CN113307793A

CN113307793A - 基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物及其制备方法、药物组合物和应用

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Publication number: CN113307793A
Application number: CN202110529607.9A
Authority: CN
Inventors: 梁美好; 黄文海; 谷丽丽; 沈正荣; 曾申昕; 王尊元; 马臻; 章迟啸
Original assignee: Hangzhou Medical College
Current assignee: Hangzhou Medical College
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-05-14
Also published as: CN113307793B

Abstract

本发明公开了一种基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物，为式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物；其中，n为1～10的整数。本发明还公开了所述化合物的制备方法、药物组合物以及在制备预防或/和治疗神经变性疾病的药物中的应用。本发明化合物以其独有的诱导蛋白降解机制，可降低药物的使用剂量，减轻毒副作用。

Description

基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物及其制备方法、药物组合物和应用

技术领域

本发明涉及药物化合物合成领域，具体涉及一种基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物及其制备方法、药物组合物和应用。

背景技术

目前我国人口的老龄化问题日趋严重，《2018年世界阿尔茨海默症报告》显示，每三秒就会有一例新的阿尔茨海默症(老年痴呆症AD)病例出现，2018年约有5000万AD患者，研究人员预计到2050年，这一数字将增加两倍，是2018年全球第五大死亡原因。

Tau蛋白病理性异常高度磷酸化是AD的特征性早期病理改变，且其异常聚集于AD病理分级呈正相关。当大脑产生神经退行性病变时，过度或异常磷酸化的Tau蛋白增多，并易与其它Tau蛋白形成线状细丝，后聚集成成对螺旋细丝，螺旋细丝堆积最终形成神经纤维缠结(Brain Res Brain Res ReV 2001,35(3):266)。过度或异常磷酸化的Tau蛋白使微管稳定性散失、线粒体功能障碍，并且具有神经毒性，影响神经递质的内部转运，并诱发炎症反应，形成异常结构的神经突触，进一步促进AD的发展进程(J Alzheimers Dis,2008,14(4):431)。

细胞内的泛素-蛋白酶体系统(UPS)是一种蛋白降解系统，负责清除残次蛋白，具有依赖ATP、高效、高度选择性的特点，其催化部分是泛素化E3连接酶，但需要首先募集到需要降解的蛋白。PROTACs技术基于UPS原理设计而成，把目标蛋白配体和E3连接酶的配体用合适的化学键连接起来，从而可以识别靶蛋白且增强连接酶E3与靶蛋白的结合能力，进而靶向泛素化强迫降解靶蛋白，且具有催化剂量、高效、高度选择性等特点(Chinese Journalof New Drugs.2017,26(22),2672)。泛素化系统与AD有着密切的联系(Journal ofCellular&Molecular Medicine,2008,12(2):363)，PROTACs技术很快就在老年痴呆领域有所开展，且表现出了很大潜力。

Cereblon是由人类CRBN基因编码的蛋白，CRBN同源基因是高度保守的，这表明它在生理学中的重要性。Cereblon与损伤DNA结合蛋白1(DDBl)、Cullin-4A(CUL4A)以及Cullin-1调节器(ROCI)组成E3泛素连接酶复合体，该复合体能泛素化一系列蛋白，但具体机制尚不清楚。Cereblon是目前已知应用于PROTACs技术常用的一种E3连接酶。

苯基喹啉衍生物对Tau蛋白聚集具有很高的亲和力和选择性，为较好的Tau蛋白配体，其中第二代的喹啉衍生物¹⁸F-THK5105为常用的Tau蛋白PET放射示踪剂。Okamura等(Brain,2014,137(Pt6):1762)研究报道：¹⁸F-THK5105的保留、密度与痴呆的严重及神经元丢失程度高度相关，¹⁸F-THK5105在AD患者的颞皮质沉积较多，而这一区域是已知的AD患者脑中过度或异常磷酸化的Tau蛋白沉积密度最高的部分。¹⁸F-THK5105在下颞叶皮质中的保留在AD患者和对照者中并不重叠，提示Tau蛋白影像具有诊断价值，支持¹⁸F-THK5105在AD研究中的应用。

由此，根据PROTACs策略，将THK5105作为靶向目的Tau蛋白的配体，可以使过度或异常磷酸化的Tau蛋白被泛素化降解，达到治疗或者缓解AD患者的目的。这样的设计策略已经有报道，如：

