CN115963169A - 一种肉碱的检测方法及检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于临床分析检测技术领域,具体公开了一种肉碱的检测方法,同时还公开了一种用于检测肉碱的检测用试剂盒。本发明提供的肉碱检测方法,采用氨基末端长链聚合物‑生物素偶联物为衍生化试剂,对样本中的肉碱组分进行衍生化处理,使所述生物样本中的肉碱组分形成肉碱衍生物;之后使用MALDI‑MS对肉碱衍生物进行检测。本发明基于BPN衍生化的MALDI‑MS方法首次用于复杂生物样品中肉碱的定性和定量检测,特异性高、方法准确、操作简便,且灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及临床分析检测技术领域,特别是涉及一种生物样本中肉碱的检测方法,同时还涉及用于检测生物样本中肉碱的试剂盒。
背景技术
肉碱即3-羟基-4-三甲基胺基丁酸内盐的主要作用是将长链脂肪酸从胞质运输到线粒体中,以便进一步在线粒体中通过β-氧化产生能量。脂肪酸在运输前与肉碱经过酶促的酯化反应形成酰肉碱。在人血液中,肉碱主要以游离肉碱、二碳酰肉碱及少量3-5个碳的酰肉碱形式存在,同时也存在极少量的长链酰肉碱。一些遗传性代谢缺陷患者由于体内的某些代谢酶或转运蛋白异常,会导致血液中肉碱/酰肉碱浓度异常,甚至会威胁生命。因此,可以通过对血液中肉碱和/或酰肉碱水平的检测来筛查和诊断一系列遗传代谢性疾病。在临床上,血浆和干血片样本中的肉碱分析对于诊断遗传性代谢缺陷已经是不可缺少的一项内容。
早期肉碱检测主要采用电子轰击质谱(EI-MS)或气相色谱-EI质谱联用,存在的问题是EI-MS的灵敏度较低,而气相色谱的样品前处理又过于繁琐冗长,目前该方法已较少应用。目前更多使用的是液相色谱-电喷雾质谱(ESI-MS)联用法。一个广泛应用的分析流程是先用n-丁醇对肉碱/酰肉碱进行酯化反应衍生,再用液相色谱-质谱联用来进行检测。这一方法存在以下问题:一,丁醇衍生化步骤温度较高,需要60-70℃,这可能会使部分酰肉碱水解成游离肉碱,造成检测结果不准确;二,液相色谱-质谱联用的设备往往复杂昂贵,维护难度高,条件优化苛刻,对操作人员的专业性也有较高要求;三,更重要的是,由于液相色谱分离流程的存在,增加了分析时间、降低了分析通量,使得肉碱分析的成本显著提升。
在临床质谱领域,基质辅助激光解吸离子化质谱(MALDI-MS)是一种操作简便、灵敏度高、实验周期短、样本消耗量极小的质谱分析平台,适合于开展大规模临床样本的高通量自动化测试,被认为是最具应用潜力的临床质谱平台。但目前MALDI-MS还不能用于复杂样本(如血液)中的肉碱检测。原因在于,一方面,传统的MALDI-MS基质分子(如DHB、CHCA等)在低分子量区域(如m/z 50-500)会产生一系列高灵敏度信号,这些信号会显著压制同处于该分子量区域的肉碱信号;另一方面,肉碱的结构中虽然本身具有离子化位点,但相比具有多个离子化位点的大分子,其离子化效率仍应做进一步提高;还有,肉碱所处分子量范围内,在样本基质中往往也存在其他代谢小分子或盐类,由于MALDI-MS一般不与色谱联用,这些干扰物的存在会抑制肉碱的离子化和质谱信号,降低分析灵敏度。
提高生物样本中肉碱分析的准确性和工作效率、降低检测成本,仍然是相关领域、特别是临床检测行业一个重要的研究课题。因此,提供一种生物样本中肉碱的检测方法,以提高肉碱的检测准确性和效率具有重要意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种肉碱的检测方法,可以检测各种生物样本中的肉碱组分,该方法准确、操作简便,且灵敏度高。
本发明还提供了一种用于肉碱检测的试剂盒。
为解决上述技术问题,第一方面,本发明提供了一种肉碱的检测方法,包括步骤:
采用氨基末端长链聚合物-生物素偶联物为衍生化试剂,对生物样本中的肉碱组分进行衍生化处理,使所述生物样本中的肉碱组分形成肉碱衍生物;
所述氨基末端长链聚合物-生物素偶联物为式Ⅰ所示的化合物:
本发明采用的衍生化试剂为氨基末端长链聚合物-生物素偶联物(Biotin-Polymer-NH2,简称BPN),该衍生化试剂分子链的一端为伯胺氨基,另一端为生物素,在氨基与生物素之间为聚乙二醇结构的聚合物间隔基。所述衍生化处理是利用BPN上的氨基与肉碱上的羧基进行酰胺化反应,实现对所述肉碱组分的衍生化处理。
所述氨基末端长链聚合物-生物素偶联物的分子量可根据需要通过改变分子聚合物链长而变化,即通过对式I中n取值的选择,来选择合适分子质量的氨基末端长链聚合物-生物素偶联物为衍生化试剂,采用其对肉碱组分进行衍生化处理。优选地,所述氨基末端长链聚合物-生物素偶联物的分子量范围为100~3000Da。
作为本发明一种优选的实施方案,所述式Ⅰ中,n取2~5的整数。
进一步优选地,n取3或4的整数。
作为一种具体的实施方案,本发明采用的氨基末端长链聚合物-生物素偶联物为氨基聚4乙二醇-生物素偶联物(Biotin-PEG4-NH2,简称BP4A)或氨基聚3乙二醇-生物素偶联物(Biotin-PEG3-NH2,简称BP3A)。
