CN115976216B - 一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物及其筛选方法和应用 - Google Patents
一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物及其筛选方法和应用Info
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Abstract
本发明公开了一组用于肺结节良恶性鉴别检测的甲基化标志物及其筛选方法和应用，所述筛选方法包括：通过对肺结节和结节旁组织进行RRBS分析，构建本地肺结节甲基化数据集，并根据TCGA中肺腺癌DNA甲基化数据集，对两个数据集进行甲基化差异分析，得到第一筛选DMR；对第一筛选DMR进行反向筛选，得到第二筛选DMR；进一步通过组织与配对血浆一致的分析、过滤，得到候选甲基化标志物集；将前述标志物集在血浆训练集和验证集中进行机器学习，筛选得到用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物。本发明最终筛选得到78个与肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物，该78个标志物或其组合在鉴别诊断肺结节良恶性时，灵敏度高、特异性好。
Description
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物及其筛选方法和应用。
背景技术
肺癌早期特征不明显，75％的癌症患者都是在中晚期才确诊。早期肺癌检出率低于25％，但是早期肺癌5年生存率能达到90％以上。
目前低剂量螺旋CT(low-dose helical computed tomography，LDCT)筛查早期肺癌已经达成共识，但随着LDCT筛查的推广，50％接受LDCT筛查的人群会检出肺结节。肺结节指肺内直径小于等于30mm的局灶性、类圆形、密度增高的肺部阴影，其中95％肺结节由良性病变引起，包括肉芽肿、淋巴结、慢性炎症、错构瘤等，恶性病变主要包括腺癌、鳞癌等。为实现肺结节的准确诊治，国内外各大临床医学中心制定了一系列诊疗路径和风险预测模型，但目前仍存在18-25％的过度诊断率，尤其是影像学为实性、直径为亚厘米大小的患者术后病理证实为良性疾病的比例高达30％，不仅给患者带来严重的心理负担，也造成国家医疗卫生资源巨大浪费。因此，肺结节良恶性鉴别诊断已成为临床诊治痛点和研究热点，也是健康中国建设和经济发展的重大需求。
目前已有多种标志物和技术手段用于肺结节的良恶性鉴别诊断。临床常规应用的血清学肿瘤标志物如：CEA、SCC、Cfra21-1、ProGRP和NSE等对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断具有一定价值，但其单独用于肺结节良恶性鉴别诊断的敏感性和特异性都很低，联合检测在临床I期肺癌检出率不超过20％，远不能满足临床需求；痰脱落细胞学虽然便捷经济、无创，病人接受度高，但敏感性很低，只能对肺癌诊断起提示作用；循环肿瘤细胞(CTC)与肺癌分期有关，对早期肺癌的诊断敏感度达67.2％，但体外CTC检测技术容易受样本量的制约，在早期诊断和筛查中研究较少。
越来越多新的证据表明在肿瘤发生发展中，发生在表观遗传层面上的甲基化异常比体细胞突变更为普遍。不同基因DNA甲基化与肿瘤类型高度相关，在同一个体具有高度的组织特异性，不同个体的相同组织，其甲基化特征谱也具有较高的一致性。因以DNA甲基化为代表的表观遗传修饰往往发生在癌症早期，且与体细胞突变和拷贝数变异相比，具有高度组织特异性，从原理上更适合用于肺结节鉴别诊断标志物研究。
循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)作为液体活检中游离DNA(cfDNA)分子的一种，其携带有肿瘤特异性的遗传及表观遗传学改变。且相较于组织活检，ctDNA具有实时、便捷、无创等优点，使其作为新型的肿瘤标志物持续受到关注。越来越多的研究表明，特征性的甲基化"指纹"图谱可用于癌症早期诊断与分期、疗效评估、复发监测和预后判断等。但目前，基于ctDNA甲基化的肺结节相关标志物较少，且诊断性能有限。
因此，开发基于ctDNA甲基化的具有低成本、无创、适合临床推广的肺结节良恶性鉴别的高特异性、高灵敏度的标志物，对肺结节人群的科学管理和有效控制肺癌的发病率，具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中的问题，本发明公开了一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物及其筛选方法和应用，通过该筛选方法最终筛选得到78个与肺结节良恶性和/或肺癌鉴别诊断的甲基化标志物，且通过模型构建，评价了本发明提供的甲基化标志物的鉴别诊断性能。该78个甲基化标志物或其组合在鉴别诊断肺结节良恶性和/或肺癌时，灵敏度高、特异性好，适于肺结节良恶性鉴别诊断的广泛应用。
为解决上述问题，本发明首先提供了一组用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物，所述的甲基化标志物包括以下39个甲基化区域中的任意一个或多个的组合：
chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr18：49867019-49867179；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr14：74892573-74892733；chr8：104383554-104383714；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr22：44420459-44420619；chr6：27835283-27835443；chr17：77020105-77020265；chr20：62283562-62283722；chr4：54966998-54967158；chr5：146257858-146258018；chr7：98467849-98468009；chr16：28075032-28075192；chr17：47307472-47307632；chr12：54427101-54427261；chr2：182321922-182322082；chr13：28674645-28674805；chr17：45810438-45810598；chr6：29760212-29760372；chr4：48485804-48485964；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr5：128797252-128797412；chr18：43652068-43652228；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748；chr5：153784739-153784899；chr7：132261297-132261457；chr19：56904958-56905118；chr19：53636048-53636208；chr5：33936140-33936300；chr1：54204130-54204290；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623。
优选地，所述的甲基化标志物还包括以下39个甲基化区域中的任意一个或多个的组合：
chr19：2290434-2290594；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr7：134143579-134143739；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr14：52781261-52781421；chr6：26204595-26204755；chr19：58951468-58951628；chr5：157098320-157098480；chr14：77228082-77228242；chr12：4381931-4382091；chr10：135050089-135050249；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr6：27100719-27100879；chr11：69590360-69590520；chr17：47074677-47074837；chr8：143858458-143858618；chr6：26189078-26189238；chr4：110224117-110224277；chr15：83316243-83316403；chr14：59104962-59105122；chr11：134146152-134146312；chr6：29716362-29716522；chr4：57976315-57976475；chr8：53852244-53852404；chr14：52734595-52734755；chr11：124735024-124735184；chr20：45338378-45338538；chr3：50242683-50242843；chr4：39529282-39529442；chr7：151107115-151107275；chr7：55259381-55259541；chr5：112073416-112073576；chr10：90343107-90343267；chr1：29586353-29586513；chr2：43451673-43451833。
优选地，所述的甲基化标志物包括以下30个甲基化区域：
chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr6：27835283-27835443；chr5：146257858-146258018；chr16：28075032-28075192；chr17：47307472-47307632；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr13：20806316-20806476；chr7：132261297-132261457；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623；chr19：7735166-7735326；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr12：4381931-4382091；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr11：69590360-69590520；chr8：143858458-143858618；chr14：59104962-59105122；chr4：57976315-57976475；chr4：39529282-39529442；chr7：55259381-55259541；chr10：90343107-90343267。
