者服药后有腹泻,胃中烧灼感的症状,程度为轻度,经盲态审核会最终评价与本试验药物的关系为可能相关。治疗组1例患者服药后有腹胀的症状,程度为轻度(症状轻微,患者未停药后自行缓解),经盲态审核会最终评价为无关。本临床试验两组患者血、尿常规、生化(肝酶、肌酐、尿素氮)、及十二导联心电图检验检查相关安全性相关指标疗前疗后均数据完整者共15例,均未见异常。且入组患者以年轻患者居多,出组后电话随访也未见明显症状不适,因此15例可从一定程度上反应该临床试验药物的安全性。
以上通过对两组患者的咳嗽消失/基本消失时间、止咳起效时间、咳嗽消失率、咳嗽VAS评分、中文版LCQ相关评分、中医证候疗效及安全性方面进行统计分析比较,从中西医两种评价体系、采用疾病症状及中医证型相结合的评价标准,以高证据等级的临床随机对照研究数据验证了疏风温肺止咳方的有效性及安全性。
应用例2-1
疏风温肺止咳方对咳嗽变异性哮喘(CVA)寒饮伏肺证的治疗效果-动物实验
1实验材料
1.1实验动物与饲料
健康雄性SPF级Hartley豚鼠24只,体重200~250g,纯白色,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号SCXK(京)2016-0011。常规词养于北京中医药大学东方医院清洁级动物房。12h光照和12h黑暗循环,温度23℃,湿度30%~50%,饲喂SPF豚鼠生长繁殖饲料,由北京科澳协力饲料有限公司提供,产品批号:20095113;饮水为消毒动物饮用水。
1.2主要实验试剂、药品及仪器
表23主要实验试剂、药品及仪器
1.4主要实验器材
眼科弯镊、眼科剪、直尖手术剪、止血钳、采血针、采血管、动脉夹、灌注针、纱布、棉签、棉球、胶布、培养皿、烧杯、冻存管、各种规格离心管、气管插管、外科缝合线、各种规格注射器、75%酒精喷壶等。所有手术器械使用前均经蒸馏水清洗并进行高压蒸汽灭菌。
2实验流程及方案
2.1分组和造模
将24只豚鼠随机分为空白组、模型组、中药组和西药组,每组6只;参考文献(蔡黎,毕小利,王忆勤,张炜.咳嗽变异性哮喘豚鼠模型的构建[J].山西医科大学学报,2007(12):1070-1073;赖克方.慢性咳嗽(第2版)[M].人民卫生出版社,2019;刘燕,张庆祥,常兴,等.哮喘病寒饮蕴肺证病证结合大鼠病理模型的建立与思考[J].中华中医药学刊,2019,37(03):586-588+777.),在经典咳嗽变异性哮喘豚鼠模型制备的基础上,同时叠加中医寒饮伏肺动物模型制备方法,最终得到实验所需病证结合豚鼠模型,具体为:适应性喂养3天后,除空白组外,其余各组每只豚鼠肌注4%卵蛋白溶液0.5mL,同时腹腔注射10%氢氧化铝溶液0.2mL;从Day 14开始,用1%卵蛋白溶液雾化激发,隔日1次,共7次,同时模型组、中药组、西药组进行“形寒+饮冷”造模,“形寒”:0℃寒冷环境3h/d,“饮冷”:8AM~8PM持续冰水混合物喂养,并记录CVA寒饮伏肺证病证结合豚鼠模型一般状态与行为记录表(记录表参考《慢性咳嗽寒饮伏肺病证结合动物模型的建立与评价》(王丽云等.现代中医临床,2021,28(01):44-50)和《哮喘病寒饮蕴肺证病证结合大鼠病理模型的建立与思考》(刘燕等.中华中医药学刊,2019,37(03):586-588+777)使用的大鼠行为学症状和体征观察表制定)。Day 28后,将各组豚鼠置于自制雾化箱内,用100μmol/L辣椒素雾化120s,记录5min(含雾化时间120s)内豚鼠咳嗽次数,大于10次者即为造模成功,从而建立CVA寒饮伏肺病证结合模型。
3.2干预措施