Chen等(Cell Chemical Biology,2016,23(4):453)曾将一种Tau蛋白的配体(十三肽)与VHL的配体通过连接链连接得到PROTAC型化合物TH006，在AD动物模型中，脑内注射TH006表现出通过泛素化系统降解Tau蛋白。但该研究中使用的Tau蛋白配体为肽类，存在如分子量较大、体内稳定性差等方面的局限性，还无法透过血脑屏障。

在公开号为CN110234646A的专利申请文献中，申请人公开了如下结构的化合物40、44、45及47，但活性测试表明，其对Tau蛋白降解效果不佳，仅为C级，即：与测试化合物一起温育72小时后剩余>80％Tau蛋白。

在PROTACs降解原理的研究中，一般认为，靶蛋白、PROTAC和E3连接酶之间形成三元复合物对降解至关重要，复合物的结构可为合理的PROTAC设计提供信息。以色列魏兹曼科学研究所Nir London课题组发表的研究成果(J Chem Inf Model.2020；60(10):4894)认为：迄今为止，PROTAC设计中的主要挑战是选择最佳的Linker来连接这两个结合组分，大多数情况下使用化学合成来筛选各种长度的Linker。一些情况下已表明靶标与E3连接酶之间的蛋白质-蛋白质界面(包括与Linker的相互作用)对于协同作用至关重要，其他情况下Linker达到一定长度就足够了。一个稳定的包含蛋白质-蛋白质相互作用的三元复合物对有效降解至关重要，但目前尚无方法预测或设计Linker，这需要大量合成工作。

发明内容

本发明提供了一种基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物及其药物组合物。由于连接链的不同，与公开的现有技术相比，该化合物不仅具有优异的靶向目的蛋白降解作用，还能减少对人体的毒副作用，在制备预防/治疗神经变性疾病的药物中有所应用。

本发明的技术方案如下：

一种基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物，包括式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物：

其中，n为1～10的整数。

本发明通过使用连接链将靶向Tau蛋白的小分子化合物和E3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白配体进行连接，制得一种蛋白降解靶向联合体(PROTACs)双功能小分子，能够选择性靶向Tau蛋白降解，对神经变性疾病具有较好的治疗效果。

优选地，n为1～7的整数；进一步优选地，n为1～4的整数。优选的化合物具有比较好的诱导Tau降解作用和抗肿瘤活性。

进一步优选地，n为2～3的整数。优选的化合物具有更好的诱导Tau降解作用和抗肿瘤活性。

本发明所述的化合物还包括式(I)所示的化合物的立体异构体。本发明化合物的所有立体异构体，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及他们的混合物(如外消旋物)，均包括在本发明的范围内。

本发明所述的化合物还包括式(I)所示的化合物的互变异构体。属于“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能垒相互转化的不同能量的结构异构体。

本发明所述的化合物还包括式(I)所示化合物的衍生物前药；式(I)的衍生物自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

本发明所述的化合物还包括式(I)的化合物的药学上可接受的盐，包括：与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、茶二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸或苯甲酸形成的加成盐；或与盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸或琉柏酸成盐。

本发明还提供了式(I)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

1)将式(Ⅸ)所示的化合物与式(Ⅷ)所示的化合物溶于有机溶剂，反应得到式(Ⅶ)所示的化合物；再将式(Ⅶ)所示的化合物与卤素丙炔混合于有机溶剂，反应得到式(Ⅱ)所示的化合物；

2)将式(Ⅵ)所示的化合物与叠氮化盐混合于有机溶剂，反应得到式(Ⅴ)所示的化合物；再将式(Ⅴ)所示的化合物与式(Ⅳ)所示的化合物混合于有机溶剂，反应得到式(Ⅲ)所示的化合物；

3)将式(Ⅲ)所示的化合物与式(Ⅱ)所示的化合物混合于有机溶剂，反应得到式(I)所示的化合物；

其中，n的定义与式(I)中一致。

上述步骤的反应式如下所示：

其中，n的定义与式(I)中一致。

一种药物组合物，包括式(I)所述的化合物或其药学上可接受的盐、水合物；还包括药学上可接受的赋形剂。

在所述的药物组合物中，式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物作为活性成份，与药学上可接受的赋形剂混合制成药物组合物。所述的赋形剂为用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体。