其中,BP4A和BP3A的结构式分别如下所示:
作为本发明一种优选的实施方案,衍生化处理时,将衍生化试剂配制成溶液形式使用。优选将配制好的衍生化试剂溶液与含肉碱组分的检测样品混合进行衍生化处理。优选地,配制的衍生化试剂溶液中所述衍生化试剂的浓度为0.1mM~100mM。
优选地,所述衍生化处理的反应温度为20℃~40℃。所述衍生化处理可以在室温条件下温和进行。
优选地,所述衍生化处理的反应时间为5min~360min。
作为本发明一种优选的实施方案,所述检测方法还包括步骤:在所述衍生化处理前,对生物样本中的肉碱组分进行活化处理,即对肉碱组分上的羧基基团预先采用活化剂进行活化;和/或,
在所述衍生化处理中,向反应体系中添加脱水剂进行衍生化处理。
为了提高衍生化反应处理的效率,本发明可以采用在衍生化处理前预先对肉碱组分羧基进行活化,或者在衍生化处理中添加脱水剂,或者既在衍生化处理前预先对肉碱羧基进行活化、也在衍生化处理中添加脱水剂等方法,来提高衍生化反应的效率。
作为本发明一种优选的实施方案,所述活化处理采用的活化剂为琥珀酰亚胺(NHS)或琥珀酰亚胺类似物(如磺酸化NHS)。
所述脱水剂为N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)。
作为本发明一种优选的实施方案,对所述生物样本中的肉碱组分进行活化处理时,活化反应体系的pH值为3.0~5.0,优选为4.0~5.0。
在所述衍生化处理中,反应体系的pH值为7.5~10,优选控制在8.0或以上,更优选为8.0~9.0。
作为本发明一种优选的实施方案,对所述生物样本中的肉碱组分进行活化处理时,活化反应体系中添加所述脱水剂。即在对肉碱组分进行预先活化处理时,在添加活化剂的同时也添加脱水剂,采用活化剂和脱水剂的混合液对肉碱组分进行活化处理。
作为本发明一种优选的实施方案,本发明所述的检测方法,在衍生化处理前或在活化处理前,先对生物样本进行分离或富集。优选所述分离或富集处理为纯化处理。纯化处理优选为去除样本中大分子蛋白质等干扰物质。经纯化处理可以减少干扰物质,进一步提高检测的准确性。当然,生物样本也可以不进行任何纯化处理,直接进行衍生化处理或活化处理。
在一个具体实施方案中,对于含肉碱组分的液体样本,去除大分子蛋白质的方法为甲醇沉淀蛋白法。
在另一个具体实施方案中,对于含肉碱组分的固相样本(如干血片),去除大分子蛋白质的方法为甲醇直接提取法。
本发明所述的检测方法,在衍生化处理后得到的样品可以直接使用MALDI-MS对所述肉碱衍生物进行检测。当然,也可以对衍生化处理后得到的样品进行纯化,之后再进行检测。
作为本发明一种优选的实施方案,所述检测方法还包括步骤:使用MALDI-MS对所述肉碱衍生物进行检测。
作为本发明一种优选的实施方案,所述检测采用内标法进行定量检测,采用的内标物为同位素标记的肉碱或肉碱类似物。例如:Cambridge Isotope Labs公司的2H9-Carnitine、2H3-Acetylcarnitine或2H3-Propionylcarnitine等。内标物的标记同位素可以选自诸如15N、氘(D)、13C等同位素。
通常,同位素标记的肉碱或肉碱类似物中包含的重同位素含有一个以上重同位素。可以优选掺入更高数目的重同位素,因为它提供更大的质量迁移。该重同位素标记的化合物为本领域公知,且可从多个厂家获得。
检测过程中,检测流程按照内标法流程进行。根据肉碱标准品和内标的MS信噪比比值和所添加肉碱的浓度,绘制得到标准曲线,从而计算得出检测生物样本中所含肉碱组分的浓度。
在一些实施方式中,内标物在衍生反应之前加入生物样本或标准品溶液中。所述内标物一方面有助于定量分析样品中的肉碱组分,另一方面可以校准或纠正由于实验过程中目标物的损失或干扰物的基质效应导致的结果不准确。
在一些实施方式中,检测时通过MALDI-MS对肉碱衍生物进行分析,例如可以使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100~120的阳离子模式下累积并平均化400次射击(shots)得到。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理,也可使用其它市售的MALDI-MS质谱仪,本公开对此不作限制。
第二方面,本发明还提供了一种用于所述检测方法的肉碱检测用试剂盒,其中包括所述氨基末端长链聚合物-生物素偶联物。
作为本发明一种优选的实施方案,所述试剂盒还包括i)~iii)组分中的至少一种:
i)从生物样本中进行肉碱提取和/或纯化所需试剂及耗材;
ii)质谱检测所用的试剂及耗材;
iii)同位素标记的肉碱或肉碱类似物以及用于定量检测的肉碱标准品。
第三方面,本发明还提供了所述的检测方法以及所述的试剂盒在检测各种生物样本中肉碱组分含量中的应用。