空白组、模型组:采用纯水灌胃;中药组:实施例1疏风温肺止咳方,给药剂量依据成人每日有效剂量,按动物公斤体重剂量折算系数换算,豚鼠等效剂量为5.5g/(kg·d),即用量为0.2mL/100g,造模成功后开始灌胃,每日1次,连续给药7天;西药组:醋酸泼尼松片研成粉末,加纯水溶解,制成浓度为1.2mg/mL的溶液。依据成人每日有效剂量,按动物公斤体重剂量折算系数换算,豚鼠等效剂量为3mg/(kg·d),即用量为0.25mL/100g,造模成功后开始灌胃,每日1次,连续给药7天。
4取材与相关指标检测
4.1一般状态与行为评价
自开始造模前一天(Day 13)始至完成药物干预(Day 36)完成后,记录各组豚鼠一般状态及行为,并完成每日的动物一般状态与行为评分表,具体如表24,其中在观察过程中发现24只豚鼠,在实验过程中共死亡3只。空白组在适应性饲养阶段死亡1只;模型组无死亡;在卵蛋白激发过程中,中药组、西药组各死亡1只。
表24各组一般状态与行为评分情况
注:(-)表示无此症状和体征,(+)表示有此症状和体征,(+)个数越多表示该症状越严重,(+-)表示此症状体征在(-)和(+)之间。
根据表24可以看出,完成药物干预后,空白组豚鼠形体健壮,精神状态良好,反应灵敏,动作敏捷,扎堆不明显,呼吸节律整齐、均匀,耳、口唇颜色红润,口、鼻无异常分泌物出现,皮毛整齐、柔顺、有光泽,皮温正常,饮食正常,大小便正常。与空白组比较,模型组、中药组、西药组豚鼠在造模完成后均出现寒饮伏肺证的症状表现,豚鼠形体偏瘦,精神状态差,反应欠灵活,行动迟滞,蜷卧不动、扎堆明显,呼吸增快,耳、口唇色淡欠红润,口、鼻出现分泌物,偶可闻及鼻音,皮毛零乱、脱落、欠光泽,四肢不温,饮食欠佳,小便量明显增加,大便偏软,不成形,表明模型构建成功。与模型组相比,完成干预措施后的中药组、西药组豚鼠在各项一般症状和体征上,均有不同程度的改善,在皮毛凌乱、无光泽、脱落及二便量增多方面,中药组改善更明显,经过药物干预,中药组、西药组豚鼠均未闻及鼻音。
4.2咳嗽次数测定
取材前,使用自制雾化箱,雾化吸入浓度为100μmo1/L的辣椒素溶液120s,观测各组豚鼠在记录5min(含雾化时间120s)内咳嗽的总次数,结果如表25。
表25用药后各组豚鼠的咳嗽次数
注:与空白组比较*P<0.05;与模型组比较##P<0.01。
根据表25可以看出,模型组豚鼠的咳嗽次数明显增加,经本发明得到的颗粒剂干预能够降低咳嗽次数,说明本发明颗粒剂能够降低CVA寒饮伏肺豚鼠模型的咳嗽次数,降低其咳嗽的敏感性,从而治疗CVA寒饮伏肺证。
4.4肺组织病理
具体步骤同应用例1-1步骤2.5.3,结果如图7所示。其中A、B、C和D依次为空白组、模型组、中药组和西药组。
根据图7可以看出,模型组豚鼠肺组织支气管管腔狭窄,黏膜上皮结构不完整,有部分脱落,肺泡壁增厚,支气管周围、黏膜层、黏膜下层、肺泡壁周围及腔内有大量炎性细胞浸润。利用本发明颗粒剂干预后支气管黏膜皱襞稍增厚,可见黏膜上皮少量脱落,管腔、黏膜层及黏膜下层、肺泡壁周围及腔内有少量炎性细胞浸润。说明本发明颗粒剂通过减轻支气管、黏膜皱襞增厚程度、黏膜上皮脱落程度及炎性细胞浸润程度,治疗CVA寒饮伏肺证。
4.3气道阻力测定
咳嗽次数测定后12h,选用20wt.%乌拉坦(1.5g/kg)腹腔注射麻醉豚鼠后将其固定于操作板上,剪开颈部皮肤,钝性分离气管及颈静脉,于气管近头处剪一“T”型小口,将气管插管插入豚鼠气管中。使用外科缝线于气管插管处上下两端迅速双结扎,将气管插管接头固定于气管;快速分离好豚鼠两侧颈静脉,并用外科缝合线穿入其下标记位置。迅速将豚鼠移置动物体描箱内,仰卧位置固定,连接呼吸机于气管接头,为豚鼠提供被动呼吸。将颈静脉给药针头插入分离好的一侧颈静脉中并固定,固定成功后,试推注适量生理盐水监测给药是否顺利,后可轻柔封闭体描箱,注意不可触及动物体描箱壁,以免造成压力变化带来误差。小动物呼吸机辅助通气,呼吸频率设定为60次/min,潮气量设定为6mL/kg。观察仪器显示气压及呼吸频率,流量稳定后方可监测气道阻力。首先静脉注射生理盐水,记录此时的气道阻力(resistive,Re),将其作为基础值。之后按浓度递增剂量依次静脉注射浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L氯化乙酰胆碱溶液,记录每次注射后豚鼠的Re,待波形稳定后再开始下一个浓度的氯化乙酰胆碱溶液注射,结果如下表26。
