CN115960890B

CN115960890B - Pdrn纯化方法及产品

Info

Publication number: CN115960890B
Application number: CN202310254986.4A
Authority: CN
Inventors: 董书萍; 王绪敏
Original assignee: Ruijiming Shandong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ruijiming Shandong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-16
Filing date: 2023-03-16
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2043-03-16
Also published as: CN115960890A

Abstract

本发明提供了一种PDRN纯化方法及产品，属于生物技术领域。本发明提供的纯化方法中包括：PDRN粗品溶于水，每1L粗品溶液中，加入3‑4mol/L的KOH溶液50mL；再加入柠檬酸和碳酸的混合溶液10mL，混合溶液中柠檬酸的浓度为2‑4mol/L，碳酸的浓度为2‑4mol/L，离心取上清液；再加入1.1‑1.3mol/L的氯化钠溶液100mL，离心取沉淀。本发明的纯化方法提高了PDRN粗品纯度，降低了生产成本，使PDRN能更好地应用于美容整形、外伤愈合等领域。

Description

PDRN纯化方法及产品

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及PDRN纯化方法及产品。

背景技术

PDRN（PolyDeoxyRiboNucleotide），又称多聚脱氧核糖核苷酸，是从三文鱼生殖细胞中提取的特定规格的DNA片段，分子量在50-1500kDa之间。PDRN可以促进人体细胞再生，迅速恢复伤口，并减少疤痕生成，也可减轻痛症。

PDRN用途广泛，且具有良好的开发前景，不断发展PDRN的提取和纯化技术能够为其实际应用提供保障。与大部分物质纯化相同，PDRN的纯化很难用单一方法实现，最终目的产品的纯度和回收率两者难以兼顾。当需要提纯氨基酸及多肽等产物时，要根据其物理、化学性质等特性，选择适当的提纯方法以获取高纯度的目标产物，同时得到尽量多的产品。

现有技术中对与PDRN的纯化方法研究较少，一般通过优化制备步骤保证PDRN的纯度。

中国专利申请CN201911191251.1公开了一种分子量集中于其功效区间的三文鱼小分子多聚脱氧核糖核苷酸(Small molecule polydeoxyribonucleotide，SMPDRN)产品及其可控精准制备方法，以及其在化妆品、药品、营养食品、保健食品领域的应用。该发明中的小分子多聚脱氧核糖核苷酸的分子量为50bp-1000bp，其分子量位于50bp-500bp片段的质量占其总质量的的85％以上。该发明中的SMPDRN的分子量集中于高功效范围，针对性更强，功效更稳定，获得的产品经细胞、动物、人体实验证实在提高细胞活性、促进胶原蛋白合成、使受损皮肤再生、促进伤口愈合、紧致皮肤、增加皮肤弹性、消除皱纹、延缓皮肤衰老、抗氧化并防止色斑形成、抗炎、修复受损细胞等方面均具有显著效果，优于现有PDRN产品。但其最终产品的产率和纯度有待提高。

中国专利申请CN202211007267.4提供了一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用。制备方法包括使用裂解液对鱼的精细胞进行裂解；所述裂解液中包括酶和缓冲液，所述缓冲液包括：1-20mM尿素，10-100mM Tris-HCl，100-500nM NaCl，100-500nM CaCl₂，1-10mM Na₂EDTA。该制备方法中裂解缓冲液更接近中性，便于配制，且裂解时间短，应用于实际生产时可提高效率，生产的多聚脱氧核糖核苷酸纯度高，具有较好的应用前景。但其裂解采用的为蛋白酶K，且裂解对象为精液，不同于精巢组织，操作成本较高。

现有技术中所制备的PDRN虽然已经能够投入市场应用，但进一步提高PDRN的纯度有利于其更好地发挥功效。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种PDRN纯化方法及产品。通过对常规方法制备的精巢组织来源的PDRN进行进一步纯化，去除鱼精蛋白杂质，提高了PDRN的提取纯度。

本发明采用的技术方案如下。

本发明提供了一种PDRN的纯化方法。

具体地，所述纯化方法包括以下步骤：

PDRN粗品溶于水，每1L粗品溶液中，加入3-4mol/L的KOH溶液50mL；

再加入柠檬酸和碳酸的混合溶液10mL，混合溶液中柠檬酸的浓度为2-4mol/L，碳酸的浓度为2-4mol/L，离心取上清液；再加入1.1-1.3mol/L的氯化钠溶液100mL，离心取沉淀。