作为本发明一种优选的实施方案,所述含肉碱的生物样本为肉碱溶液、干血片、血液、血清、血浆、尿液、唾液、组织液中的任一种。优选所述生物样本为血液类样本。所述血液类样本包括干血片、血液、血清或血浆。
在一些实施方式中,所述生物样本为干血片样本。干血片为包括血细胞在内的全血类型样本。
本发明可以检测的肉碱组分可以是游离肉碱或者酰肉碱,例如二碳酰肉碱、3-5个碳的酰肉碱或长链酰肉碱,具体如乙酰化肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱或棕榈酰肉碱等。
为有效解决MALDI-MS不能用于复杂样本中肉碱的检测问题,本发明提供了一种先利用化学试剂对样本中的肉碱组分进行衍生化处理,得到肉碱衍生物,之后再进行检测的方法。本发明方法一方面通过改变肉碱信号在质谱中所处的m/z范围,使其不受基质或背景信号的干扰;另一方面通过衍生在肉碱中引入更多的离子化位点,提高了离子化效率。
具体地,本发明采用氨基末端长链聚合物-生物素偶联物(Biotin-Polymer-NH2,简称BPN)为衍生化试剂,利用BPN上的氨基与肉碱上的羧基进行酰胺化反应,实现对所述肉碱组分的衍生化处理。通过衍生化处理,在肉碱上偶联一个大分子量的结构标签,从而将肉碱的质谱信号从低分子量范围(m/z 160以上)提升到较高的分子量范围,提升到的分子量范围可根据所用基质或样本类型、存在的干扰物等因素进行调整,以消除MALDI-MS基质分子信号以及干扰物等对肉碱检测信号的干扰,提高检测的准确性。同时,由于生物素结构和聚合物链结构中均存在大量易于离子化的结构位点,非常容易在质谱中形成离子加和物,增加了离子化的概率和效率,能大大提高质谱检测目标信号的灵敏度。本发明采用的衍生化试剂BPN中聚乙二醇中的O原子可以提供更多的离子化位点,使衍生产物离子化效率提高;并且衍生化试剂的分子中除生物素与伯胺基外,没有任何其他较活泼的反应官能团,如羧基、羟基、卤素、巯基、羰基和其他更多氨基等,有效避免了衍生过程中其他副反应的发生,使检测结果更准确。经试验表明,本发明所建立的检测方法可用于临床上测定复杂生物样品中的肉碱组分。
本发明采用的衍生化试剂是根据肉碱结构的特殊性,以及适用于MALDI-MS检测的衍生反应特定要求,针对性设计的肉碱衍生化试剂。虽然肉碱中也有一个胺基结构,但肉碱分子中的胺为四级铵(季铵盐),N原子上没有活性氢。因此,肉碱中的胺基无法通过与羧基的反应进行衍生或功能性修饰,对肉碱的衍生只能通过肉碱上的羧基反应来进行。目前已经被发现的许多针对氨基化合物(一级胺和二级胺化合物)的衍生化试剂不能被用于肉碱的衍生和检测。本发明的肉碱衍生化试剂BPN满足以下分子特征:分子链一端偶联一个生物素结构;分子链另一端为一个且仅有一个一级胺结构(伯胺,N原子上有两个活性氢);生物素与伯胺氨基之间为聚乙二醇结构,以提供更多的离子化位点;分子中除生物素与一个伯胺基外,没有任何其他较活泼的反应官能团,如羧基、羟基、卤素、巯基、羰基和其他氨基等,以避免衍生过程中其他副反应的发生。经试验,采用本发明的衍生化试剂、结合MALDI-MS检测,可以用于复杂样本中肉碱的准确检测。
本发明的有益效果为:
1)采用本发明的检测方法,可彻底解决目前MALDI-MS检测肉碱存在的主要问题。已有的肉碱衍生方法多为针对色谱、GC-MS、LC-MS等技术开发,不能针对性地解决肉碱MALDI-MS检测中的问题。虽然可通过开发特殊的MALDI基质、增加预纯化步骤等手段实现肉碱的MALDI-MS检测,但是这些技术方案由于离子化效率低、分析速度慢、方法复杂、成本高等原因缺乏实用性,基本停留在实验室阶段。本发明提供的肉碱衍生化处理检测方法可针对性地解决MALDI-MS检测中存在的基质和背景干扰、肉碱离子化效率低等问题,只需采用最经典的MALDI-MS流程和常规MALDI基质就可实现复杂样本中的肉碱直接检出,具有极高的实用潜力。
2)样品制备简单明了、方法简便、仪器运行时间短且自动化程度高。已有的GC-MS和LC-MS方法需要复杂的方法建立、优化与验证过程,需要强大的色谱与质谱背景知识和专业操作人员,许多需要测定生物样品中肉碱的临床机构并不具有这样的条件。本发明提供的方法将BPN衍生化与MALDI-MS相结合,提高了电离效率,MALDI-MS检测的灵敏度得到提升;且无需任何色谱分离或富集过程,操作时间短,容易实现高通量地检测生物样品。
3)本发明方法可根据检测需要选择合适分子量的BPN作为衍生试剂。由于不同样本中对肉碱检测产生干扰的背景基质不同,能够通过调整BPN中聚合物间隔基的数量改变肉碱衍生物的分子量,从而将目标信号调整到特定的背景干扰较小的分子量区域。因此,本发明采用的这类衍生化试剂由于其结构上的灵活性,可适用于不同的样本类型。
本发明基于BPN衍生化的MALDI-MS方法首次用于复杂生物样品中肉碱组分的定性和定量检测,特异性高、方法准确、操作简便,且灵敏度高。经实验,结果表明,本发明方法可用于临床上测定复杂生物样品中的肉碱组分。
附图说明
图1是本发明实施例1中肉碱标准品经过BP4A衍生后用MALDI-MS检测的质谱信号谱图;
