CN115974862A - 一种基于protac原理的hl化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于PROTAC原理的HL化合物及其制备方法和应用，HL化合物由E3配体、连接体和Tau结合配体顺次连接而成，其中，E3配体为来那度胺、马来酰亚胺或桥环化合物；连接体为饱和碳链+三氮唑；Tau结合配体为螺环化合物或东莨菪素。本发明中的HL化合物制备方法简单，所制得的化合物在25～50μM的剂量区间内具有较低的细胞毒性，而在该剂量区间，HL化合物能够有效降解细胞Tau，可以显著降低Tau蛋白的含量，对阿尔茨海默症、额颞叶痴呆、缺血性卒中等神经疾病具有优良的防治效果。
Description
技术领域
本发明属于药物合成技术领域，具体涉及一种基于PROTAC原理的HL化合物及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera，PROTAC)是一种双头分子，能够通过诱导选择性细胞内蛋白水解来除去不需要的蛋白质。PROTAC由两个蛋白质结合部分组成，一个用于结合E3泛素连接酶，而另一个用于结合靶蛋白。通过结合两种蛋白质，PROTAC将靶蛋白带至E3连接酶，导致靶蛋白的标记(即泛素化)，随后被蛋白酶体降解。
泛素化涉及三个主要步骤：活化、偶联及连接，分别由泛素活化酶(E1)、泛素偶联酶(E2)及泛素连接酶(E3)进行。此连续级联的结果是将泛素与靶蛋白共价结合。泛素化的蛋白质最终会由蛋白酶体降解。
PROTAC技术出现于2001年，自此，该技术已被用于几种药物设计：pVHL、MDM2、β-TrCP1、小脑蛋白(cereblon)、及c-IAP1。虽然这些现有技术的PROTAC药物非常有用，但仍需要更好的PROTAC药物。
Tau蛋白是阿尔茨海默症、额颞叶痴呆、缺血性卒中等神经疾病发病通路中的关键蛋白，并参与神经系统中铁稳态和铁死亡的调控，Tau蛋白的磷酸化和异常聚集是其主要致病通路。近年来，利用ASO、siRNA、基因敲除、翻译后修饰调控等方法抑制Tau蛋白异常表达被证实在阿尔茨海默症、额颞叶痴呆、缺血性卒中等神经疾病中起到关键作用，但到目前为止，尚未开发出以Tau蛋白为靶点的有效治疗干预措施。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种基于PROTAC原理的HL化合物及其制备方法和应用，以制得一种对Tau蛋白的表达具有良好抑制能力的化合物。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种基于PROTAC原理的化合物，化合物的结构式如式I所示，
其中，E3配体为来那度胺、马来酰亚胺或桥环化合物；连接体为饱和碳链+三氮唑；Tau结合配体为螺环化合物或东莨菪素。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，HL化合物的结构式如式II所示，
其中，0≤n≤6；R为H或卤素。
进一步，R为H或Cl。
进一步，HL化合物为具有如下结构式的化合物中的一种：
本发明还公开了基于PROTAC原理的HL化合物的制备方法，制备方法包括以下步骤：
S1：将如式III和IV所示的化合物按1～2:1的摩尔比共溶于有机溶剂中，然后加入碱，于100～120℃下反应2～12h，得如式V所述化合物；
其中，0≤n≤6；
S2：将如式V和VI所示的化合物按1:1的摩尔比共溶于有机溶剂中，再加入L-抗坏血酸钠和五水硫酸铜，于室温下反应3h，得如式VII所示化合物；所加入的L-抗坏血酸钠和五水硫酸铜与化合物V的摩尔比为0.3:0.2:1；
其中，R为H或Cl。
进一步，S1中所用有机溶剂为NMP，所用碱为二异丙基乙胺(DIPEA)；S2中所用有机溶剂为二甲亚砜。
进一步，化合物II的合成路径如下：
具体包括以下步骤：
SS1：将端基二醇化合物、对甲苯磺酰氯和三乙胺按5:10～12:15的摩尔比共溶于有机溶剂中，于室温下反应20～25h，得端基二醇双对甲苯磺酸酯衍生物；
SS2：将等摩尔量的端基二醇双对甲苯磺酸酯衍生物和叠氮钠共溶于有机溶剂中，于室温下反应20～25h，得叠氮醇对甲苯磺酸酯衍生物；
SS3：将叠氮醇对甲苯磺酸酯衍生物和碘化钠按1:2的摩尔比共溶于丙酮中，回流反应1h，即得。
本发明还公开了基于PROTAC原理的HL化合物在制备抑制Tau蛋白表达药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明中的HL化合物制备方法简单，所制得的化合物在25～50μM的剂量区间内具有较低的细胞毒性，而在该剂量区间，HL化合物能够有效降解细胞Tau，可以显著降低Tau蛋白的含量，对阿尔茨海默症、额颞叶痴呆、缺血性卒中等神经疾病具有优良的防治效果。