一种在药物组合物中加入药学上可接受的辅料制成的临床上可接受的剂型。所述制剂的剂型为注射剂、片剂或胶囊剂。

本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐、水合物在制备预防或/和治疗神经变性疾病的药物中的应用。

所述的神经变性疾病为阿尔茨海默症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、白内障、帕金森氏病、克-雅二氏病及其与“疯牛”相关的新变种、亨廷顿氏病、伴有Lewy体形成的痴呆、多系统萎缩症、哈-斯病、弥散性Lewy体疾病、致命性家族失眠症、格斯特曼-斯特劳斯勒-杉克病或者伴有淀粉样变性病-荷兰型的遗传性脑溢血。

优选的，所述的神经变性疾病为阿尔茨海默症。

本发明与现有技术相比，具有以下效果：

(1)本发明式(I)所示的双功能小分子可以对Tau蛋白进行泛素化标记，仅需较少用量即可诱导Tau蛋白降解，这个过程类似于催化反应，并不需要等摩尔量的药物，能减轻对人体的毒副作用；

(2)本发明式(I)所示的双功能小分子具有较好的化学稳定性，这对后续的实际应用提供了保障；

(3)由于连接链的不同，本发明式(I)所示的化合物表现出了优异的靶向Tau蛋白降解作用，在医药领域具有巨大的应用前景。

附图说明

图1为细胞分别与化合物I2、I3、I4孵育24h后的细胞形态；其中，A为空白对照，B为I2，C为I3，D为I4；

图2为实施例5制得的化合物对Tau蛋白的降解效果图；其中，A为Tau蛋白相对表达量统计图，*P<0.05；B为Western blot检测Tau蛋白和内参蛋白GAPDH的条带图(与正常组比)；

图3为Western blot法检测化合物I3对细胞内Tau蛋白表达水平；其中，(A)为不同浓度(12.5，25，50，100和200μM)I3作用24h；(B)为I3同一浓度下(50μM)作用不同时间点(6，12，24，36和48h)，*P<0.05，与正常组比；

图4为Western blot法检测PC12细胞在I3(50μM)、联合MG132(4mM)或bafilomycinA1(0.4mM)作用下Tau蛋白表达水平；其中，(A)为单独I3、联合MG132(4mM)或bafilomycinA1；(B)为单独I3、联合MG132(4mM)和bafilomycin A1；*P<0.05，与对照组比；

图5为显微镜观察Tau过表达细胞经50μM I3处理24h后线粒体的分布；第一列为DAPI染色核(蓝色)，第二列是线粒体(红色)，第三列合并；

图6为化合物I3减少Aβ诱导细胞毒性；MTT法检测(A)I3对正常PC12细胞活力的影响以及(B)I3对Aβ诱导细胞活力的影响；n＝5.*p<0.05,**p<0.01。

具体实施方式

下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。本发明的原料可以从商业途径获得或通过本领域已知的方法制备。

本发明中涉及的缩写词意义为：DMF为N,N-二甲基甲酰胺，THF为四氢呋喃，PE为石油醚，EA为乙酸乙酯，DCM为二氯甲烷，MeOH为甲醇，TLC为薄层色谱。

化合物的结构通过核磁共振(¹H-NMR)和高分辨质谱(HRMS)来确定，NMR测定是用ACF-400BRUK型核磁共振仪，测定溶剂为氘代氯仿(CDC1₃)或氘代二甲亚砜(DMSO-D₆)，TMS为内标。柱层析采用200-300目硅胶。

实施例1：化合物(Ⅶ)的制备

将式(Ⅷ)所示的化合物(3.2g，19.5mmol)和式(Ⅸ)所示的化合物(2.8g，19.8mmol)溶解于DMF，于油浴150℃中保温5h。冷却，抽滤，乙酸乙酯洗固体层三次，干燥得白色固体粉末，真空干燥，得式(Ⅶ)所示的化合物4.5g，收率84.3％。

MS(ESI)：m/z＝275.23[M+H]⁺

实施例2：化合物(Ⅱ)的制备

将式(Ⅶ)所示的化合物(2.0g，7.3mmol)和3-溴丙炔溶解于DMF，再加入碳酸钾(1.2g，8.7mmol)，室温反应5h。乙酸乙酯(50ml)萃取3次，合并有机溶剂，饱和氯化钠(50ml)洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得白色固体(式(Ⅱ)所示的化合物)1.9g，收率83.3％。