图2是本发明实施例2中检测得到的质谱信号谱图;
图3是本发明实施例3中检测得到的质谱信号谱图;
图4是本发明实施例4中干血片样品检出的部分肉碱分子的质谱图;
图5是本发明实施例5中检测得到的质谱信号谱图;
图6是本发明实施例6中得到的肉碱定量标准曲线图;
图7是本发明实施例7中在不同pH值条件下进行EDC/NHS活化所获得的肉碱衍生物质谱对比图;
图8是本发明实施例8中在采用不同pH值BP4A反应液和不同加入量的条件下获得的肉碱衍生物质谱对比图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明在以下实施例中,以具体的BPN化合物为衍生化试剂进行了肉碱的检测。检测方法采用内标法进行定量检测,采用的内标物为同位素标记的肉碱,例如CambridgeIsotope Labs公司的2H9-Carnitine。
检测步骤包括:
首先对生物样本中的肉碱进行衍生化处理,得到肉碱衍生物;
之后使用MALDI-MS对肉碱衍生物进行检测。
优选地,在衍生化处理前,对生物样本进行了纯化处理,例如去除或降低样本中高丰度蛋白质、盐类等干扰MALDI-MS检测的物质的纯化处理;方法包括加入有机溶剂沉淀法、加入强酸或超速过滤离心法等等。
优选地,在衍生化处理前,对生物样本中的肉碱组分进行活化处理。例如采用琥珀酰亚胺(NHS)或磺酸化NHS溶液处理生物样本;或者,采用琥珀酰亚胺(NHS)与脱水剂EDC的混合溶液处理生物样本。活化时,采用的活化液pH值控制在4.0-5.0左右。
优选地,可以在衍生化处理前不对生物样本进行活化处理,而是在衍生化处理时,在衍生化反应体系中加入脱水剂EDC。例如在衍生化试剂溶液中加入EDC,配制成混合溶液,用于衍生化处理。衍生化处理时,采用的衍生化溶液的pH值控制在8.0或以上。
在一些实施方式中,采用的BPN分子具体为氨基聚4乙二醇-生物素偶联物(Biotin-PEG4-NH2,简称BP4A)。肉碱通过与该分子发生衍生反应,得到的偶联物能够将分子量提升约452,这样肉碱的质谱信号主要出现在m/z 500-700区间,不会受到MALDI基质分子信号的干扰(小分子基质的信号干扰主要出现在m/z 100-400范围)。同时,由于BP4A结构中具有大量极性基团和易于离子化的位点,相比未衍生的肉碱分子,衍生后的分子结构更易于离子化,提升了离子化效率和质谱检测灵敏度。上述处理也使得复杂样本中的肉碱能够在不做预先纯化分离的条件下能够直接被检测到。
在另一些实施方式中,采用的BPN分子具体为氨基聚3乙二醇-生物素偶联物(Biotin-PEG3-NH2,简称BP3A)。经试验,MALDI-MS也能够高灵敏地检测到肉碱的BP3A衍生物信号。
本发明所述的方法适用于不同种类的生物样本。
在一些实施方式中,所述生物样本为液体类样本,如肉碱溶液等。
在一些实施方式中,所述生物样本为干血片样本。干血片为包括血细胞在内的全血类型样本。
当然容易想到,本发明所述方法也适用于其他类型的生物样本,如血浆、血清、尿液、唾液、组织液等。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本实施例以氨基聚4乙二醇-生物素偶联物(Biotin-PEG4-NH2,简称BP4A)为衍生化试剂,对肉碱标准品进行了检测,步骤如下:
1)将肉碱标准品溶于甲醇配制成100μM的溶液,取出50μL置于一新的EP管中,真空抽干溶剂;同时制备相应的空白样本,其中空白样本配制过程为:50μL空白甲醇溶剂置于一EP管中,真空抽干;
将BP4A溶于pH8.0的MES缓冲溶液中,BP4A浓度为5mM,制成的BP4A溶液即为衍生化试剂溶液;
配制N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)与琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液作为活化液,采用的溶剂为pH4.7的MES缓冲液,EDC与NHS的浓度均为50mM。
2)向上述已抽干溶剂的肉碱标品及空白样本中分别加入30μL的EDC/NHS混合溶液,室温下反应20分钟;之后再向反应液中加入120μL的BP4A溶液,室温下反应2小时。其中,肉碱(Carnitine)与BP4A的反应式为:
3)取步骤2)反应得到的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;
取1.5μL的上述稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对肉碱衍生物进行分析,使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理。检测结果见图1所示。