优选地，所述的甲基化标志物包括以下42个甲基化区域：
chr18：49867019-49867179；chr11：15136199-15136359；chr14：74892573-74892733；chr22：44420459-44420619；chr20：62283562-62283722；chr4：54966998-54967158；chr12：54427101-54427261；chr2：182321922-182322082；chr13：28674645-28674805；chr17：45810438-45810598；chr6：29760212-29760372；chr1：179545118-179545278；chr5：128797252-128797412；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748；chr5：153784739-153784899；chr19：56904958-56905118；chr1：54204130-54204290；chr10：105037463-105037623；chr19：2290434-2290594；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr7：134143579-134143739；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr14：52781261-52781421；chr6：26204595-26204755；chr19：58951468-58951628；chr5：157098320-157098480；chr14：77228082-77228242；chr6：27100719-27100879；chr6：26189078-26189238；chr4：110224117-110224277；chr15：83316243-83316403；chr6：29716362-29716522；chr14：52734595-52734755；chr11：124735024-124735184；chr20：45338378-45338538；chr3：50242683-50242843；chr7：151107115-151107275；chr1：29586353-29586513。
优选地，所述的甲基化标志物包括以下45个甲基化区域：
chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr8：104383554-104383714；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr6：27835283-27835443；chr17：77020105-77020265；chr4：54966998-54967158；chr7：98467849-98468009；chr16：28075032-28075192；chr4：48485804-48485964；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr18：43652068-43652228；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748；chr7：132261297-132261457；chr19：53636048-53636208；chr5：33936140-33936300；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr12：4381931-4382091；chr10：135050089-135050249；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr11：69590360-69590520；chr17：47074677-47074837；chr8：143858458-143858618；chr14：59104962-59105122；chr4：57976315-57976475；chr8：53852244-53852404；chr3：50242683-50242843；chr4：39529282-39529442；chr7：55259381-55259541；chr5：112073416-112073576；chr10：90343107-90343267；chr2：43451673-43451833。
本发明另一方面还提供了前面任一项所述的甲基化标志物在检测肺结节良恶性和/或肺癌检测中的应用。
本发明另一方面还提供了一种用于检测肺结节良恶性和/或肺癌的试剂，所述的试剂用于检测前面任一项所述的甲基化标志物的甲基化水平。
本发明另一方面还提供了一种用于检测肺结节良恶性和/或肺癌的试剂盒，所述的试剂盒包括前面所述的用于检测肺结节良恶性和/或肺癌的试剂。
本发明另一方面还提供了一种前面任一项所述的用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物的筛选方法，包括以下步骤：
S1，通过对肺结节和结节旁组织进行RRBS分析，构建本地肺结节甲基化数据集，并根据TCGA中illumina 450K LUAD DNA Methylation(肺腺癌illumina 450k甲基化芯片)数据集，对两个数据集进行甲基化差异分析，筛选得到恶性肺结节组织特异性的甲基化区域，记为第一筛选DMR；
S2，对步骤S1得到的第一筛选DMR进行反向筛选，去除符合以下标准的甲基化区域，得到第二筛选DMR：