注:与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较#P,0.05,##P<0.01;与中药组比较&P<0.05
根据表26可以看出,各组豚鼠的气道阻力在逐渐增加浓度的氯化乙酰胆碱溶液激发下均有所升高,中药组和西药组均能降低氯化乙酰胆碱溶液激发气道阻力,本发明得到的颗粒剂可以降低CVA寒饮伏肺模型豚鼠的气道阻力,从而治疗CVA寒饮伏肺。
4.4取血及离心
豚鼠气道阻力测定完成后,仰卧位固定豚鼠,切开腹腔,剥离腹主动脉,将取血针刺入腹主动脉中,并迅速将取血针另一端插入采血管内,取血7mL;将血液标本静置后,以3000r 4℃10min离心,取上层血清,放置-20℃低温冰箱中备用。
4.5支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)收集
完成取血操作后,仰卧位固定豚鼠,剪开胸腔,暴露肺脏,止血钳夹闭右主支气管,使用5mL注射器(去针头)进行左肺灌洗,每次注入5mLNS,每次停留30s,回吸灌洗液,不拔出注射器,反复注入-回吸操作3次后,将取得的灌洗液留存,重复上述灌洗操作3次,即共灌洗15mLNS,记录回收灌洗液总量,留存备用。
4.6肺泡灌洗液细胞计数及嗜酸性粒细胞(eosinophils,EOS)百分比测定
在BALF收集后2小时内完成细胞计数、细胞涂片及染色操作。
4.6.1细胞计数
用75%乙醇溶液擦拭计数板、盖玻片后,将盖玻片覆在计数板上面平放于桌面;用塑料滴管将收集到的BALF混匀后,取适量肺泡灌洗液,从细胞计数板边缘与盖玻片的缝隙中缓缓滴入,使之充满计数板和盖玻片之间的空隙之中,静置片刻,将计数板放在×10低倍镜下观察计数。计数方法:使用计数器对计数板的四角大方格(每个大方格包含16个小方格)内的细胞数进行计数;计数时,只计数完整的细胞,若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数;在一个大方格中,如果有细胞位于线上,一般计上线细胞不计下线细胞,计左线细胞不计右线细胞;细胞数/mL=四大格细胞总数÷4×107/L。
4.6.2细胞涂片及染色
细胞计数完成后,将BALF以800r 4℃ 10min离心,取适量上层清留存,放置-80℃低温冰箱中备测。将存有离心后BALF的离心管内剩余上清液倾倒,只留细胞沉淀部分,快速使用100μL移液枪取PBS溶液100μL,注入标本离心管内,复旋4-5次后吸取标本,滴1滴细胞液于载玻片磨砂面与光滑面交界处,用另一张载玻片以30°~45°角度快速推片,使得标本均匀平铺于载玻片上,后静置晾干。将晾干后的载玻片置于晾片架上,用塑料滴管取8-10滴瑞氏染液均匀滴在载玻片上,适当晃动玻片使染液与细胞充分接触,静置1min;再用塑料滴管取12-15滴细胞固定液均匀滴于载玻片上,适当晃动玻片使染液与细胞充分接触,静置8min。后以细流水从玻片边缘冲洗玻片3-4s,静置晾干。晾干后用滴管取适量中性树胶于载玻片边缘,以盖玻片倾斜盖在载玻片上,使树胶均匀平铺覆盖于载玻片上标本处,完成封片,后置于通风处2-3天。
4.6.3嗜酸性粒细胞百分比测定
使用光学显微镜,在×40高倍镜下进行EOS计数,记录每张涂片上,使用计数器对每100个细胞中EOS的数量进行计数,每张涂片选取3个不同视野进行计数,取3次平均值计为EOS百分比,结果如表27。