游离肉碱的分子量原本为161.11,经过BP4A衍生后,被检测分子的分子量为606.53。因此,肉碱的质谱信号出现在m/z 500以上的范围,在该范围内,被检测分子的信号不会受到MALDI基质的背景信号的干扰(常用的MALDI基质如二羟基苯甲酸,其背景信号干扰通常出现在m/z 100-400的范围内)。图1结果表明,MALDI-MS能够高灵敏地检测到肉碱的BP4A衍生物信号,相反,空白样本在该信号区域并无明显干扰峰。这一结果说明,用BP4A衍生肉碱,并利用BP4A衍生物的信号来检测和定量肉碱是可行的;通过BP4A衍生,能够将肉碱的分子量提升到m/z 500以上的范围,该范围内基本没有基质信号的干扰,能够大大改善肉碱检测的灵敏度和离子化效率。并且,检测过程无需进行复杂的色谱分离和纯化。
实施例2
本实施例分别采用BP4A和N-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(Biotin-2AH-NHS,简称B2AN,一种典型的BPC分子)为衍生化试剂对肉碱进行了衍生化处理,之后利用MALDI-MS进行检测,步骤如下:
1)将肉碱标准品溶于甲醇配制成100μM的溶液,取出50μL置于一新的EP管中,真空抽干溶剂;同时制备相应的空白样本;
将BP4A溶于pH8.0的MES缓冲溶液,BP4A浓度为5mM;
配制N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)与NHS的混合溶液,溶剂为pH4.7的MES缓冲液,EDC与NHS的浓度均为50mM。
2)向上述已抽干溶剂的肉碱标品中加入30μL的EDC/NHS混合溶液,室温下反应20分钟;之后再向反应液中加入120μL的BP4A溶液,室温下反应2小时。
3)取步骤2)的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;
取1.5μL的上述稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到MALDI MS所用的不锈钢靶板表面。
4)将B2AN溶于乙腈/H2O(1:1,v/v)混合溶液,B2AN浓度为20mM。
5)将肉碱标准品溶于甲醇配制成100μM的溶液,取出50μL置于一新的EP管中,真空抽干溶剂,向抽干溶剂的肉碱标准品中加入pH 8.0的MES缓冲液50μL,再向其中加入4μL的步骤4)制得的B2AN溶液,室温下反应30分钟。
6)取步骤5)的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到不锈钢靶板表面。
7)通过MALDI-MS对步骤3)和步骤6)所制备的肉碱衍生物进行分析,使用SHIMADZUAXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的,使用Shimadzu BiotechLaunchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理,检测结果见图2所示。其中,肉碱BP4A衍生物的质谱结果如图2a所示,肉碱与B2AN反应的质谱结果如图2b所示。
图2结果表明,肉碱通过与BP4A衍生、MALDI-MS检测能够高灵敏地检测到“肉碱-BP4A衍生物”的信号;相反,肉碱通过与B2AN反应,并无任何二者的偶联产物生成,相应质谱范围内无任何信号。这说明,在NHS/EDC的活化前提下,BP4A上的氨基(一级胺)能够在温和的条件下快速和肉碱上的羧基发生反应,形成BP4A与肉碱的稳定的衍生产物,从而能够将肉碱的分子量提升到m/z 500以上的范围,该产物能够被MALDI-MS高灵敏地检测,获得高信噪比的质谱信号,利用这一反应产物的信号来检测和定量肉碱是可行的。相比之下,由于肉碱分子中的胺是四级铵(季铵),缺少活泼氢,无法与另一个分子上的羧基发生反应,因此也无法与BPC类分子(例如B2AN)上的羧基发生衍生反应,所以BPC分子无法完成对肉碱的衍生和偶联,在相应的质谱范围内也难以检测到任何目标物信号,BPC类分子不适用于肉碱的衍生与质谱检测。
实施例3
本实施例以氨基聚3乙二醇-生物素偶联物(Biotin-PEG3-NH2,简称BP3A)为衍生化试剂,对肉碱标准品进行了检测,步骤如下:
1)将肉碱标准品溶于甲醇配制成100μM的溶液,取出50μL置于一新的EP管中,真空抽干溶剂;同时制备相应的空白样本。
将BP3A溶于pH8.0的MES缓冲溶液,BP3A浓度为5mM;
配制N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)与NHS的混合溶液,溶剂为pH4.7的MES缓冲液,EDC与NHS的浓度均为50mM。
2)向上述已抽干溶剂的肉碱标品及空白样本中加入30μL的EDC/NHS混合溶液,室温下反应20分钟;之后再向反应液中加入120μL的BP3A溶液,室温下反应2小时。
3)取步骤2)得到的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;