MS(ESI)：m/z＝335.06[M+H]⁺

实施例3：化合物(Ⅴ)的制备(以n＝3为例)

将三甘醇二对甲苯磺酸(式(Ⅵ)所示的化合物，n＝3)(0.5g，1.1mmol)和叠氮钠(0.041g，1.1mmol)依次溶解于溶剂DMF(15ml),油浴40℃中保温反应5h，TLC检测反应终点，展开剂为EA:PE＝3:1，加90ml水，50ml EA萃取，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，干燥，得到目的产物(化合物(Ⅴ))0.35g，收率为85.4％。

MS(ESI)：m/z＝422.19[M+H]⁺

实施例4：化合物Ⅲ的合成(以n＝3为例)

将化合物(Ⅴ)(n＝3)(0.19g，0.51mmol)和化合物(Ⅳ)(0.14g，0.61mmol)溶解于DMF(5ml)中，加入缚酸剂K₂CO₃(0.08g，0.58mmol)，于油浴60℃中保温反应5h，冷却，加入30ml和EA(30ml)萃取，收集有机层，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥，得淡黄色油状物(化合物(Ⅲ)，n＝3)0.16g，收率为76.2％。

MS(ESI):m/z＝422[M+H]⁺

实施例5：化合物Ⅰ的合成(以n＝3为例)

将化合物(Ⅲ)(n＝3)(0.12g，0.28mmol)和化合物(Ⅱ)(0.09g，0.28mmol)，溶解于四氢呋喃中，依次加入硫酸铜(9.2mg，0.06mmol)和维生素C钠(11.2mg，0.06mmol)，N₂保护，室温反应24h。于反应瓶中加入纯净水(30ml)和EA(30ml)，萃取，合成有机层，干燥，浓缩，得目标产物Ⅰ3(n＝3)，淡黄色固体112.8mg，收率为55.02％。

MS(ESI):m/z＝734[M+H]⁺。

¹H-NMR(400MHz,δ,DMSO-d6)：7.96(s,1H,-C＝CH),7.84(s,1H,ArH),7.86(m,2H,J＝7.86Hz,ArH),7.84(s,2H,ArH),7.63(s,1H,ArH),7.58(s,2H,ArH),7.58(s,2H,ArH),7.31(s,1H,ArH),7.21(d,1H,J＝8.60Hz,ArH),5.13(m,2H,CH2),5.07(t,1H,J＝12.5Hz,-CH),3.69-3.70(m,4H,J＝4.6Hz，-CH₂),2.85-2.94(m，4H,-CH₂),2.79(s，6H,-N(CH3)2),2.47-2.62(m,2H,-CH2),2.02-2.11(m,4H,-CH2).

用类似的方法，可以制得目标产物Ⅰ1(n＝1)，MS(ESI):m/z＝646[M+H]⁺；目标产物Ⅰ2(n＝2)，MS(ESI):m/z＝690[M+H]⁺；目标产物Ⅰ4(n＝4)，MS(ESI):m/z＝778[M+H]⁺

实施例6：I3盐的制备

如实施例5制得的化合物I3溶于乙酸乙酯中，通入氯化氢气体，至不再有固体析出。静置，抽滤，得化合物I3的盐酸盐。

实施例7：稳定性试验

取少许化合物I3溶解于1ml纯化水中，于涡旋仪上震荡2h，样品溶解后，分别于0h、6h、24h取样品上清液进HPLC液相系统检测，检测条件为：Waters e3695,2998PDADetector，

C₁₈(2)5μ250*4.6mm，柱温37℃，检测波长221nm，流动相：水与乙腈梯度洗脱。

检测结果如表1所示，化合物I3样品在水中6h时，含量99.56％，24h时，含量为97.48％，由此说明化合物I3在水中较稳定。

表1化合物Ⅰ3在纯水中的相对含量

实施例8：细胞透膜性试验

免疫荧光染色PC12细胞暴露于化合物I3化合物24h。

将聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片上培养的PC12细胞用PBS洗涤两次，并用4％多聚甲醛在室温固定20min。

随后将细胞用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤两次并用PBS(含0.2％Triton X-100)在室温透化5min。