表27用药后各组豚鼠BALF细胞技计数及嗜酸性粒细胞比例
注:与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较#P<0.05,##P<0.01
根据表27可以看出,模型组豚鼠BALF中自细胞总数升高,EOS百分比增高,本发明得到的颗粒剂可降低气道免疫炎症和气道的EOS的浸润,从而实现治疗咳嗽变异性哮喘(CVA)寒饮伏肺证的效果。
4.7肺组织取材、切片制作及染色
完成肺泡灌洗操作后,将豚鼠左肺夹闭后,松开夹闭右肺的止血钳,并用50mLNS经右心室肺循环灌注后,分离右肺中叶,将其置于4wt.%的甲醛中,以备病理切片使用;分离右肺上叶,分成2小块,放于冻存管中,并存于-80℃低温保存,备用于蛋白质印迹法(Western Blot)检测。待放置于4%固定液中的肺组织充分固定后,常规修块、再进行组织脱水、石蜡包埋、切片,切成3~5μm切片。每个石蜡块取2张切片进行常规HE染色,首先在二甲苯中浸泡10min脱蜡,后依次在无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中浸泡无水化,流水冲洗切片5min;之后将切片置于苏木素染色中5min后,使用流动水冲洗苏木素;将完成苏木素染色的切片置于1%盐酸乙醇中30s,完成分化;将分化后的切片迅速置于返蓝液中返蓝,流水冲洗;将返蓝后的切片放入伊红溶液中染色5min,流水冲洗,静置晾干,中性树胶完成封片。在光学显微镜下观察各组动物肺组织形态学改变,根据上皮损伤、粘膜下水肿、炎症浸润程度判断炎症严重程度。
4.8酶联免疫吸附法检测血清和BALF上清液中IL-4、IL-5、IL-13水平
参照使用IL-4、IL-5、IL-13酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒说明书进行操作,结果如表28和表29。
注:与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较#P<0.05,##P<0.01
注:与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较#P<0.05,##P<0.01
根据表28和表29可以看出,模型组豚鼠血清和BALF上清液中IL-4、IL-5、IL-13水平明显升高,CVA发病时以气道局部的免疫炎症较重,通过本发明颗粒剂治疗,外周及气道局部的炎症都有不同程度的改善,本发明颗粒剂可通过降低外周及气道局部IL-4、IL-5、IL-13的水平,减轻气道炎症,从而实现治疗咳嗽变异性哮喘(CVA)寒饮伏肺证的目的。
4.8.1试剂准备
同应用例1-1步骤4.7.1(1)样本:各组动物血清、BALF上清液,提前恢复至室温。
(2)1×洗液:吸取20×浓缩洗液50mL至1L的量筒,加蒸馏水至1000mL,轻轻混匀,避免泡沫。转移至干净瓶内。
(3)1×检测缓冲液:吸取10×浓缩检测缓冲液5mL至100mL量筒,加蒸馏水至50mL,轻轻混匀,避免泡沫。
(4)检测抗体:稀释前充分混匀。根据标准品和待检样本的数量,用1×检测缓冲液按1:100稀释浓缩的检测抗体。
(5)辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素:稀释前充分混匀。根据标准品和待检样本的数量,用1×检测缓冲液按1:100稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
(6)小鼠IL-4、IL-5、IL-13标准品:开盖前短暂离心,用蒸馏水重溶小鼠IL-4、IL-5、IL-13标准品,重溶体积标注于小鼠IL-4、IL-5、IL-13标准品的标签上。轻柔地涡旋震荡,确保充分混匀,重溶后标准品的浓度为1000pg/mL,重溶后静置10-30min,稀释前充分混匀。