取1.5μL的上述稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到不锈钢靶板表面。
通过MALDI-MS对肉碱衍生物进行分析,使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理,结果见图3所示。
图3结果表明,MALDI-MS能够高灵敏地检测到肉碱的BP3A衍生物信号,相反,空白样本在该信号区域并无明显干扰峰。这一结果说明,用BP3A衍生肉碱,并利用BP3A衍生物的信号来检测和定量肉碱是可行的。同时也说明,采用不同分子量的氨基聚乙二醇-生物素偶联物(BPN)来衍生和检测复杂样本基质中的肉碱成分是可行的,可以实现MALDI-MS的高灵敏检测,在被检测区域内无基质背景信号的干扰,且检测过程无需进行复杂的色谱分离和纯化。在检测不同样本中肉碱组分时,可以根据样本基质的类型、干扰物的分子量等因素,选择合适分子量的BPN来衍生肉碱,使肉碱的信号转换到一个干扰较少的分子量区间,以获得最好的检测灵敏度和特异性。
实施例4
本实施例采用BP4A衍生化处理结合MALDI-MS检测对干血片样本中的肉碱进行了分析,步骤如下:
1)通过打孔法将直径5mm的血片样本从一份健康人干血片上分离下来,置于EP管中;向该EP管中加入100μL甲醇,涡旋震荡10分钟,将甲醇清液取出置于一新的EP管中,真空抽干溶剂;同时制备相应的空白纸片样本,其中空白纸片样本制备过程为:取空白滤纸片,通过打孔法将直径5mm的空白纸片分离并置于EP管中,向该EP管中加入100μL甲醇,涡旋震荡10分钟,将甲醇清液取出置于一新的EP管中,真空抽干溶剂;
2)配制N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)与NHS的混合溶液,溶剂为pH4.7的MES缓冲液,EDC与NHS的浓度均为50mM;
将BP4A溶于pH8.0的MES缓冲溶液,BP4A浓度为5mM。
3)向上述已抽干溶剂的干血片提取物及空白样本中加入30μL的EDC/NHS混合溶液,室温下反应20分钟;之后再向反应液中加入120μL的BP4A溶液,室温下反应2小时。
4)取步骤3)的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;
取1.5μL的上述稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对肉碱衍生物进行分析,使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理。其中检出的部分肉碱分子的谱图如图4所示。图4显示了干血片样品经过甲醇提取后,再经BP4A衍生、并通过MALDI MS检测到的游离肉碱及几种酰化肉碱的质谱图及空白对照谱图。干血片样本是目前遗传代谢缺陷筛查所应用的主要样本。干血片中不同种类的肉碱分子离子被检测到并被标示在图中。与之相比,空白样本中则未出现相应的信号。
图4结果表明,通过BP4A衍生结合MALDI-MS检测,能够实现干血片样本中不同种类肉碱分子的直接检出,无需任何色谱分离或纯化过程,整个流程简单、快速。这一结果说明,用BP4A衍生处理肉碱,并利用BP4A衍生物的信号来检测复杂样本基质中的肉碱成分是可行的。通过BP4A衍生,能够将肉碱的分子量提升到m/z 500以上的范围,该范围内基本没有基质信号的干扰,能够大大改善肉碱检测的灵敏度和离子化效率。
实施例5
本实施例采用预先不对肉碱进行活化处理、在衍生化处理时直接添加脱水剂EDC的方法,进行BP4A衍生肉碱和检测,步骤如下:
1)将肉碱标准品溶于甲醇配制成100μM的溶液,取出50μL置于一新的EP管中,真空抽干溶剂;制备相应的空白样本。
将BP4A溶于pH8.0的MES缓冲溶液,BP4A浓度为10mM;配制N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)溶液,溶剂为pH8.0的MES缓冲液,EDC的浓度为20mM。
2)将配制的BP4A溶液和EDC溶液按1:1体积比混合,取30μL混合液立即加入到上述已抽干溶剂的肉碱标品及空白样本中,室温下反应4小时。
3)取步骤2)的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;
取1.5μL的上述稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对肉碱衍生物进行分析,使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理,结果见图5所示。
图5结果表明,采用本实施例方法,即预先不对检测样本中的肉碱进行活化处理,在衍生化处理时采用向衍生化试剂溶液中添加脱水剂EDC的方法,进行BP4A衍生肉碱检测,MALDI-MS同样能够高灵敏地检测到肉碱的BP4A衍生物信号,相反,空白样本在该信号区域并无明显干扰峰。这一结果说明,直接向衍生化反应体系中添加脱水剂EDC、而不额外增加肉碱的NHS活化步骤,同样能够完成肉碱的BPN衍生和MALDI MS检测。在温和的反应温度下,这一方法的衍生反应转化率同样较高,只是需要较长的反应时间。