在室温于封闭缓冲液(含5％FBS的PBS)中温育30min后，将细胞与一抗Tau抗体(ab3931,Abcam)在室温温育2h并且与其相应二抗Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠(A0473；Beyotime)在室温温育1h。将细胞最终用含DAPI的抗荧光淬灭剂封装在显微镜载玻片上，并用带有软件图像采集的共聚焦显微镜分析。

实验结果：化合物能够进入细胞膜，并具有优良的细胞透膜性。

实施例9：Tau蛋白降解实验

1实验方法：

1.1PC12细胞的培养

大鼠嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞采用DMEM高糖培养基(10％胎牛血清，1％青链霉素混合液)，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养，1:2传代，两天传代一次。

1.2细胞药物处理

将25cm²培养瓶中处于对数生长期的PC12细胞进行消化，制成单细胞悬液，接种细胞密度为5*10⁵个/mL到6孔板中，每孔培养基为2ml，培养24h，去除旧培养基，进行加药，设为正常组，I2,I3,I4组，加含药培养基2ml，药物浓度为10μM，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h。

1.3细胞总蛋白的提取

24h采用显微镜记录细胞形态变化，之后将6孔板细胞置于冰上，预冷的PBS每孔加1ml，洗3次，加入RIPA裂解液(RIPA裂解液：PMSF＝100:1)100μl，等待3min，然后用细胞刮刀将细胞刮下来，移入1.5ml离心管，12000转，4℃，离心10min，然后吸取上清液至新标记的1.5ml离心管中，与5X loading buffer体积比4:1混合，100℃加热5min，冷却，于-20℃冰箱保存。

1.4细胞冻存:

①提前开启水浴箱，培养基、胰酶、PBS放至室温25℃，拿出冻存盒，细胞冻存管等；

②细胞用PBS冲洗一遍，加入1ml胰酶，放入孵箱消化1分钟，取出吹打直至细胞脱落皿底，加入4ml培养基终止消化；

③15ml离心管中将细胞吸入，1000rpm，离心5分钟；

④配制冻存液，培养基：FBS：DMSO＝7：2:1；

⑤吸掉离心管上清液，加入冻存液，吹打均匀，后加入1ml液体至冻存管中；

⑥将冻存管放入冻存盒中，-80℃过夜，第二日即可放入液氮中保存。

1.5Western blot

①分离胶的制备：制10％的分离胶，将玻璃板固定好，确保不会漏，加入分离胶，然后加入水除气泡和压胶，待分离胶与水之间出现一条线时，分离胶完成。

②浓缩胶的制备：制取4％的浓缩胶，去除之前压胶的水，加入浓缩胶，确保没有气泡，然后插入梳子，待胶凝固。

③凝胶电泳：在电泳槽中加入电泳液，将玻璃板固定好放入，短板朝内，放入仪器，电泳液没过长玻璃板。拔去梳子，然后进行加样，样品加样前100℃5min加热，冷却，每孔加入17ul的样品，样品旁边孔加入3ul的marker。在浓缩胶是电压80V跑，待进入到分离胶，电压改为120V，等溴酚蓝接近玻璃板底部，停止。

④转膜：0.45μm的PVDF膜先用无水甲醇活化1min左右，然后放入转膜液中浸泡20min以上，翘板，取胶，切去浓缩胶以及其余不需要的分离胶，黑板在下，依次放入海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵，白板固定。进行转膜，稳流220mA转膜1.5h。

⑤封闭：结束之后，将内参与目的蛋白位置膜剪下来，将膜PBST洗3min，加入5％脱脂奶粉(PBST配)室温封闭1h，然后PBST依次15min，5min，5min洗膜

⑥孵育一抗：洗完膜后，加入Tau一抗和GAPDH一抗(PBST配1:1000)，4℃过夜孵育。

⑦孵育二抗：第二天，回收一抗，PBST依次15min，5min，5min洗膜，加入二抗(PBST配1:2000)，孵育1h，PBST依次15min，5min，5min洗膜。