(7)血清样本标准曲线的制备:取230μL浓缩的小鼠IL-4、IL-5、IL-13标准品,加入230μL标准品稀释液,作为标准曲线的最高浓度(500pg/mL)。在每一个试管中加入230μL标准品稀释液。使用高浓度标准品做1:1系列稀释。每次移液时,请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。
(8)BALF上清液样本标准曲线的制备:取230μL浓缩的小鼠IL-4、IL-5、IL-13标准品,加入230μL BALF上清液,作为标准曲线的最高浓度(500pg/mL)。在每一个试管中加入230μL BALF上清液。使用高浓度标准品做1:1系列稀释。每次移液时,确保充分混匀。以BALF上清液作为标准曲线的零浓度。
4.8.2检测步骤
(1)准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品,将所有的试剂、样本恢复至室温。
(2)设置空白孔、样本孔、标准品,确定检测板孔数量。
(3)浸泡酶标板:在预包被有抗小鼠IL-4、IL-5、IL-13抗体的酶标板中加入300μL1×洗液静置浸泡30s。弃掉洗液之后,在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后,立即使用微孔板,避免微孔板干燥。
(4)加标准品:标准品孔加入100μL 2倍倍比稀释的标准品。空白孔加入100μL标准品稀释液。
(5)加样本:血清:样本孔加入80μL 1×检测缓冲液和20μL样本。BALF上清:样本孔加入100μLBALF上清。
(6)加检测抗体:每孔加入50μL稀释的IL-4、IL-5、IL-13抗体(1:100稀释),加样过程在15min内完成。
(7)孵育:使用封板膜封板。300r/min振荡,室温孵育1.5h。
(8)洗涤:弃掉液体,每孔加入300μL洗液洗板,洗涤6次。每次洗板,在吸水纸上拍干。
(9)加酶孵育:每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)。
(10)孵育:使用新的封板膜封板。300r/min振荡,室温孵育30min。
(11)洗涤:重复步骤8。
(12)加底物显色:每孔加入100μL显色底物TMB,避光,室温孵育5~30min。
(13)加终止液:每孔加入100μL终止液,颜色由蓝色变为黄色。
(14)检测读数:在30min之内,使用酶标仪测定450nm。
(15)根据OD值建立标准曲线,按曲线方式计算血清、BALF上清液中IL-4、IL-5、IL-13水平。
4.9蛋白质印迹法检测肺组织中NF-κB、IκB的表达
4.9.1组织蛋白抽提
(1)组织加液氮进行匀浆。(2)加入1mLPBS,500r离心5min。(3)吸干残留的PBS,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,混匀。(4)冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3×10s)。(5)4℃,12000r/min离心15min,收集上清。(6)BCA蛋白定量法测定蛋白浓度,蛋白上样Buffer将蛋白定量为5mg/mL,-20℃保存备用。
4.9.2蛋白浓度测定
(1)梯度稀释牛血清白蛋白(BCA)标准品。(2)制备BCA工作液。(3)将各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品加入到微孔板或试管中,分别加入BCA工作液,混匀。(4)密封后,37℃保温30-60min。(5)冷却到室温,以空白为对照,测量样品在562nm或该波长附近的吸光值。(6)将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。