附图说明
图1为细胞培养过程中的药物添加方式示意图；
图2为Western Blot实验中得到的Tau蛋白条带示意图；
图3为Western Blot实验中得到的内参β-actin条带示意图；
图4为化合物加药后细胞剩余Tau蛋白含量统计图；
图5为不同剂量化合物加药后的蛋白条带示意图；
图6为不同剂量化合物加药后细胞剩余Tau蛋白含量统计图；
图7为不同剂量化合物加药后细胞生存率曲线；
图8为全部药物的细胞Tau降解活性的综合统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1：合成基于PROTAC原理的HL化合物
采用如下合成路径合成基于PROTAC原理的HL化合物：
具体包括以下步骤：
(1)合成化合物III
(i)：取端基二醇化合物(5mmol)和对甲苯磺酰氯(11mmol)，加二氯甲烷30mL，搅匀，再加入三乙胺(15mmol)，室温反应24h；经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)，得到呈白色粉末的端基二醇双对甲苯磺酸酯衍生物。
(ii)：取端基二醇双对甲苯磺酸酯衍生物(4mmol)，叠氮钠(4mmol)，加DMF5mL，于室温下反应24h，经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)，得到呈无色油状物的叠氮醇对甲苯磺酸酯衍生物。
(iii)：取(ii)所得叠氮醇对甲苯磺酸酯衍生物(0.4mmol)，碘化钠(0.8mmol)，加丙酮2mL，回流反应1h，得碘代叠氮化合物，即化合物III。
(2)合成化合物V
化合物III到化合物V的反应方程式如下：
取化合物III(0.3mmol)，来那度胺(化合物IV)(0.2mmol)，DIPEA(0.6mmol)及N-甲基吡咯烷酮(NMP，2mL)加入反应瓶中，于110℃反应8h。经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:5)，得到目标产物化合物V。
(3)合成化合物VII
化合物V到化合物VII的反应方程式如下：
将化合物V和螺环化合物(化合物VI，其中R为H或Cl)按1:1的摩尔比共溶于二甲亚砜溶剂中，加入L-抗坏血酸钠(与化合物V的摩尔比为0.3:1)，五水硫酸铜(与化合物V的摩尔比为0.2:1)，少许水(1～2滴)，于室温下反应3h，得如式所述化合物VII，即基于PROTAC原理的HL化合物。
所合成的化合物结构表征结果如下：
＝7.7Hz,1H),6.81(d,J＝10.1Hz,2H),6.23(d,J＝10.1Hz,2H),5.89(t,J＝7.4Hz,1H),5.11(m,1H),4.62(t,J＝5.7Hz,2H),4.28–4.06(m,4H),3.80–3.65(m,4H),2.97–2.85(m,1H),2.69–2.56(m,1H),2.35–2.22(m,1H),2.07–1.96(m,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ185.3,173.4,171.7,169.2,144.5,143.3,140.8,140.5,136.9,134.9,132.7,129.8,129.5,127.4,124.6,123.4,112.5,111.4,86.5,65.9,52.0,49.5,47.3,46.2,43.2,31.7,23.2.HRMS(ESI)calculated for C29H27N7NaO7S2[M+H]+:672.1311,found672.1292.
Hz,1H),7.29(t,J＝7.8Hz,1H),6.95(d,J＝7.8Hz,1H),6.82(d,J＝10.0Hz,2H),6.76(d,J＝7.8Hz,1H),6.23(d,J＝10.0Hz,2H),5.71(t,J＝4.8Hz,1H),5.12(m,1H),4.57(t,J＝6.7Hz,2H),4.29–4.07(m,4H),3.76(t,J＝6.0Hz,2H),3.24–3.14(m,2H),2.99–2.84(m,1H),2.69–2.57(m,1H),2.37–2.25(m,1H),2.24–2.15(m,2H),2.08–1.98(m,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ185.3,173.4,171.8,169.3,144.5,143.9,140.8,140.6,137.0,134.9,132.6,129.8,129.5,127.2,124.6,123.1,112.3,110.8,86.5,65.9,51.9,48.4,47.3,46.2,31.7,29.4,23.3.
