CN115976188A - 动脉粥样硬化生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及动脉粥样硬化生物标志物及其应用，其中，生物标志物包括CD99基因、ARPC1B基因、PIP4K2A基因、RPS27基因、PPP1CB基因中的任意一种或几种。相比现有技术，本发明提供的五种生物标志物，单独使用，特异性和灵敏性更好，尤其适用于联合使用，检测稳定性更高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及动脉粥样硬化生物标志物及其应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)动脉硬化的一种，是指大中动脉内膜出现脂质沉着，内膜增厚，然后逐渐形成斑块，斑块造成管腔的狭窄，斑块破裂会导致血栓的形成，引起动脉供血的障碍。AS是各种心血管疾病的主要病理基础，严重危害人类身体健康和生存质量，已成为心血管领域的关注热点。其主要病因是由于过多的脂质沉积在血管内壁，导致血管壁增厚，同时激活炎症反应，造成血管壁损伤，导致动脉粥样硬化。
目前，动脉粥样硬化的识别诊断主要借助于影像学检查，如OCT、MRI、PET等，由于血管不断移动，成像质量不稳定，会影响诊断结果的准确性。并且动脉粥样硬化的症状主要决定于血管病变及受累器官的缺血程度，早期诊断困难，冠状动脉粥样硬化管径狭窄达75％以上，则可发生心绞痛、心肌梗塞、心律失常，甚至猝死，发病后极为凶险，预后不良。
对此，也要一些动脉粥样硬化生物标志物已经被研究，现有技术参考如下：
CN112305119A中公开了动脉粥样硬化性脑梗死生物标志物PC(P-18:0/18:1(11Z))。
CN113646631A中公开了检测动脉硬化相关疾病的标志物NPC2蛋白和/或IGFBP7蛋白。
CN113403384A中公开了用于评估体内动脉粥样硬化性疾病或者动脉粥样硬化斑块发展情况的生物标志物CD38基因和/或CD38蛋白。
目前这些生物标注物，虽然能够一定程度上检测出动脉粥样硬化，但是并不全面，需要进一步挖掘出更适宜、检测结果更为稳定的生物标志物。
发明内容
本发明的目的是提供动脉粥样硬化生物标志物及其应用，对动脉粥样硬化结果检测更稳定，丰富了动脉粥样硬化生物标志物库。
本发明的第一方面，提供动脉粥样硬化生物标志物，包括CD99基因、ARPC1B基因、PIP4K2A基因、RPS27基因、PPP1CB基因中的任意一种或几种。
本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述的生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化的诊断或检测产品中的应用。
优选地，所述生物标志物CD99基因、ARPC1B基因、PIP4K2A基因、RPS27基因、PPP1CB基因联合使用，具有高灵敏度、高特异性、稳定性好、检测迅速等优点。
第三方面，本发明提供了一种动脉粥样硬化诊断或检测试剂盒，包括检测本发明第一方面所述的动脉粥样硬化生物标志物表达水平的试剂。
优选地，检测所述动脉粥样硬化生物标志物表达水平的试剂包括RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR扩增试剂。
优选地，检测所述动脉粥样硬化生物标志物表达水平的PCR扩增引物为：
利用本发明试剂盒对动脉粥样硬化进行诊断，相比传统仅利用影像学诊断方法，更具有早期诊断的应用价值，有助于早期发现治未病，减少疾病发展的医疗成本，降低急重动脉粥样硬化发生的几率，改善病人生存质量。
相比现有技术，本发明提供的五种生物标志物，单独使用，特异性和灵敏性更好，尤其适用于联合使用，检测稳定性更高。
附图说明
附图1为不同样本生物标志物CD99、ARPC1B、PIP4K2A、PPP1CB的q-pcr基因检测结果；
附图2为不同样本生物标志物RPS27和对照TLK1、C6CAF62的q-pcr基因检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
动脉粥样硬化生物标志物的筛选
收集25例动脉粥样硬化患者和25例健康人，信息如下表1：
表1样本信息
1.样本血小板分离和RNA提取
取样本血液，在收集后24小时内从血液样品中分离血小板，以尽量减少血小板RNA质量和数量的损失。为了分离血小板，富含血小板血浆(PRP)在1000rpm的离心步骤分离。抽取的PRP并转移到1.5ml Eppendorf管中，然后通过20分钟3000rpm的离心步骤使血小板沉淀。随后除去上清液，观察到血小板为白色沉淀。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤血小板，然后在15分钟3000rpm离心步骤后将其去除，之后进行瞬时离心，并去除残留的PBS溶液。沉淀的血小板使用TRIzol试剂(Invitrogen)处理纯化总RNA。
2.文库构建和RNA测序
