CN115956504A - 一种海棠属植物初代培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海棠属植物初代培养的方法，包括：一年生植物枝条的取材、春化作用、一年生枝条的培养、外植体消毒、组培苗扩繁培养。本发明所取实验材料为一年生枝条，满足取样条件时将植物材料进行灭菌，在无菌条件下进行初代培养。本发明因在4℃冰箱放置1周可以促进植物的春化作用，可按需取材，弥补取材的季节限制；吐温‑80具有润展剂的作用，提高外植体消毒效果，同时可大幅降低海棠属植物在初代培养中的褐化问题，提高存活率；在继代培养基中生长的组培苗可直接用于扩繁，简化生产环节，提高生产速度。本技术方法操作简单，在组培苗建立具有良好的应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种海棠属植物组培初代材料的培养方法。
背景技术
海棠属(Malus)植物种类繁多，不同地区具有不同的栽培品种，因其花朵色彩鲜艳果实玲珑可观被广泛应用于园林绿化中。已有研究表明，海棠属植物提取物在调节肠道菌群、抑制真菌生长等免疫调节方面具有重要作用。对于海棠属植物种质资源的保存，有利于探究植物杀菌物质的作用机理，为绿色生防菌剂的开发、植物免疫研究奠定基础。
近年来，随着科学技术的迅猛发展，植物组织培养技术已进入大规模的生产应用阶段，广泛应用于蔬菜、苗木、花卉等领域。利用植物组织培养技术保存海棠属植物种质资源，已经成为研究海棠属植物的必要基础。但在目前的植物组织培养过程中，春天取样，植物组织培养易成功，这就使取材易受季节影响；升汞在植物组织消毒中发挥了良好的作用，但汞严重影响自然环境。
基于上述分析，本发明采用了新的技术，在降低了植物污染与褐化的同时还降低了对环境的危害性，具有一定的应用意义。
发明内容
鉴于上述不足，本发明所要解决的问题是针对现有技术存在的缺点而提供一种海棠属植物初代材料的培养方法，本发明采取一年生海棠属植物枝条，利用冰箱对枝条进行低温处理，在无菌的条件下离体培养，获得幼芽直接在继代培养基中扩繁，达到快速建立海棠属组培苗初代材料的培养目的。
为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：
一种海棠属植物初代材料的培养方法，包括：
一年生植物枝条的取材、春化作用、一年生枝条的培养、外植体消毒、组培苗扩繁培养，具体步骤如下：
a.取一年生枝条，下端剪成马蹄状，放入4℃冰箱培养一周促进其春化作用的发生。
b.外植体的培养：低温处理后，将上述枝条放入1％的MS营养液中，置于26℃培养室进行培养，期间光周期为16h光照，8h黑暗。24h换一次营养液，轻轻冲洗枝条。
c.外植体的灭菌：待花期过后长出叶芽，取下叶芽，用流动的水冲洗2h，期间加入2-3滴吐温-80。在无菌超净台中依次用75％酒精浸泡30s、2％次氯酸钠浸泡4min(可根据外植体大小适当改变时间)、无菌水冲3遍。用滤纸将外植体表面残余液体擦干。
d.外植体的催芽：将灭菌后的外植体接入初代斜面培养基中，置于26℃培养室进行培养，期间光周期为16h光照，8h黑暗。
e.芽苗的转接：当植物组织长有3-4片真叶时，在超净工作台中剪取带有生长点的幼嫩绿色组织接入到继代培养基中，置于26℃培养室进行培养，期间光周期为16h光照，8h黑暗。生长3-4周后可筛选适宜培养基进行工厂化生产。
进一步的，步骤b所述1％MS培养液使用去离子水配置。
进一步的，步骤b所述培养期间在枝条上方套上扎有若干小孔的塑料袋。
进一步的，步骤d所述培养基由如下方法制得：
MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.05ml/l，蔗糖30g，调pH5.82-5.86，加1.5-2g活性炭、6.8g琼脂，在电磁炉中煮沸，冒泡开锅即可，注意不要煮糊，倒入玻璃组培瓶中。121℃-20min高压灭菌。灭好后摆成斜面培养基。
进一步的，步骤e所述培养基由如下方法制得：
MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.05ml/l，蔗糖30g，调pH5.82-5.86，加入6.8g琼脂，在电磁炉中煮沸，冒泡开锅即可，注意不要煮糊，倒入玻璃组培瓶中。121℃-20min高压灭菌。灭好后正常摆放即可。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种海棠属植物初代培养的方法，所取实验材料为一年生枝条，满足取样条件时将植物材料进行灭菌，在无菌条件下进行初代培养。本发明因在4℃冰箱放置1周可以促进植物的春化作用，可按需取材，弥补取材的季节限制；吐温-80具有润展剂的作用，提高外植体消毒效果，同时可大幅降低海棠属植物在初代培养中的褐化问题，提高存活率；在继代培养基中生长的组培苗可直接用于扩繁，简化生产环节，提高生产速度。本技术方法操作简单，在组培苗建立具有良好的应用意义。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种海棠属植物初代培养的方法，包括：
取一年生枝条、外植体的培养、外植体的灭菌、外植体的催芽、芽苗的转接等环节，具体步骤如下：
a.取一年生枝条：于2020年10月7日在北京顺义区海棠种质资源圃取一年生褐海棠枝条，放入密封袋，于4℃冰箱保存一周。