7.53(d,J＝3.7Hz,1H),7.29(t,J＝7.6Hz,1H),7.21–7.20(m,1H),6.99–6.89(m,2H),6.75(d,J＝7.6Hz,1H),6.41(d,J＝10.0Hz,1H),5.72(s,1H),5.12(m,1H),4.57(t,J＝6.4Hz,2H),4.32–4.10(m,4H),3.77(t,J＝5.5Hz,2H),3.24–3.14(m,2H),2.98–2.86(m,1H),2.68–2.58(m,1H),2.36–2.26(m,1H),2.23–2.16(m,2H),2.08–1.99(m,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ178.2,173.4,171.8,169.3,145.8,143.9,141.1,140.9,140.6,136.6,134.9,132.8,132.6,129.8,128.5,127.2,124.7,123.1,112.3,110.8,88.0,66.2,51.9,48.4,47.3,46.1,31.7,29.4,23.3.HRMS(ESI)calculated for C30H28ClN7NaO7S2[M+H]+:720.1078,found 720.1068.
3.9Hz,1H),7.27(t,J＝8.0Hz,1H),6.92(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝10.0Hz,2H),6.75(d,J＝8.0Hz,1H),6.24(d,J＝10.0 Hz,2H),5.62(s,1H),5.11(m,1H),4.48(t,J＝6.8 Hz,2H),4.27–4.08(m,4H),3.76(t,J＝6.1Hz,2H),3.17(t,J＝5.8 Hz,2H),2.97–2.86(m,1H),2.70–2.57(m,1H),2.35–2.25(m,1H),2.07–1.93(m,3H),1.62–1.51(m,2H).13CNMR(100 MHz,DMSO-d6)δ185.3,173.4,171.7,169.3,144.5,144.1,140.8,140.6,136.9,134.9,132.5,129.7,129.5,126.9,124.6,122.8,112.2,110.5,86.5,65.9,51.9,50.1,47.3,46.2,42.4,31.7,27.7,25.8,23.3.
7.52(d,J＝3.9 Hz,1H),7.27(t,J＝8.0 Hz,1H),7.21(d,J＝2.9 Hz,1H),6.95–6.89(m,2H),6.75(d,J＝8.0 Hz,1H),6.42(d,J＝10.0 Hz,1H),5.63(t,J＝5.4 Hz,1H),5.11(m,1H),4.49(t,J＝6.9 Hz,2H),4.31–4.07(m,4H),3.77(t,J＝6.8 Hz,2H),3.22–3.13(m,2H),2.98–2.86(m,1H),2.68–2.56(m,1H),2.36–2.24(m,1H),2.09–1.92(m,3H),1.63–1.50(m,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ178.2,173.4,171.7,169.3,145.8,144.0,141.2,140.9,140.6,136.6,134.9,132.7,132.5,129.7,128.5,126.9,124.6,122.8,112.2,110.5,88.0,66.2,51.9,50.1,47.3,46.2,42.4,31.7,27.7,25.8,23.3.
4.0 Hz,1H),7.27(t,J＝7.8 Hz,1H),6.92(d,J＝7.8 Hz,1H),6.82(d,J＝10.0Hz,2H),6.73(d,J＝7.8 Hz,1H),6.23(d,J＝10.0 Hz,2H),5.54(t,J＝5.8 Hz,1H),5.11(m,1H),4.43(t,J＝6.9 Hz,2H),4.26–4.08(m,4H),3.75(t,J＝6.2 Hz,2H),3.16–3.03(m,2H),2.97–2.83(m,1H),2.69–2.59(m,1H),2.37–2.21(m,1H),2.10–2.00(m,1H),1.92–1.83(m,2H),1.63–1.53(m,2H),1.46–1.36(m,2H),1.36–1.27(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ185.3,173.4,171.8,169.4,144.5,144.2,140.8,140.6,136.9,134.9,132.5,129.7,129.5,126.9,124.6,122.8,112.2,110.4,86.5,65.9,51.9,50.3,47.3,46.2,43.0,31.7,29.9,28.8,26.5,26.1,23.3.HRMS(ESI)calculated for C33H35N7NaO7S2[M+H]+:728.1937,found 728.1935
7.51(d,J＝3.9 Hz,1H),7.27(t,J＝7.4 Hz,1H),6.92(d,J＝7.4 Hz,1H),6.82(d,J＝10.0 Hz,2H),6.73(d,J＝7.4 Hz,1H),6.24(d,J＝10.0 Hz,2H),5.55(s,1H),5.11(m,1H),4.42(t,J＝6.9 Hz,2H),4.29–4.07(m,4H),3.75(t,J＝6.2 Hz,2H),3.14–3.03(m,2H),2.98–2.87(m,1H),2.69–2.58(m,1H),2.35–2.23(m,1H),2.09–1.98(m,1H),1.91–1.80(m,2H),1.62–1.51(m,2H),1.42–1.19(m,8H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ185.3,173.4,171.8,169.4,144.5,144.2,140.8,140.8,136.9,134.9,132.5,129.7,129.5,126.9,124.6,122.8,112.2,110.4,86.5,65.9,51.9,50.3,47.3,46.2,43.2,31.7,29.9,29.2,28.9,28.8,27.0,26.2,23.3.