优选地，所述KOH溶液的浓度为3.6-4mol/L；所述柠檬酸的浓度为3-4mol/L；所述碳酸的浓度为2-3mol/L，所述氯化钠溶液的浓度为1.2-1.3mol/L。

进一步地，所述KOH溶液的浓度为3.6mol/L；所述柠檬酸的浓度为4mol/L；所述碳酸的浓度为3mol/L，所述氯化钠溶液的浓度为1.2mol/L。

优选地，所述混合溶液或氯化钠溶液加入后，静置10-15min；优选为静置10min。所述静置前可以包括搅拌操作。

优选地，所述离心为低速离心，所述离心条件为≤4000r/min，优选为2500r/min。

所述PDRN粗品可以是冻干前粗品或冻干后粗品。

优选地，所述PDRN粗品由三文鱼精巢组织中制得。

优选地，所述PDRN粗品在纯化前的纯度＜1.800。

所述纯度为产物溶于生理盐水后使用分光光度计分别检测260nm和280nm下的吸光度，根据以下公式计算产物中多聚脱氧核糖核苷酸的纯度：

纯度=OD₂₆₀/OD₂₈₀。

在一些实施例中，所述PDRN粗品的制备方法为：

（1）称取三文鱼精巢组织10g，加入碱裂解液150mL（1mol/L EDTA，5mol/L NaOH，5wt％SDS），破碎组织，颠倒混匀，100℃恒温水浴15min；

（2）冰浴至40℃以下，加入浓度为4M的Tris-HCl（pH8.0）150mL；颠倒混匀；

（3）加入300mL 0.5M的盐酸，颠倒混匀；

（4）0-4℃条件下，12000rpm离心5min；收集上清；

（5）DNA打断仪600 J/s破碎5min；

（6）加入10M NH₄AC溶液150mL，再加入-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀，0℃至-20℃放置30min；

（7）0-4℃条件下，12000rpm离心5min；去上清，加入70wt％乙醇，轻吹使沉淀泛起，轻缓颠倒数次，然后12000rpm离心5min，取沉淀；

（8）真空冻干，计算得率并测定纯度。

所述的步骤（7）中的沉淀或者步骤（8）中的冻干产物均可以作为前述纯化方法的PDRN粗品。

当使用所述步骤（7）中的沉淀作为PDRN粗品时，PDRN粗品溶液的浓度为30-50g/L，优选为40g/L。

当使用所述步骤（8）中的冻干产物作为PDRN粗品时，PDRN粗品溶液的浓度为10-20g/L，优选为15g/L。

另一方面，本发明提供了前述纯化方法制备的PDRN。

具体地，所述的PDRN纯度≥1.900。

优选地，所述的PDRN纯度≥1.964。

进一步优选地，所述的PDRN纯度≥1.977。

更进一步地，所述的PDRN纯度≥1.985。

又一方面，本发明提供了前述PDRN在美容中的应用。

所述的美容包括但不限于针对性改善或解决毛孔粗大、皮肤暗黄、干涩、皮肤下垂、老化、皱纹等皮肤问题。

所述的皱纹可以是鱼尾纹、眼周细纹、眉间纹、皱眉纹、法令纹、嘴角纹、鼻根纹等。

所述PDRN在美容中的应用所带来的效果包括但不限于：增加皮肤密度弹性、提升皮肤立体感效果、调节油水平衡、收缩毛孔、减少皮脂、改善肌理、改善细纹、再生皮肤保护膜、均匀肤色、减少角质。

又一方面，本发明提供了前述的PDRN在制备外伤药物中的应用。

所述的外伤药物可以是促进人体细胞再生，迅速恢复伤口，并减少疤痕生成的药物。

所述的外伤药物也可以是缓解痛症的药物。

又一方面，本发明提供了包含前述PDRN的整形美容用品。

所述的整形美容用品可以是PDRN注射针。

又一方面，本发明提供了包含前述PDRN的化妆品。

所述的化妆品可以是护肤品或彩妆。

所述的化妆品包括但不限于：精华水、精华液、乳液、面霜、唇膏、唇乳、身体乳、面膜、眼霜、护手霜、柔肤水、粉底液等。

又一方面，本发明提供了包含前述PDRN的药品。

所述的药品为外伤药物，可以是促进人体细胞再生，迅速恢复伤口，并减少疤痕生成的药物，也可以是缓解痛症的药物。

所述的药品中还可以包括其他药学上可接受的载体或赋形剂。

所述的药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂、防腐剂。

所述的药品的剂型包括但不限于：洗剂、软膏剂、酊剂、擦剂、醑剂、粉剂、油剂、糊剂、硬膏剂、涂膜剂、气雾剂。

所述的洗剂可以是溶液型、混悬型或乳浊液型。

所述的软膏剂可以是软膏、乳膏、凝胶剂。

本发明的有益效果：

本发明提供一种用于PDRN的组合试剂，对现有提取方法提取的PDRN进行纯化，最终获得的PDRN产品纯度可达1.985，收率达8.7%，降低了PDRN的生产成本，且无需使用有机试剂，使PDRN能更好地应用于美容整形、外伤愈合等领域。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