b.外植体的培养：配置100毫升1％的MS营养液置于玻璃组培瓶中，放入5-7枝一年生枝条，枝条上方套一个密封袋，密封袋不封口，底部扎有若干小孔，置于26℃培养室进行培养，期间光周期为16h光照，8h黑暗。每天上午8点换一次营养液，并用流动的水轻轻冲洗枝条。
c.外植体的灭菌：经过25d营养培育，枝条长出花苞，去掉花苞，取下叶芽，用流动的水冲洗2h，期间加入2-3滴吐温-80。在无菌超净台中依次用75％酒精浸泡30s、2％次氯酸钠浸泡4min、无菌水冲3遍，每次1min，期间剧烈晃动以便于将植物体残留的次氯酸钠洗净。用滤纸将外植体表面残余液体擦干。
d.外植体的催芽：将灭菌后的外植体接入初代斜面培养基中，置于26℃培养室进行培养20d，期间光周期为16h光照，8h黑暗。
e.芽苗的转接：当植物组织长有3-4片真叶时，在超净工作台中剪取带有生长点的幼嫩绿色组织接入到继代培养基中，置于26℃培养室进行培养，期间光周期为16h光照，8h黑暗。生长4周后可用于继代培养。
实施例2
一种海棠属植物初代培养的方法，包括：
取一年生枝条、外植体的培养、外植体的灭菌、外植体的催芽、芽苗的转接等环节，具体步骤如下：
a.取一年生枝条：于2021年5月在北京农学院取一年生海棠枝条，放入密封袋，于4℃冰箱保存4d。
b.外植体的培养：配置120毫升1％的MS营养液置于玻璃组培瓶中，放入6-9枝一年生枝条，枝条上方套一个密封袋，密封袋不封口，底部扎有若干小孔，置于26℃培养室进行培养，期间光周期为16h光照，8h黑暗。每天上午8点换一次营养液，并用流动的水轻轻冲洗枝条。
c.外植体的灭菌：经过8d营养培育，枝条长出花苞，去掉花苞，取下叶芽，用流动的水冲洗2h，期间加入2-3滴吐温-80。在无菌超净台中依次用75％酒精浸泡30s、2％次氯酸钠浸泡3.5min、无菌水冲3遍，每次1min，期间剧烈晃动以便于将植物体残留的次氯酸钠洗净。用滤纸将外植体表面残余液体擦干。
d.外植体的催芽：将灭菌后的外植体接入初代斜面培养基中，每个培养基接种三个长势大小相似的外植体置于26℃培养室进行培养15d，期间光周期为16h光照，8h黑暗。
e.芽苗的转接：当植物组织长有3-4片真叶时，在超净工作台中剪取带有生长点的幼嫩绿色组织接入到继代培养基中，置于26℃培养室进行培养，期间光周期为16h光照，8h黑暗。生长约4周后可用于继代培养。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
Claims (10)
1.一种海棠属植物初代培养的方法，包括：
a.枝条预处理：取一年生枝条对下端进行修剪，放入4℃冰箱培养一周，得预处理枝条；
b.外植体的培养：将预处理枝条放入1％的MS营养液中，在培养室中培养，结束后冲洗枝条；
c.外植体的灭菌：待花期过后长出叶芽，取下叶芽，用流动水冲洗2h，在无菌超净台中灭菌处理，再用滤纸将外植体表面残余液体擦干，得到灭菌外植体；
d.外植体的催芽：将灭菌后外植体接入初代斜面培养基中，置于培养室培养，得到催芽体；
e.芽苗的转接：催芽体长有3-4片真叶时，在超净工作台中剪取带有生长点的幼嫩绿色组织接入到继代培养基中，置于培养室中培养，生长3-4周后进行筛选适宜培养基进行工厂化生产。
2.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤a所述枝条下端修剪成马蹄状；
所述冰箱温度为4℃。
3.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤b所述培养室温度为26℃；培养期间光照周期为16h光照，8h黑暗。
4.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤b所述MS营养液每24h更换一次。
5.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤c所述流动水冲洗期间加入2-3滴吐温-80。
6.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤c所述灭菌处理包括：
依次用75％酒精浸泡30s、2％次氯酸钠浸泡4min、无菌水冲3遍。
7.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤d所述培养室培养条件为：
培养温度26℃；
培养光照周期为：16h光照，8h黑暗。
8.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤d所述培养基由如下方法制得：
MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.05ml/l，蔗糖30g，调pH5.82-5.86，加1.5-2g活性炭、6.8g琼脂，煮沸后倒入玻璃组培瓶中，121℃-20min高压灭菌，即得。
9.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤e所述培养室培养条件为：
培养温度26℃；
培养光照周期为：16h光照，8h黑暗。
10.根据权利要求1所述的培养的方法，其中：
步骤e所述培养基由如下方法制得：
MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.05ml/l，蔗糖30g，调pH5.82-5.86，加1.5-2g活性炭、6.8g琼脂，煮沸后倒入玻璃组培瓶中，121℃-20min高压灭菌，即得。
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