实施例2：化合物VII的Tau降解功能验证
1、细胞培养和铺板
实验使用代数为19～25代，状态良好的N2a细胞系。将细胞按照1×105个/mL(2×104个/cm2)的密度种于六孔板，一个孔作为一个生物重复，同一样本组的多个重复穿插接种于六孔板的不同位置，如图1所示。当细胞生长至70％密度时，加药组更换含50μM化合物VII(编号1～3，分别对应上述化合物7b、7c和7a)DMSO溶液的无血清DMEM培养基；对照组添加含等量DMSO的无血清DMEM培养基。
2、细胞蛋白提取
加药后24h进行细胞蛋白提取，全部操作在冰上进行，具体包括以下步骤：
①蛋白裂解液配制：使用Western及IP细胞裂解液(碧云天，P0013)+1％PMSF(碧云天，ST505)混合；
②去除培养基，将六孔板中的细胞使用DPBS冲洗一遍；
③将蛋白裂解液按照每孔50μL加入各孔，计时为0min；
④使用细胞刮刀将贴壁细胞刮下来，将细胞+裂解液转移至底部预冷的1.5mL EP管中；
⑤计时30min时，将EP管于4℃13000×g离心25min；
⑥离心完毕后，将上清液(蛋白提取液)转移至另一底部预冷的EP管。
3、制样和Western Blot
制样和Western Blot的全部流程具体包括以下步骤：
①总蛋白浓度测定：利用BCA比色法完成总蛋白浓度测定。取2μL蛋白提取液加入96孔板，PBS稀释至20μL，配制并加入BCA工作液200μL，37℃孵育30min后测562nm处吸光度值，每个样品孔做两个重复。使用BCA试剂盒(Thermo,23225)中提供的蛋白标准品绘制标准曲线，根据得到的吸光度值分别计算每个样品的平均总蛋白浓度。
②制样：蛋白样中加入10x Loading Buffer(Thermo,NP0008)和4x ReducingAgent(Thermo,NP0009)，用ddH2O稀释至1μg/μL的终浓度，97℃金属浴加热10min。
③电泳：使用4-20％蛋白预制胶(Genscript,M42015C)，按顺序向各孔加入20μL蛋白样品或5μL蛋白marker，向电泳槽中注满Running Buffer(Genscript,M00138)，在140V电压下电泳70min。
④转膜：在Transfer Buffer(Tris-Glycine-SDS-乙醇)中组成三明治体系并转移至转膜槽，槽内注满Transfer Buffer，在100V电压下冰上转膜60min，以将预制胶上的蛋白印迹转至PVDF膜上。
⑤封闭：将转膜完毕的PVDF膜立即正面(凸出面)朝下置入5％脱脂奶粉的孵育盒中，常温振摇1h。
⑥Tau抗体孵育：一抗为1:2000稀释的Human-tau抗体(DAKO,A0024)，4℃孵育18-24h；二抗为1:5000稀释的兔二抗，常温孵育2h。在一抗、二抗孵育后均采用TBST进行漂洗以去除膜上未结合的残余抗体。
⑦Tau条带曝光：配制500μL发光液(新赛美，P10300)，均匀滴加于PVDF膜表面，采用自动曝光模式进行成像，得到的Tau蛋白条带如图2所示。
⑧膜再生：曝光完毕后，将膜倒置于原孵育盒中，ddH2O振摇5min，加入膜再生液(强碱性，碧云天，P0025)剧烈振摇5min，ddH2O振摇5min，TBST振摇5min，重新进行⑤封闭。
⑨β-actin内参孵育和曝光：一抗为1:10000稀释的β-actin(sigma,A5441)，二抗为1:5000稀释的鼠二抗。其余步骤和条件同⑥⑦，得到的β-actin条带如图3所示。
4、条带分析与统计
图像的处理和条带丰度分析使用ImageJ软件进行，数据汇总和统计使用GraphPad软件进行。
①使用ImageJ的内置工具进行背景去除和图片旋转；
②使用Rectangle工具框选最左侧条带(Tau选取50-70kD之间的三条带，β-actin选取40-50kD之间的单条带)，使用Gels工具依次框选同一水平位置的所有条带，Ctrl+3调取Plot，如图2-3所示；
③使用Straight工具将条带区域闭合，使用Wand工具计算条带区域的面积；