(1)血细胞和其他器官来源的甲基化区域；
(2)靶向检测区域小于4个CpG；
(3)血细胞中平均甲基化数值大于0.03的甲基化区域；
S3，基于步骤S2得到的第二筛选DMR，通过组织与配对血浆一致的分析、过滤，得到候选甲基化标志物集；
S4，将步骤S3得到的候选甲基化标志物集在血浆训练集和测试集中进行机器学习，筛选具有显著差异的甲基化区域，得到用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物。
优选地，步骤S1中，所述的第一筛选DMR在两个数据集的甲基化差异分析中满足以下标准：
(a)在对照样本的平均甲基化数值小于0.02；
(b)在阳性样本与其对照样本的平均甲基化数值比值大于3.0；
(c)在阳性样本的平均甲基化数值大于0.05；
(d)DMR区域大于20bp；
其中，所述的阳性样本为恶性结节组织；所述的对照样本为恶性结节旁组织、良性结节组织和良性结节旁组织。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明公开了一组用于肺结节良恶性鉴别检测的甲基化标志物及其筛选方法和应用，通过该筛选方法最终筛选得到78个与肺结节良恶性和/或肺癌鉴别诊断的甲基化标志物，且通过模型的构建，评价了本发明提供的甲基化标志物的鉴别诊断性能。该78个甲基化标志物或其组合在鉴别诊断肺结节良恶性和/或肺癌时，灵敏度高、特异性好，适于肺结节良恶性鉴别诊断的广泛应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中P201在30例肺癌患者不同配对样本中的热图。
图2为实施例2、实施例3和实施例4诊断模型的ROC曲线，其中，
A为实施例2诊断模型在训练集和验证集中的ROC曲线；
B为实施例3诊断模型在训练集和验证集中的ROC曲线；
C为实施例4诊断模型在训练集和验证集中的ROC曲线。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符/一般表示前后关联对象是一种或的关系。
本发明所述的肺部恶性结节患者即为肺癌患者，两者表达意思一致，可互换使用。
如前所述，鉴于现有技术的不足，本发明申请人首先对50对临床肺结节和结节旁组织进行RRBS分析，构建本地肺结节甲基化数据集，并根据TCGA中illumina 450K LUADDNA Methylation数据集，对两个数据集进行甲基化差异分析，筛选得到376个恶性肺结节组织特异性的甲基化区域，记为第一筛选DMR；进一步对第一筛选DMR进行反向筛选，得到201个第二筛选DMR：对第二筛选DMR进行组织与配对血浆一致的分析、过滤，得到候选甲基化标志物集；将候选甲基化标志物集在血浆训练集和验证集中进行机器学习，筛选具有显著差异的甲基化区域，得到用于肺结节良恶性鉴别诊断的甲基化标志物78个。
下面通过具体实施例和附图说明对本发明的技术方案进行详细说明。
本申请研究涉及的材料和实验方法：
1、研究对象
本申请研究自2016年2月至2021年8月，共入组来自上海市胸科医院的347名受试者，受试者相关信息见表1。其中296名CT表现为肺部结节的良恶性患者(包含肺部良性疾病患者106名、190名肺癌患者)和51名健康对照者。肺部良性疾病患者包括肺炎、慢性阻塞性肺病、结核等。肺癌患者经组织病理学和/或细胞病理学确认，分期参考第8版TNM分期标准。健康对照者为门诊体检者。排除缺乏组织病理诊断、急性病史以及其他恶性肿瘤患者。受试者均签署知情同意书，该研究已完成临床试验注册(ChiCTR2000036938)。本申请研究所有受试者随机分配到训练集和验证集，入组的肺癌患者主要为早期肺癌患者(Tis、I期和II期)，在受试者中占72.6％(138/190)。
表1 296例肺部结节患者的相关信息
2、甲基化测序及分析
2.1血浆样本cfDNA提取
入组受试者使用EDTA抗凝管采集10mL外周血，外周血样本经离心分离血浆(约4mL)后，使用游离核酸专用的核酸提取试剂(APG-61001-050，上海羿鸣生物有限公司)提取游离DNA样本，使用冻干仪浓缩样本至20μL的体积。使用Qubit定量，浓度在1～5ng之间，取15μL用于后续的建库。
2.2甲基化文库构建
本申请甲基化建库过程使用的主要试剂如表2所示。其中，Methylation-LightningTMKit购自美国公司，可高效对DNA进行亚硫酸氢盐转化；线性扩增引物预混液包含定制的201条预混引物，用于特异性线性扩增201个候选甲基化标志物(此处201个候选甲基化标志物的筛选过程后文会进行相关描述)；OPERA线性扩增试剂盒是专门针对亚硫酸氢盐转化后DNA样本进行线性扩增的试剂盒；OPERA通用建库试剂(for)是匹配单引物扩增的通用建库试剂盒；建库用单链标签接头(Set 1或2，for)是建库过程中连接反应用到的带标签的接头试剂盒；建库用预扩库标签引物(Set 1或2，for)是建库过程中预扩库反应用到的标签引物试剂盒；文库定量试剂(for)是对完成建库的文库分子进行定量的试剂盒。
表2甲基化建库使用的主要试剂
具体过程如下：
2.2.1亚硫酸氢盐转化样本DNA
采用商用转化试剂盒EZ DNA Methylation-LightningTMKit(ZYMO)对cfDNA样本进行转化，具体操作步骤参照产品说明书进行。
2.2.2单链线性扩增
单链线性扩增体系配制方法及反应程序参照OPERA线性扩增试剂盒说明书进行，加入亚硫酸氢盐转化产物，定制化线性扩增引物预混液和线性扩增试剂。
线性扩增程序设置及上机方法参照OPERA线性扩增试剂(for)试剂盒说明书进行。