⑧显影：将A液和B液体积比1:1进行混合，然后涂抹在膜的蛋白面，使用BIO-RADChemiDoc XRS凝胶成像仪进行显影。

⑨统计学分析：使用GraphPad Prism 5对实验数据进行分析。实验数据以

表示。两组间采用T-teat检验，P值<0.05,认为有统计学差异。

2实验结果：

2.1对细胞形态的影响

不同用药组(10μM)处理细胞24h后，结果如图1所示，细胞形态学未发生显著改变，可见该类化合物对细胞无明显损伤作用。

2.2对Tau蛋白表达的影响

如图2和表2所示，统计分析结果以内参蛋白(Beta Actin)标准化后表示。化合物I2、化合物I4处理之后，较正常组Tau蛋白表达减少，化合物I3组Tau蛋白与正常组无明显差别，Tau表达量依次为I2<I3<正常组<I4，其中I2与正常组比有统计学差异(P<0.05)。

表2 Tau蛋白量内参标准化后的相对值与正常组相对值的比值(平行三次实验)

实施例10.化合物I3对TAU降解作用研究

1.方法

1.1细胞培养

高分化大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞购自中国医学科学院细胞中心(中国北京)，细胞在含10％胎牛血清的DMEM高糖中培养，置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行孵育，2-3d换液。

1.2Western blot法检测细胞内Tau蛋白水平

培养PC12细胞接种于6孔板中，设如下分组①：正常组，化合物I312.5,25，50，100，200μM组。化合物作用24h。②：正常组，药物处理6,12，24，36和48h组。化合物I3浓度为50μM。细胞按分组处理一定时间。③：正常组，I3，MG132(4uM)，I3+MG132，Bafilomycin A1(0.4uM)，I3+Bafilomycin A1，④：正常组，I3，I3+MG132，I3+Bafilomycin A1，MG132+Bafilomycin A1，I3+MG132+Bafilomycin A1。I3化合物浓度为50μM，作用时间24h。MG132(absinabs817874)4μM或Bafilomycin A1(CST,54645)0.4μM作用6h后收集细胞。

上述作用后，裂解细胞，提取细胞总蛋白，100℃变性5min。取20μg蛋白，在SDS-PAGE中以80V电压电泳，200mA，100min低温条件下转膜，室温封闭1h。孵育相应的一抗：Tau(稀释比1：1000，碧云天，AF1249)和GAPDH(稀释比1:2000,)4℃孵育过夜。室温孵育相应的二抗2h。采用ECL，凝胶成像系统(日本，AmershamImageQuant 800)进行图像采集，ImageJ分析蛋白相对灰度值。

1.3MTT法检测细胞存活率

对数生长期的细胞为5×10⁴个/mL，每孔100μL，接种于96孔板。培养过夜,设如下分组①：空白对照组，不同浓度化合物I₃(6.25，12.5，25，50，100，200μM)处理组，②正常组，Aβ_1-42(碧云天，P9001)处理组，Aβ_1-42与不同浓度化合物I₃(6.25，12.5，25，50，100μM)共处理组。24h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL，碧云天，ST316)，继续培养4h，弃培养液,每孔加150μL DMSO(碧云天,ST038)，振荡10min；然后，在酶标仪(Bio-Tek，cytation 1)波长570nm处测定吸光度值，计算细胞存活率。

1.4细胞荧光成像观察线粒体形态

细胞接种于12孔板，设立正常组，细胞Tau过表达组，细胞Tau过表达和I3共处理组，转染时细胞密度达30-50％，采用Lipo6000^TM转染试剂(碧云天，C0526)按照说明书操作进行pcDNA-GFP-Tau转染。6h后按照分组更换正常培养基和含I3的培养基继续培养。24h后，去除旧培养基，PBS洗涤，加入1mL含200nMMito-Tracker RedCMXRos(线粒体红色荧光探针，碧云天，C1035)培养基继续孵育25min，去除旧培养基，采用含DAPI的抗荧光淬灭封片液(碧云天，P0131)，采用荧光显微镜观察，拍照记录。

2.结果

2.1化合物I3对TAU降解的时间、剂量依赖性

如图3中(A)所示，采用不同浓度的化合物I3处理24h，随着浓度升高，Tau蛋白出现下降趋势，当I3浓度大于25μM时，与正常组比具有统计学差异(P<0.05)。

如图3中(B)所示，采用50μMI3处理不同时间点，随着时间延长，Tau蛋白亦出现下降趋势，当时间大于24h时，与正常组比具有统计学差异(P<0.05)，可见化合物I3对TAU蛋白降解一定剂量和时间依赖性。