样品检测合格(OD260/OD280值在1.8-2.0)，用带有Oligo(dT)的磁珠富集RNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA随机打断。以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成cDNA第二链，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。库检合格后，不同文库按照有效浓度及目标下机数据量pooling后Illumina Novaseq 6000测序。
3.差异基因分析
使用DEseq2比较健康人组与动脉粥样硬化患者组mRNA的表达差异，共筛选出647个差异基因，其中与健康组相比，动脉粥样硬化有509个基因上调，138个基因下调(|Log2FC|>2和q-value≤0.05)。为了识别有价值的基因，我们进一步选择了BaseMean值(BaseMean值比较低，即基因的丰度比较低，比如某个基因，在A组中的表达量均值为16，在B中的平均表达量为2，虽然差了8倍，但由于丰度低，可信度就低，很有可能也会判定为无差异。)靠前的30个基因作为潜在生物标志物，包含：H3F3A，ARPC1B，PIP4K2A，TLK1，MTND2P28，C6orf62，RPS27，ANXA3，PPP1CB，TMSB4XP8，MTATP6P1，HLAC，H3F3AP4，CD99，FTH1P2，FTH1P8，SMIM3，FTLP3，FTH1P7，YWHAZP3，HMGB1P5，HLADRA，YWHAZP2，VAMP7，CTSS，PTMAP2，EEF1A1P5，详细信息见表2。
表2 30个潜在生物标志物的信息
4.KEGG通路富集分析
KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，在KEGG PATHWAY数据库中，将生物代谢通路划分为6类，分别为：细胞过程(Cellular Processes)、环境信息处理(Environmental Information Processing)、遗传信息处理(Genetic InformationProcessing)、人类疾病(Human Diseases)、新陈代谢(Metabolism)、生物体系统(Organismal Systems)。将预处理的差异表达基因进行KEGG通路富集分析，了解差异表达基因的相关功能与作用通路，并筛选出相应的核心基因，详见表3。
表3筛选出的核心基因
实施例2
标志物鉴定
受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积(area undercurve，AUC)越大，试验的诊断价值越大。AUC>0.5的情况下，AUC越接近1，表明诊断标志物的诊断效果越好。约登指数(Youden index)也称正确指数，是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时，即可应用约登指数。约登指数是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。
将各通路的核心基因与之前筛选出的30个差异基因进行交集，得到：CD99、VAMP7、CTSS、ARPC1B、PIP4K2A、RPS27、PPP1CB。以约登指数≥0.8，AUC≥0.5，且是通路核心基因为条件，筛选出CD99、ARPC1B、PIP4K2A、RPS27、PPP1CB这5个基因为动脉粥样硬化诊断的生物标志物。
表4 5个生物标志物对应的AUC值、敏感度、特异性和约登指数
| 基因 | AUC | 敏感度 | 特异性 | 约登指数 |
| CD99 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| VAMP7 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| CTSS | 0.600 | 0.600 | 1.000 | 0.600 |
| ARPC1B | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| PIP4K2A | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| RPS27 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| PPP1CB | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
实施例3
基因验证
通过测序获得目标基因序列，利用Primer Premier 6软件设计所选取的5个预选靶基因的qpcr引物，同时为验证基因相对表达量的准确性，选取TLK1、C6CAF62作为对照，引物序列见表5。
表5 5个预选靶基因和对照基因的qpcr引物
采集动脉粥样硬化患者样本16例和健康人样本25例，使用设计的引物进行q-pcr验证，过程如下：结果见附图1、2。