4.9.3SDS-PAGE电泳
按照应用例1-1步骤2.5.7.3进行SDS-PAGE电泳。
4.9.4Western Blot
按照应用例1-1步骤2.5.7.4和2.5.7.5进行转膜和抗体孵育,其中一抗为phospho-NFκB p65antibody(中文名称:磷酸化细胞核因子抗体,厂家:Bioss,产品编号:bs-0982R)或IκB alpha antibody(中文名称:核因子κB抑制蛋白α抗体,厂家:Bioss,产品编号:bs-1287R),具体根据需要检测的指标选择使用。上述两种一抗对应的二抗均为根过氧化物酶-兔抗大鼠IgG(HRP标记抗体,二抗),厂家:MDL,产品编号:MD932577,二抗用1×TBST稀释300倍。
4.9.5显色成像与分析
(1)按1:1(v/v)混合ECL试剂盒中两种液体;(2)将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面,室温作用4min。抖掉膜上液体,将其放入化学发光成像系统成像,使用GraphPad 7.0软件,将各组豚鼠NF-κB p65/IκK-α条带灰度与内参蛋白条带灰度的比值数据进行统计分析,结果如图8-1、图8-2和表30。
表30各组豚鼠NF-κB p65和IκK-α条带灰度分别与内参蛋白条带灰度的比值
空白组 | 模型组 | 中药组 | 西药组 | |
NF-κBp65/β-actin | 0.1619 | 0.6761 | 0.2809 | 0.2781 |
IκK-α/β-actin | 1.0395 | 0.6871 | 0.8706 | 0.8671 |
根据图8-1、8-2和表30,可以看出,模型组豚鼠肺组织NF-κB表达明显增加,而IκB表达降低,利用本发明得到的颗粒剂干预后可以使豚鼠肺组织NF-κB表达下降,IκB的表达升高,说明本发明得到的颗粒剂能够通过NF-κB通路,从而减低气道炎症,进而达到治疗的效果。
应用例2-2
疏风温肺止咳方对咳嗽变异性哮喘(CVA)寒饮伏肺证的治疗效果-临床实验
1、病例来源
2020年8月-2021年11月在北京中医药大学东方医院呼吸科就诊的咳嗽变异性哮喘患者,具体人口学资料和临床资料如表31所示。
表31人口学资料和临床资料(FAS)
注:总体人群中,与日间咳嗽症状积分相比,*P<0.05,下同。
2、诊断标准
2.1西医诊断标准
咳嗽变异性哮喘:参照中华医学会呼吸病学分会哮喘学组发布的《咳嗽的诊断与治疗指南(2021)》制定。临床表现:主要表现为刺激性干咳,通常咳嗽比较剧烈,夜间及凌晨咳嗽为其重要特征。感冒﹑冷空气、灰尘及油烟等容易诱发或加重咳嗽。
诊断标准如下:(1)慢性咳嗽(持续咳嗽>8周),常伴有明显的夜间刺激性咳嗽;(2)支气管激发试验阳性,或PEF平均变异率>10%,或支气管舒张试验阳性;(3)抗哮喘治疗有效。
2.2中医辨证标准
参照国家食品药品监督管理总局《中药新药用于咳嗽变异性哮喘的临床研究技术指导原则》以及团队既往研究拟定。
寒饮伏肺证:阵咳夜甚,痰少清稀有沫,咽痒,畏寒怕冷,背冷,遇冷易咳,舌淡,苔薄滑,脉紧。由临床医生根据此标准进行辨证。
3、选择病例的标准
3.1受试者纳入标准
(1)临床诊断为咳嗽变异性哮喘;(2)中医辨证为寒饮伏肺证;(3)年龄18~65周岁;(4)自愿参加本项临床试验,并签署知情同意书。
3.2受试者排除标准