磁珠法纯化线性扩增产物，具体纯化方法参照OPERA通用建库试剂(for)试剂盒说明书进行，20μL纯化洗脱产物用于后续实验。
2.2.3单链连接反应
将步骤2.2.2得到的纯化产物与带标签接头进行连接反应，连接反应体系的配制及反应步骤参照OPERA通用建库试剂(for)试剂盒说明书和建库用单链标签接头Set 1或2(for)的说明书进行，得到连接产物。
2.2.4预扩库反应
对步骤2.2.3得到的连接产物进行预扩库反应，预扩库反应体系的配制及反应步骤方法参照OPERA通用建库试剂(for)试剂盒说明书和建库用预扩库标签引物Set 1或2(for)试剂盒说明书进行，得到预扩库产物，即包含标签引物序列的文库分子。
2.2.5扩库
对步骤2.2.5得到的预扩库产物进行扩库反应，扩库反应体系配制及反应步骤方法参照OPERA通用建库试剂(for)试剂盒说明书进行，得到扩增后的文库产物。建库产物的PCR质检定量方法参照OPERA文库定量试剂(for)说明书进行，定量完成后，根据需求混合文库后进行上机测序反应。
2.3文库测序及下机数据生信分析
采用Illumina的NovaSeq6000平台对文库进行150bp双端测序。下机数据通过FastP软件质检后，使用上海羿鸣生物开发软件SYMPHO BcDNA Methylation Analysis(PR)(货号APG_81002，版本号v0.2)进行分析，FastQ数据通过cut adapter提取引物信息，然后进行bismark比对获得BAM文件，经UMIcollapse去重，汇总所有引物计算结果得到去重后CpG深度与单倍体甲基化水平MHC，最终计算得到样本中标准化后单倍体甲基化分子数nMHC，用于后续分析。
对于上述甲基化测序及分析过程，申请人想要说明的是，本领域公知，在待测样本外周血中的cfDNA进行转化处理时，无论是利用重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐、重硫酸盐、重亚硫酸盐等均可以达到上述转化处理的目的，即将外周血中游离DNA中未发生甲基化的胞嘧啶转化未胸腺嘧啶，获得转化处理的样本。因此，无论是利用这些试剂中的哪种进行转化处理，均包含在本发明的保护范围之内。另外，采用的试剂可以直接购买市售的产品，也可以自己配制获得。
在对待测样本外周血的cfDNA进行建库、测序、获取各甲基化区域的甲基化结果时，也可以采用本领域通用的技术手段，如：基于杂交捕获的靶向甲基化测序方法，基于多重PCR的甲基化测序方法或基于荧光定量PCR的甲基化检测，不局限于本申请上述方法。
实施例1肺部良恶性结节候选甲基化标志物的筛选
1、肺部良恶性结节特异性甲基化标志物的初筛
通过对50对临床肺结节病灶和病灶旁组织样本(40对恶性，10对良性)进行全基因组简并甲基化差异分析(Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)，自建肺结节甲基化数据集。同时，基于TCGA中illumina 450K LUAD DNA Methylation数据集，按照以下标准对两个数据集进行分析：(a)候选标志物在对照样本(包括恶性病灶旁组织、良性病灶、良性病灶旁组织)的平均甲基化数值小于0.02；(b)候选标志物在阳性样本(恶性病灶)与其对照样本的平均甲基化数值比值大于3.0；(c)候选标志物在阳性样本(恶性病灶)的平均甲基化数值大于0.05；(d)候选标志物DMR区域大于20bp，筛选得到恶性结节组织(肺癌)相对于癌旁/良性结节组织具有显著性差异的甲基化区域(DMR)376个，即第一筛选DMR。
需要说明的是，DMR平均甲基化数值分析采用甲基化分析领域的标准方法。
2、甲基化标志物的反向筛选
根据已发表文献中组织特异性甲基化数据库(Moss,J.,et al.Nat Commun,2018)，反向筛选并去除上述376个DMR中血细胞和其他器官来源的甲基化区域，同时去除靶向检测区域小于4个CpG的DMR。然后利用健康对照全血样本，针对得到的DMR设计单引物panel并按照本文前述甲基化测序方法进行建库测序，去除血细胞中平均甲基化数值大于0.03的DMR，最终筛选得到201个具有显著差异的肺部恶性结节候选甲基化标志物(以下简称P201)，即第二筛选DMR。
3、P201在肺部恶性结节患者组织和血浆样本中的一致性验证
随机挑选入组研究的30例肺部恶性结节患者(即肺癌患者)，提取配对的肿瘤组织DNA、癌旁组织DNA、配对血浆cfDNA和血细胞DNA，按照前述甲基化测序方法进行甲基化建库测序，结果如图1所示：P201在肺癌患者组织和血浆样本中的甲基化程度显著高于癌旁组织和血细胞，且P201在肿瘤组织和血浆样本高度一致。经该步骤后，P201即为候选甲基化标志物集。
实施例2通过不同的机器学习方法筛选肺部良恶性结节甲基化标志物
将所有受试者随机分为训练集和验证集，利用本文前述方法，对所有受试者的血浆样本提取cfDNA，建立针对P201的单引物扩增甲基化文库，通过三种不同的筛选策略在训练集中得到肺癌相对于良性及健康对照组差异性显著的甲基化特征，然后构建了三种不同的肺结节良恶性鉴别模型，并在验证集中进行模型的性能评估。具体如下：
1、P30甲基化标志物集的确定、建模及性能
将所有受试者中80％的样本作为训练集，其余20％作为验证集，采用LASSO分析(α＝0.03)在训练集中筛选到以下30个关键的甲基化标志物(记为P30)：
chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr6：27835283-27835443；chr5：146257858-146258018；chr16：28075032-28075192；chr17：47307472-47307632；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr13：20806316-20806476；chr7：132261297-132261457；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623；chr19：7735166-7735326；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr12：4381931-4382091；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr11：69590360-69590520；chr8：143858458-143858618；chr14：59104962-59105122；chr4：57976315-57976475；chr4：39529282-39529442；chr7：55259381-55259541；chr10：90343107-90343267。
进一步采用高斯过程构建基于P30的肺结节良恶性鉴别诊断模型，评估该模型在训练集和验证集中对肺结节进行良恶性鉴别诊断的性能。
结果如图2中的A图所示，P30进行高斯过程建立的模型对肺结节良恶性鉴别诊断具有优异的性能。如表3所示，在训练集中，AUC达0.943(95％ CI 0.918-0.967)，灵敏度为86.9％，特异性83.9％；在验证集中，AUC达0.910(95％ CI 0.845-0.974)，灵敏度为79.5％，特异性87.1％。
2、P45甲基化标志物集的确定、建模及性能
将所有受试者中80％的样本作为训练集，其余20％作为验证集，采用LASSO分析(α＝0.02)在训练集中筛选到以下45个关键的甲基化标志物(记为P45)：
chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr8：104383554-104383714；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr6：27835283-27835443；chr17：77020105-77020265；chr4：54966998-54967158；chr7：98467849-98468009；chr16：28075032-28075192；chr4：48485804-48485964；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr18：43652068-43652228；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748；chr7：132261297-132261457；chr19：53636048-53636208；chr5：33936140-33936300；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr12：4381931-4382091；chr10：135050089-135050249；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr11：69590360-69590520；chr17：47074677-47074837；chr8：143858458-143858618；chr14：59104962-59105122；chr4：57976315-57976475；chr8：53852244-53852404；chr3：50242683-50242843；chr4：39529282-39529442；chr7：55259381-55259541；chr5：112073416-112073576；chr10：90343107-90343267；chr2：43451673-43451833。
进一步采用支持向量机构建基于P45的肺结节良恶性鉴别诊断模型，评估该模型在训练集和验证集中对肺结节进行良恶性鉴别诊断的性能。
结果如图2中的B图所示，P45利用支持向量机建立的模型对肺结节良恶性鉴别诊断具有优异的性能。如表3所示，在训练集中，AUC达0.969(95％ CI 0.948-0.990)，灵敏度为89.5％，特异性93.5％；在验证集中，AUC达0.913(95％ CI 0.848-0.978)，灵敏度为69.2％，特异性96.8％。
3、P42甲基化标志物集的确定、建模及性能
将所有受试者中45％的样本作为训练集，其余55％作为验证集，进一步采用Xgboost方法在训练集中筛选到以下42个关键的甲基化标志物(记为P42)：
chr18：49867019-49867179；chr11：15136199-15136359；chr14：74892573-74892733；chr22：44420459-44420619；chr20：62283562-62283722；chr4：54966998-54967158；chr12：54427101-54427261；chr2：182321922-182322082；chr13：28674645-28674805；chr17：45810438-45810598；chr6：29760212-29760372；chr1：179545118-179545278；chr5：128797252-128797412；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748；chr5