样本经过血小板分离、RNA提取质检后(过程同上)，进行逆转录，转录体系如表6下(反转录试剂均采自赛默飞)：
表6转录体系及反应程序
转录后的产物(cDNA)即可进行q-PCR，反应体系如下表7：
表7 q-PCR反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 2x SYBR GREEN Mix | 5ul |
| Primer-F(10uM) | 0.2ul |
| Primer-R(10uM) | 0.2ul |
| <![CDATA[Rnasy-free H<sub>2</sub>O]]> | 3.6ul |
| cDNA | 1ul |
反应程序为：
最终实验结果：CD99、ARPC1B、PIP4K2A、RPS27、PPP1CB在健康人和动脉粥样硬化患者中相对表达量具有统计学差异(p<0.05)。参见表8。
表8不同样本中5个生物标志物基因的相对表达量及P值
截断值
截断值即判断标准，对于变量为二分类的数据，连续型自变量截断值的确定通过ROC分析，选用约登指数(敏感度+特异度-1)最大的点(最大值)为最佳截断值点，是判定健康人与动脉粥样硬化患者的界值，确定基因表达量中正常值和患病值的范围，以区分正常与异常。分别计算得到CD99、ARPC1B、PIP4K2A、RPS27、PPP1CB约登指数最大值分别为0.8、0.9、0.8、1.0、0.5。CD99、ARPC1B、PIP4K2A、RPS27、PPP1CB约登指数最大值对应的截断值分别为1.095、5.195、4.745、6.61、2.626。当ARPC1B、PIP4K2A、RPS27、PPP1CB相对表达量低于对应基因的截断值时，依据基因约登指数最大值对应的敏感度和特异性评估患者动脉粥样硬化的发生率。CD99相对基因表达量高于截断值时，依据基因约登指数最大值对应的敏感度和特异性评估患者动脉粥样硬化的发生率。
表9 5个生物标志物基因的特异性、敏感度、约登指数及截断值
| 基因 | 特异性 | 敏感度 | 约登指数 | 截断值 |
| CD99 | 0.9 | 0.9 | 0.8 | 1.095 |
| PIP4K2A | 0.9 | 0.9 | 0.8 | 4.745 |
| PPP1CB | 0.7 | 0.8 | 0.5 | 2.626 |
| RPS27 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 6.61 |
| ARPC1B | 0.9 | 1.0 | 0.9 | 5.195 |
经过验证，结果表明CD99、ARPC1B、PIP4K2A、RPS27、PPP1CB这5个基因可以作为动脉粥样硬化诊断的生物标志物。
Claims (6)
1.动脉粥样硬化生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括CD99基因、ARPC1B基因、PIP4K2A基因、RPS27基因、PPP1CB基因中的任意一种或几种。
2.如权利要求1所述的动脉粥样硬化生物标志物在制备诊断或检测动脉粥样硬化产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物标志物包括CD99基因、ARPC1B基因、PIP4K2A基因、RPS27基因、PPP1CB基因联合使用。
4.一种动脉粥样硬化诊断或检测试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1所述的动脉粥样硬化生物标志物表达水平的试剂。
5.根据权利要求4所述的一种动脉粥样硬化诊断或检测试剂盒，其特征在于，检测所述动脉粥样硬化生物标志物表达水平的试剂包括RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR扩增试剂。
6.根据权利要求5所述的一种动脉粥样硬化诊断或检测试剂盒，其特征在于，检测所述动脉粥样硬化生物标志物表达水平的PCR扩增引物如下：
CD99的引物序列如SEQ No.1-2所示；
ARPC1B的引物序列如SEQ No.3-4所示；
PIP4K2A的引物序列如SEQ No.5-6所示；
RPS27的引物序列如SEQ No.7-8所示；
PPP1CB的引物序列如SEQ No.9-10所示。
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|---|---|---|---|---|
| CN116987809A (zh) * | 2023-07-24 | 2023-11-03 | 广东海洋大学 | 波吉卵囊藻内参基因及其扩增引物和应用 |
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- 2022-10-28 CN CN202211333164.7A patent/CN115976188A/zh active Pending
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