(1)其他病因引起的慢性咳嗽(上气道咳嗽综合征、胃食管反流性咳嗽、嗜酸粒细胞性支气管炎、ACEI及其他药物诱发的咳嗽等);(2)ALT、AST>正常参考值上限1.5倍或Scr>正常参考值上限;(3)有长期酗酒或药物滥用史;(4)合并有严重心血管、脑血管或造血系统等严重疾病;(5)有智力障碍或精神障碍;(6)妊娠、哺乳期妇女;(7)对试验药物成分有过敏史;(8)研究者认为不适宜参加本临床试验。
4、治疗方案
试验组:服用实施例1制备得到的颗粒剂,1次3袋(1袋8g),1日2次,温开水冲服;
对照组:服用安慰剂(5wt.%实施例1制备得到的颗粒剂和95%基质辅料(调味糖浆粉1.5g、麦芽糊精6.491g和苦味剂0.009g组成)的混合颗粒剂),1次3袋(1袋8g),1日2次,温开水冲服,混合颗粒剂由河北晨光神农医药科技有限公司生产;
治疗的时间14天。
5、治疗效果
5.1参照应用例1-2的步骤5.1~5.35.2,评价咳嗽消失/基本消失时间,咳嗽消失/基本消失时间率、止咳起效时间、咳嗽VAS评分、LCQ和中医证候疗效评价,评价结果如表32~34。
表32CVA寒饮伏肺证患者治疗后两组治疗效果比较(PPS)
表33CVA寒饮伏肺证患者治疗7天后中医证候相关症状变化两组比较(PPS)
表34CVA寒饮伏肺证患者治疗14天后中医证候相关症状变化两组比较(PPS)
根据表32~34可以看出,试验组的咳嗽消失/基本消失率、咳嗽症状积分减分分值、咳嗽VAS评分减分分值值均明显高于对照组,试验组的咳嗽消失/基本消失时间、止咳起效时间均明显短于对照组,说明本发明疏风温肺止咳方对于CVA寒饮伏肺证患者的咳嗽严重程度的缓解有良好的疗效,起效快,病程短疏风温肺止咳方在对咳嗽症状有效缓解的同时,也提高了患者的生活质量;对比试验组和对照组治疗前后中医证候相关症状评分减分分值和各症状消失率,结果可见试验组在中医证候相关的各症状评分减分分值和各症状消失率均高于对照组,说明了疏风温肺止咳方对于寒饮伏肺证候的改善有较好的效果。
5.2安全性评价
本应用例实施过程中按照研究方案规定出现反馈的不适症状及反应均及时上报不良事件,认真对待,仔细分析,并立即采取相应的措施保护受试者安全,对出现的不良事件均判断其严重程度,判断其与本实施例药物的因果关系,进行不良事件的记录及安全性数据快速报告。本实验过程中试验组及对照组患者生命体征均在正常范围,且均未发现具有临床意义的实验室异常值。治疗期间,试验组有5例不良事件,其中判定为不良反应1例(2.86%,与试验药物关系判定为可能有关),表现为轻微皮疹1例,停药3天后自行消失;对照组有1例不良事件,未被判定为不良反应,两组不良事件及不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
以上通过对两组患者的咳嗽消失/基本消失时间、止咳起效时间、咳嗽消失率、咳嗽VAS评分、中文版LCQ相关评分、中医证候疗效及安全性方面进行统计分析比较,从中西医两种评价体系、采用疾病症状及中医证型相结合的评价标准,以高证据等级的临床随机对照研究数据验证了疏风温肺止咳方的有效性及安全性。
应用例2-3
同应用例2-2,区别在于,重新按照要求选择病例,并且步骤治疗方案如下:
试验组:服用实施例1制备得到的颗粒剂,1次3袋(1袋8g),1日2次,温开水冲服;
桂枝小于5g组:服用对比例1制备得到的颗粒剂,1次3袋(1袋8g),1日2次,温开水冲服,混合颗粒剂由河北晨光神农医药科技有限公司生产;
无青风藤组:服用对比例2制备得到的颗粒剂,1次3袋(1袋8g),1日2次,温开水冲服,混合颗粒剂由河北晨光神农医药科技有限公司生产;
治疗的时间14天,CVA寒饮伏肺证患者中医疗效两组治疗效果比较如下表35~42。
表35CVA寒饮伏肺证患者治疗后咳嗽症状疗效比较(PPS)
表36CVA寒饮伏肺证患者治疗后咳嗽症状疗效比较(PPS)
表37CVA寒饮伏肺证患者中医疗效两组比较(PPS)