④计算每个样品的Tau/β-actin相对丰度，将每个样品相对丰度与对照组的平均相对丰度相除，计算百分率，导入至GraphPad进行两独立样本t检验，并绘图，具体结果如图4所示。从图中可以看出，在50μM的剂量下，化合物17-19对N2a细胞中的Tau蛋白具有清除作用。
5、化合物VII的Tau降解剂量区间及毒性验证
重复上述方法，对化合物VII(编号3)在1μM、5μM、25μM给药剂量下的Tau降解效果进行测试，得到的Tau蛋白条带及β-actin条带如图5所示，统计结果如图6所示。从图中可以看出，化合物化合物VII(编号3)在25μM的剂量下对N2a细胞中的Tau蛋白具有清除作用，而1-5μM的剂量下并无显著清除作用，说明化合物VII(编号3)较为显著的细胞Tau降解剂量区间可能在25μM以上。
利用MTT细胞毒性试验方法，对化合物VII(编号3)在N2a细胞系上进行了细胞毒性测试(n＝6)，制作细胞生存率-加药剂量曲线，如图7所示。从图中可以看出，在具有显著细胞Tau降解效果的25-50μM剂量区间内，化合物VII(编号3)的细胞毒性较低，约为10-15％。
6、PROTAC化合物降Tau效果综合分析
重复上述方法，对本发明所陈列出的所有HL化合物在N2a上的降Tau效果进行综合分析，如图8所示。从图中可以看出，所有化合物均具有清除胞内Tau蛋白表达的趋势，其中约80％具有显著性，表明了这一系列药物普遍具有Tau降解活性。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于PROTAC原理的HL化合物，其特征在于：所述HL化合物的结构式如式I所示，
E3配体-连接体-Tau结合配体
(I)
其中，E3配体为来那度胺、马来酰亚胺或桥环化合物；连接体为饱和碳链+三氮唑；Tau结合配体为螺环化合物或东莨菪素。
2.根据权利要求1所述的基于PROTAC原理的HL化合物，其特征在于：所述HL系化合物的结构式如式II所示，
其中，0≤n≤6；R为H或卤素。
3.根据权利要求2所述的基于PROTAC原理的HL化合物，其特征在于：所述R为H或Cl。
4.根据权利要求3所述的基于PROTAC原理的HL化合物，其特征在于，所述化合物为具有如下结构式的化合物中的一种：
5.权利要求1～4任一项所述的基于PROTAC原理的HL化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将如式III和IV所示的化合物按1～2:1的摩尔比共溶于有机溶剂中，然后加入碱，于100～120℃下反应2～12h，得如式V所述化合物；
其中，0≤n≤6；
S2：将如式V和VI所示的化合物按1:1的摩尔比共溶于有机溶剂中，再加入L-抗坏血酸钠和五水硫酸铜，于室温下反应3h，得如式VII所示化合物；所加入的L-抗坏血酸钠和五水硫酸铜与化合物V的摩尔比为0.3:0.2:1；
其中，R为H或Cl。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：S1中所用有机溶剂为NMP，所用碱为DIPEA；S2中所用有机溶剂为二甲亚砜。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述化合物III经过以下步骤制得：
SS1：将端基二醇化合物、对甲苯磺酰氯和三乙胺按5:10～12:15的摩尔比共溶于有机溶剂中，于室温下反应20～25h，得端基二醇双对甲苯磺酸酯衍生物；
SS2：将等摩尔量的端基二醇双对甲苯磺酸酯衍生物和叠氮钠共溶于有机溶剂中，于室温下反应20～25h，得叠氮醇对甲苯磺酸酯衍生物；
SS3：将叠氮醇对甲苯磺酸酯衍生物和碘化钠按1:2的摩尔比共溶于丙酮中，回流反应1h，即得。
8.权利要求1～4任一项所述的基于PROTAC原理的HL化合物在制备抑制Tau蛋白表达药物中的应用。
9.权利要求1～4任一项所述的基于PROTAC原理的HL化合物在制备治疗神经疾病的药物中的应用。
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