实施例6
本实施例考察了BP4A衍生结合MALDI-MS检测用于定量分析样本中肉碱的可行性及其标准曲线的测定,步骤如下:
1)将肉碱标准品溶于甲醇(甲醇中含有10μM的2H9-Carnitine作为内标)配制成不同浓度(60.0-1.0μM)的溶液;分别取出50μL置于新的EP管中,真空抽干溶剂;
BP4A溶于pH8.0的MES缓冲溶液,BP4A浓度为5mM;
配制N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)与NHS的混合溶液,溶剂为pH4.7的MES缓冲液,EDC与NHS的浓度均为50mM。
2)向上述已抽干溶剂的肉碱标品中加入30μL的EDC/NHS混合溶液,室温下反应20分钟,之后再向反应液中加入120μL的BP4A溶液,室温下反应2小时。
3)取步骤2)的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;
取1.5μL的上述稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对肉碱衍生物进行分析,使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理,并根据检测结果绘制得到标准曲线图,如图6所示。
图6结果表明,通过BP4A和MALDI MS检测相结合,能够获得理想的肉碱定量标准曲线。肉碱标准曲线的r2均在0.99以上,且各个浓度的响应值重现性好,CV%均在20%以下,能够满足肉碱定量分析的要求。
实施例7
本实施例对比了采用不同pH值的活化液进行活化处理,对之后衍生结果的影响,具体步骤如下:
1)将肉碱标准品溶于甲醇配制成100μM的溶液,置于三支新的EP管中,每管50μL,真空抽干溶剂。
将BP4A溶于pH8.0的MES缓冲溶液,BP4A浓度为5mM。
2)配制三种不同pH值的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)与NHS的混合溶液,溶剂分别采用pH4.7的MES缓冲液、pH7.0的MES缓冲液和pH8.0的MES缓冲液,三种混合溶液中EDC与NHS的浓度均为50mM。
3)向上述已抽干溶剂的三支肉碱标品中分别加入步骤2)配制的三种不同pH值的EDC/NHS混合溶液,每管30μL,室温下反应20分钟;之后再向反应液中加入120μL的BP4A溶液,室温下反应2小时。
4)取步骤3)的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;
取1.5μL的上述稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对肉碱衍生物进行分析,使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理,检测结果如图7所示。图7中(a)、(b)、(c)分别显示在pH值4.7、7.0、8.0三种条件下进行EDC/NHS活化所获得的肉碱-BP4A衍生质谱图。
在研究中发现,控制EDC/NHS活化步骤的pH值对之后的衍生化处理及检测结果非常关键。由图7结果表明,在碱性条件下进行EDC/NHS活化(pH8.0),无法获得肉碱的BP4A衍生信号;在中性条件下(pH7.0),虽然能够观察到一定的肉碱-BP4A衍生物信号,但信号的强度较低,说明只有部分肉碱分子被衍生化,检测的灵敏度不够;只有在弱酸性(pH4.7)条件下进行活化,才能获得信噪比较好的肉碱BP4A衍生物信号。上述结果说明只有在较窄的pH窗口,优选活化处理的pH范围为4.0-5.0,可以实现肉碱中羧基的NHS活化,进而使得BP4A与肉碱的偶联反应在较为温和的条件(室温)下快速完成。这种温和的反应条件和较短的反应时间对于生物样本的临床检验具有重要的价值。
实施例8
本实施例对比了不同pH值的BP4A衍生化试剂溶液和相对活化液不同用量比例的BP4A反应液对衍生效果的影响,具体步骤如下:
1)将肉碱标准品溶于甲醇配制成100μM的溶液,置于五支新的EP管中,每管50μL,真空抽干溶剂;
配制EDC与NHS的混合溶液,采用的溶剂为pH4.7的MES缓冲液,EDC与NHS的浓度均为50mM。
2)分别用pH8.0、pH7.0和pH4.7的MES缓冲溶液配制三种不同pH值的BP4A溶液,BP4A浓度均为5mM。
3)向已抽干溶剂的五支肉碱标品中分别加入EDC/NHS混合溶液,每管30μL,室温下反应20分钟;之后向其中三支管中分别加入120μL的pH8.0、pH7.0和pH4.7的BP4A溶液,其余两支管中分别加入60μL和30μL的pH8.0的BP4A溶液,五支管中的反应液震荡混合均匀,室温下反应2小时。