表38CVA寒饮伏肺证患者中医疗效两组比较(PPS)
表39CVA寒饮伏肺证患者治疗7天后中医证候相关症状变化两组比较(PPS)
表40CVA寒饮伏肺证患者治疗14天后中医证候相关症状变化两组比较(PPS)
表41CVA寒饮伏肺证患者治疗7天后中医证候相关症状变化两组比较(PPS)
表42CVA寒饮伏肺证患者治疗14天后中医证候相关症状变化两组比较(PPS)
根据表35~42可以看出,通过对试验组与桂枝小于5g组和无清风藤组的咳嗽症状积分减分分值、中医疗效总有效率和中医证候疗效进行统计分析比较,可以看出,本发明得到的疏风温肺止咳方相比桂枝小于5g组和无清风藤组能够有效治疗咳嗽变异性哮喘(CVA)寒饮伏肺证,并且存在显著差异。
综上,本发明提供的中药组合物安全性好,通过合理配伍,共奏温肺化饮,具有疏风止咳之效,尤其对感染后咳嗽寒饮伏肺证和咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证具有突出治疗作用。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可以做各种改动和修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种止咳的中药组合物,其特征在于,包括以下质量份的原料:炙麻黄2~10份,青风藤6~12份,厚朴3~10份,前胡3~10份,茯苓10~15份,桂枝3~10份,白术6~12份,炙紫菀5~10份,炙款冬花5~10份,炙甘草2~10份,清半夏3~9份和黄连2~5份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物包括以下质量份的原料:炙麻黄6份,青风藤12份,厚朴6份,前胡10份,茯苓15份,桂枝5份,白术12份,炙紫菀10份,炙款冬花10份,炙甘草9份,清半夏9份和黄连3份。
3.权利要求1或2所述中药组合物在制备治疗咳嗽的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述咳嗽包括咳嗽寒饮伏肺证。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述咳嗽寒饮伏肺证包括感染后咳嗽寒饮伏肺证和/或咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述感染后咳嗽寒饮伏肺证和/或咳嗽变异性哮喘寒饮伏肺证由感冒、冷空气、灰尘、油烟等一种或多种因素诱发。
7.根据权利要求3~6任一项所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型包括胶囊制剂、颗粒剂、片剂、散剂或汤剂。
8.一种治疗咳嗽寒饮伏肺证的颗粒剂,其特征在于,所述颗粒剂包括权利要求1或2所述的中药组合物和辅料。
9.根据权利要求8所述的颗粒剂,其特征在于,所述辅料包括麦芽糊精。
10.权利要求8或9所述的颗粒剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将中药原料混合,得到中药混合物;
将所述中药混合物和体积百分含量60%的乙醇溶液按照1:3的质量比混合,浸泡4h后,得到待提取液;
将所述待提取液和体积百分含量60%的乙醇溶液按照1:3的质量比混合,提取1.5h,得第一提取液和第一药渣;
将所述第一药渣和水按照1mg:10mL的质量体积比混合,提取1.5h,得第二提取液;
将所述第一提取液和第二提取液混合,回收乙醇,浓缩、干燥,得提取物;
将所述提取物和辅料按照1:1的质量比混合,制粒,得到所述颗粒剂。
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