基础实验例PDRN的提取

选用大马哈鱼精巢作为原料进行PDRN的提取，具体如下：

（1）称取三文鱼精巢组织10g，加入碱裂解液150mL（1mol/L EDTA，5mol/L NaOH，5wt％SDS），破碎组织，颠倒混匀，100℃恒温水浴15min。

（2）冰浴至40℃以下，加入浓度为4M的Tris-HCl（pH8.0）150mL；颠倒混匀。

（3）加入300mL 0.5M的盐酸，颠倒混匀。

（4）0-4℃条件下，12000rpm离心5min；收集上清。

（5）DNA打断仪600 J/s破碎5min。

（6）加入10M NH₄AC溶液150mL，再加入-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀，0℃至-20℃放置30min。

（7）0-4℃条件下，12000rpm离心5min；去上清，加入70wt％乙醇，轻吹使沉淀泛起，轻缓颠倒数次，然后12000rpm离心5min，取沉淀。

（8）真空冻干，计算得率并测定纯度。

纯度和产率计算：

产率=产物重量/精巢组织重量；

产物溶于生理盐水后使用分光光度计分别检测260nm和280nm下的吸光度，根据以下公式计算产物中多聚脱氧核糖核苷酸的纯度：

纯度=OD₂₆₀/OD₂₈₀。

最终测得基础实验例的产物PDRN纯度为1.836，收率为9.2%。

实施例1

本实施例在基础实验例的基础上进行，步骤（7）沉淀过滤后不冻干直接进行以下步骤：

取沉淀，用去离子水配制成40g/L的粗品溶液；

每1L粗品溶液中加入3.6mol/L的KOH溶液50mL，搅拌均匀得溶液A；

向溶液A中加入柠檬酸和碳酸的混合溶液10mL得溶液B，混合溶液中柠檬酸的浓度为4mol/L，碳酸的浓度为3mol/L；搅拌均匀后静置10min，2500r/min离心取上清液；

上清液中加入1.2mol/L的氯化钠溶液100mL，搅拌均匀后静置10min，2500r/min离心取沉淀，沉淀进行真空冻干，计算得率并测定纯度。

最终测得本实施例的纯化产物PDRN纯度为1.985，收率为8.6%。

实施例2

参照实施例1，与实施例1的区别之处在于，KOH的浓度为4mol/L，柠檬酸的浓度为4mol/L，碳酸的浓度为4mol/L，氯化钠的浓度为1.1mol/L。

最终测得实施例2的纯化产物PDRN浓度为1.964，收率为8.5%。

实施例3

参照实施例1，与与实施例1的区别之处在于，KOH的浓度为3mol/L，柠檬酸的浓度为3mol/L，碳酸的浓度为2mol/L，氯化钠的浓度为1.3mol/L。

最终测得实施例3的纯化产物PDRN浓度为1.977，收率为8.7%。

实施例4

与实施例1的区别在于，粗品溶液为基础实验例步骤（8）制备的冻干产物溶于水的溶液，冻干产物的浓度为15g/L。

最终测得实施例4的产物纯化产物PDRN浓度为1.928，收率为8.5%。

对比例

参照实施例1设置对比例，具体如下：

结果如下：

Claims

1.一种PDRN的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

PDRN粗品溶于水，每1L粗品溶液中，加入3-4mol/L的KOH溶液50mL；

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的KOH溶液的浓度为3.6-4mol/L；所述的柠檬酸的浓度为3-4mol/L；所述的碳酸的浓度为2-3mol/L，所述的氯化钠溶液的浓度1.2-1.3mol/L。

3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述的KOH溶液的浓度为3.6mol/L；所述的柠檬酸的浓度为4mol/L；所述的碳酸的浓度为3mol/L，所述的氯化钠溶液的浓度1.2mol/L。

4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述的混合溶液或氯化钠溶液加入后，静置10-15min。

5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，静置10min。

6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述的离心条件为≤4000r/min。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述的离心条件为2500r/min。

8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的PDRN粗品为冻干前粗品或冻干后粗品。