2.2蛋白酶体抑制剂MG132或自噬抑制剂Bafilomycin A1干预下，PEG化合物对Tau降解的作用

如图4中(A)所示，当单独加入MG132或Bafilomycin A1时，Tau蛋白表达与正常对照无明显差异。与单独MG132处理组相比，MG132与I3共处理无明显变化。与单独Bafilomycin A1处理组相比，Bafilomycin A1与I3共处理表达下调，与单独I3处理组无明显差别。表明用Bafilomycin A1抑制自噬，I3还可激活其它通路降解Tau蛋白。如图4中(B)所示，当同时加入MG132和Bafilomycin A1时，采用I3预处理后Tau蛋白水平略低于无I3处理组，但高于单独I-3处理组，表明同时阻断蛋白酶体和自噬通路，I3降解Tau作用将明显被抑制。

2.3在Tau过表达下，化合物I3对细胞线粒体形态的作用。

在PC12细胞中，过表达Tau蛋白将引起形态变化，包括线粒体不均匀分布。如图5所示，在Tau过表达的细胞中，线粒体倾向于聚集在细胞核的一侧。过表达Tau细胞经I3处理后线粒体较均匀分布在整个细胞质中。这表明可通过细胞内Tau蛋白的部分降解，挽救线粒体的不均匀分布。

2.4化合物I3对Aβ诱导的PC12细胞毒性的影响

如图6所示，化合物I3浓度低于200μM对细胞存活率无明显影响，当化合物I3浓度达到200μM时，可明显降低PC12细胞存活率(p<0.05)，接着采用低于200μM的化合物I3与Aβ1-42(10μM)共处理，结果表明与Aβ1-42处理组相比，化合物I3在6.25-50μM提高细胞存活率，减少Aβ1-42诱导的细胞损伤，尤其是当浓度为12.5μM有显著性差异(p<0.05)，可见在化合物I3安全剂量下，可降低Aβ1-42诱导的细胞毒性。

以上实施应用例，证明本发明所发现的化合物具有诱导Tau蛋白降解的功能。

相较于蛋白抑制化合物来说，抑制蛋白往往需要将药物长期维持在较高的浓度，大剂量的使用抑制剂会造成不必要的副作用如获得性耐药；由于蛋白降解化合物特有的性质，可以大大避免耐药性的产生；另外，降解蛋白只需要少量的药物就可以，类似于催化反应，并不需要等摩尔量的药物，所以使用双功能小分子可以降低药物使用剂量，减轻毒副作用。

从而，本发明所述这些化合物和其药用组合物可以在治疗从Tau蛋白降解或抑制中获益的疾病、障碍或病症药物中有广泛的应用。

Claims

1.一种基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物，其特征在于，式(I)

所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物：

其中，n为1～10的整数。

2.根据权利要求1所述的基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物，其特征在于，n为1～4的整数。

3.根据权利要求1所述的基于CRBN配体诱导Tau蛋白降解的化合物，其特征在于，其药学上可接受的盐包括：

与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、茶二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸或苯甲酸形成的加成盐；

或与盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸或琉柏酸成盐。

4.一种如权利要求1或2所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3)将式(Ⅲ)所示的化合物与式(Ⅱ)所示的化合物混合于有机溶剂，反应得到式(I)所示的化合物。

5.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、水合物；还包括药学上可接受的赋形剂。

6.一种如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、水合物在制备预防治疗神经变性疾病药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的神经变性疾病为阿尔茨海默症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、白内障、帕金森氏病、克-雅二氏病、亨廷顿氏病、伴有Lewy体形成的痴呆、多系统萎缩症、哈-斯病、弥散性Lewy体疾病、致命性家族失眠症、格斯特曼-斯特劳斯勒-杉克病或者伴有淀粉样变性病-荷兰型的遗传性脑溢血。

8.一种如权利要求5所述的药物组合物在制备预防治疗神经变性疾病药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的神经变性疾病是阿尔茨海默症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、白内障、帕金森氏病、克-雅二氏病、亨廷顿氏病、伴有Lewy体形成的痴呆、多系统萎缩症、哈-斯病、弥散性Lewy体疾病、致命性家族失眠症、格斯特曼-斯特劳斯勒-杉克病或者伴有淀粉样变性病-荷兰型的遗传性脑溢血。