4)分别取步骤3)获得的不同的反应混合液5μL,用乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)混合溶液稀释5倍;
取1.5μL的上述稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸[DHB,乙腈/水/三氟乙酸(1:1:0.002,v/v/v)溶解,10mg/mL]混合,并吸取1.5μL溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对肉碱衍生物进行分析,使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪,在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理,检测结果如图8所示。图8中,(a)、(b)、(c)分别显示在pH值8.0、7.0、4.7三种条件下120μL的BP4A进行衍生所获得质谱图;图8中(d)、(e)分别显示加入60μL和30μL的pH8.0条件下BP4A溶液进行衍生所获得的质谱图。
研究中还发现,BP4A衍生肉碱的另一个关键条件是需要控制衍生化处理时BP4A反应液的pH条件。由图8结果表明,在中性(pH7.0)或酸性(pH4.7)条件下进行BP4A衍生,均无法获得任何肉碱衍生物的信号。同时,如果在衍生化处理时加入的碱性BP4A溶液的量小(如60μL或30μL),同样无法有效的实现肉碱的高效衍生与检测,特别是BP4A加入量只有30μL的情况下,几乎无法看到衍生物的信号。这是由于在进行EDC/NHS活化步骤时,体系的pH值为弱酸性,如果在衍生化处理时BP4A碱性溶液的加入量较小,就无法将衍生化反应体系的总pH值转变为碱性,此时反应体系的pH值仍然较低,因此无法完成BP4A与肉碱的偶联衍生。经试验证明,衍生化处理时,只有在碱性(pH8.0)条件下反应,才能获得稳定和信噪比较好的肉碱-BP4A衍生物信号,即衍生化反应体系必须保证pH8.0以上,才能在较为温和的条件(室温)下快速完成衍生化反应,进而实现样本中肉碱分子的检出。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,式Ⅰ中,n取2~5的整数,优选n取3或4的整数。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法,其特征在于,所述衍生化处理的反应温度为20℃~40℃。
4.根据权利要求1~3任一项所述的检测方法,其特征在于,所述检测方法还包括步骤:在所述衍生化处理前,对生物样本中的肉碱组分进行活化处理;和/或,在所述衍生化处理中,向反应体系中添加脱水剂;
优选地,所述活化处理采用的活化剂为琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺类似物;
所述脱水剂为N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,对所述生物样本中的肉碱组分进行活化处理时,活化反应体系的pH值为3.0~5.0,优选为4.0~5.0;和/或,在所述衍生化处理中,反应体系的pH值为7.5~10,优选为8.0~9.0。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法,其特征在于,对所述生物样本中的肉碱组分进行活化处理时,活化反应体系中添加所述脱水剂。
7.根据权利要求1~6任一项所述的检测方法,其特征在于,所述检测方法还包括步骤:使用MALDI-MS对所述肉碱衍生物进行检测。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述检测采用内标法进行定量检测,采用的内标物为同位素标记的肉碱或肉碱类似物。
9.一种用于权利要求1~8任一项所述的检测方法的肉碱检测用试剂盒,其特征在于,包括所述氨基末端长链聚合物-生物素偶联物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括i)~iii)组分中的至少一种:
i)从生物样本中进行肉碱提取和/或纯化所需试剂及耗材;
ii)质谱检测所用的试剂及耗材;
iii)同位素标记的肉碱或肉碱类似物以及用于定量检测的肉碱标准品。
11.权利要求1~8任一项所述的检测方法以及权利要求9或10所述的试剂盒在检测生物样本中肉碱组分含量中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,所述生物样本为肉碱溶液、干血片、血液、血清、血浆、尿液、唾液、组织液中的任一种。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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