：153784739-153784899；chr19：56904958-56905118；chr1：54204130-54204290；chr10：105037463-105037623；chr19：2290434-2290594；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr7：134143579-134143739；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr14：52781261-52781421；chr6：26204595-26204755；chr19：58951468-58951628；chr5：157098320-157098480；chr14：77228082-77228242；chr6：27100719-27100879；chr6：26189078-26189238；chr4：110224117-110224277；chr15：83316243-83316403；chr6：29716362-29716522；chr14：52734595-52734755；chr11：124735024-124735184；chr20：45338378-45338538；chr3：50242683-50242843；chr7：151107115-151107275；chr1：29586353-29586513。
进一步采用逻辑回归构建基于P42的肺结节良恶性鉴别诊断模型，评估该模型在训练集和验证集中对肺结节进行良恶性鉴别诊断的性能。
结果如图2中的C图所示，P42利用逻辑回归建立的模型对肺结节良恶性鉴别诊断具有优异的性能。如表3所示，在训练集中，AUC达0.936(95％ CI 0.897-0.976)，灵敏度为80％，特异性98％；在验证集中，AUC达0.888(95％CI 0.838-0.987)，灵敏度为73％，特异性99％。
表3 P30，P45，P42建立的甲基化标记物模在训练集和验证集中的性能
上述利用不同筛选策略筛选得到的具有统计学差异的甲基化标志物共78个，其中有39个甲基化标志物具有较好的独立区分性能。具体内容见表4。
表4 78个甲基化标志物及其具体位置和独立诊断性能
综上所述，本发明公开了一组用于肺结节良恶性鉴别检测的甲基化标志物及其筛选方法和应用，通过该筛选方法筛选得到78个与肺结节良恶性和/或肺癌鉴别诊断的甲基化标志物，且通过模型构建，评价了本发明提供的甲基化标志物的鉴别诊断性能。本发明提供的甲基化标志物或其组合在鉴别诊断肺结节良恶性和/或肺癌时，灵敏度高、特异性好，适于肺结节良恶性鉴别诊断的广泛应用。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (1)
1.检测甲基化标志物的甲基化水平的试剂在制备检测肺结节良恶性的产品中的应用，其特征在于，所述甲基化标志物在染色体上的甲基化区域如下：chr7：143059947-143060107；chr5：178487412-178487572；chr11：15136199-15136359；chr17：43972911-43973071；chr8：104383554-104383714；chr12：64062951-64063111；chr3：87039622-87039782；chr6：27835283-27835443；chr17：77020105-77020265；chr4：54966998-54967158；chr7：98467849-98468009；chr16：28075032-28075192；chr4：48485804-48485964；chr19：37407294-37407454；chr1：179545118-179545278；chr18：43652068-43652228；chr13：20806316-20806476；chr8：116660588-116660748 ；chr7：132261297-132261457；chr19：53636048-53636208；chr5：33936140-33936300；chr4：17783234-17783394；chr1：67773558-67773718；chr10：105037463-105037623；chr12：52400797-52400957；chr5：374080-374240；chr19：7735166-7735326；chr6：26199948-26200108；chr6：26273357-26273517；chr12：4381931-4382091；chr10：135050089-135050249；chr7：30722046-30722206；chr5：175792494-175792654；chr11：69590360-69590520；chr17：47074677-47074837；chr8：143858458-143858618；chr14：59104962-59105122；chr4：57976315-57976475；chr8：53852244-53852404；chr3：50242683-50242843；chr4：39529282-39529442；chr7：55259381-55259541；chr5：112073416-112073576；chr10：90343107-90343267和chr2：43451673-43451833；其中，所述甲基化标志物的甲基化区域基于人类基因组hg19比对确定。
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