CN115947853A - 靶向bcma的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用，所述纳米抗体包括VHH01和VHH02，其对BCMA均具有较强的特异性和较高的亲和力，均能够与BCMA阳性细胞系以高亲和力发生特异性地结合，基于所述纳米抗体构建得到的CAR‑T细胞对BCMA阳性细胞系具有较高的特异性杀伤效率，本发明为基于BCMA靶点的免疫治疗药物的开发提供了研发基础。

Description

靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用，更具体地，本发明涉及靶向BCMA的纳米抗体VHH01和VHH02、嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)是一种表达在浆细胞、浆母细胞和骨髓浆细胞的抗原，其不在B细胞或者造血干细胞上表达，BCMA又称为CD269、TNFRSF17，属于TNF受体超家族，是一种由185个氨基酸残基组成的Ⅲ型跨膜蛋白，能够结合B淋巴细胞刺激因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。BCMA的表达与许多癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病相关。BCMA高表达的相关癌症包括一些血液癌症，例如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和胶质母细胞瘤等。此外，BCMA通过介导下游信号通路，在细胞的存活、增殖、转移和耐药中起着关键性的作用，这些特性使得BCMA成为治疗血液系统肿瘤的有效靶点，特别是对于多发性骨髓瘤的治疗。目前，针对BCMA的新型肿瘤免疫治疗方法主要包括嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)、双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)药物和抗体药物偶联物(Antibody-drug Conjugate，ADC)，最近的研究也表明了靶向BCMA的CAR-T细胞能够在体内有效清除骨髓瘤细胞。

CAR-T是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，其原理在于经嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞可以特异性地识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境、打破宿主免疫耐受状态。CAR是CAR-T的核心结构，赋予细胞特异性识别肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原的能力，CAR主要由三个功能结构域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，胞外结构域抗原结合区及一段起连接作用的铰链区(Hinge)构成；胞内结构域由共刺激信号结构域(Costimulatory domain)和信号转导结构域(Signaling domain)构成。细胞外的抗原结合区在结合表达于靶细胞表面的靶蛋白后，会激活CAR结构的共刺激信号结构域和信号传导结构域，使得CAR-T同时具备激活信号和共激活信号，因此可以在杀伤肿瘤细胞的同时实现高效扩增。CAR-T疗法的有效性依赖于识别抗原的抗体的特异性以及该抗体对抗原结合的亲和力高低等性质。

目前，CAR T疗法通常以来源于单克隆抗体的scFv段作为抗原结合区，但是scFv的分子量较大而且容易形成多聚体，从而影响CAR的功能，进而影响CAR T细胞的治疗效果。纳米抗体是目前最小的抗体分子，纳米抗体自发现以来，逐渐受到人们关注，已有纳米抗体在自身免疫疾病、血液疾病、病毒感染相关疾病及骨科疾病中的应用，在抗感染、抗炎症性疾病以及抗神经退行性疾病等方面也都表现出了极大的优势。纳米抗体主要的优点：一是分子量小，组织穿透能力强，纳米抗体的大小只有普通抗体的1/10，这使其具有强大的组织穿透能力，甚至可以直接穿透血脑屏障，可提高对实体瘤的治疗效果；二是毒性和免疫原性低，由于其分子量小、体积小，所以对于宿主的免疫原性和毒性都很低；三是亲和力高，稳定性强，纳米抗体与抗原的亲和力很高，并且纳米抗体性质稳定，易溶于水，抗酸碱能力强；四是组合形式多样，可制成单、双和多功能抗体，实现多靶点的同时打击；五是生产周期短、生产成本低，纳米抗体易于制备，技术稳定后，1-2年便可成药；六是应用领域广泛可用于疾病治疗、医疗诊断、免疫亲和层析等领域。为了克服传统CAR T疗法中存在的上述技术问题，以及充分利用纳米抗体的上述优点，本发明提供了新型的靶向BCMA的纳米抗体VHH01和VHH02，以及包含所述纳米抗体的CAR-T细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，为本领域提供靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用，所述纳米抗体包括VHH01和VHH02，VHH01和VHH02对BCMA均具有较强的特异性和较高的亲和力，基于所述纳米抗体制备得到的CAR-T细胞对BCMA阳性细胞系均具有较高的特异性杀伤效率，且对不表达BCMA的细胞系无不良影响，应用前景广阔，在此基础上完成了以下发明。

纳米抗体

在一个方面，本发明提供了靶向BCMA的纳米抗体。

进一步，所述纳米抗体包括VHH01、VHH02；

优选地，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7所示；

更优选地，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8所示；

最优选地，所述VHH01的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

最优选地，所述VHH01的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15所示；

更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16所示；

最优选地，所述VHH02的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

更优选地，所述VHH02的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

与上述氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列所对应的纳米抗体，也即在对应的氨基酸序列或核苷酸序列的基础上将任意一个或多个位置的氨基酸或核苷酸替换为其他任意氨基酸或核苷酸之后得到的氨基酸序列或核苷酸序列，只要与本发明上述的氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

在某些实施方案中，所述纳米抗体还包括纳米抗体VHH01的功能性变异体、纳米抗体VHH02的功能性变异体，具体地，所述功能性变异体包括但不限于：在一级结构序列中基本类似、但包括本发明的亲本纳米抗体VHH01或VHH02中没有的，例如体外或体内的化学和/或生物化学改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化，这样的功能性变异体同样包含在本发明的保护范围内。

可选择地，功能性变异体可为如下的纳米抗体：与亲本纳米抗体VHH01或VHH02的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本纳米抗体VHH01或VHH02相比，本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能与BCMA发生特异性结合。例如，与亲本纳米抗体VHH01或VHH02相比，本发明的功能性变异体对BCMA可具有升高或降低的结合亲和力。

在本发明中，术语“同一性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用，“相似性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基为相似类型。例如，亮氨酸可被置换成异亮氨酸或缬氨酸。通常彼此置换的其它氨基酸包括但不限于：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)，天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)，天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)，以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中，蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质，提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域所公知的。

在本发明中，术语“BCMA”可与“CD269”、“TNFRSF17”互换使用，通常是指B细胞成熟抗原。例如，人BCMA通常是由994个核苷酸长的初级mRNA转录物(NM_001192.2)编码的184个氨基酸长的蛋白质。人BCMA的氨基酸序列用UniProtKB登录号Q02223表示。在本发明中，术语“BCMA”可包括包含突变的蛋白质，例如可包括包含全长野生型BCMA的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。在本发明中，术语“BCMA”还可包括完整BCMA蛋白的一部分，只要保留相关的生物活性即可。

基于单纳米抗体的嵌合抗原受体

在另一方面，本发明提供了一种基于单纳米抗体的靶向BCMA的嵌合抗原受体。

进一步，所述嵌合抗原受体包含本发明第一方面所述的纳米抗体中的任意一种；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含启动子；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含自断裂肽；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含检测标签/辅助功能元件；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含tEGFR信号肽；

更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8α、CD28、4-1BB、CD34、CD3ε、PD-1、IgG1、IgG4、OX40、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d；

更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8α、CD28、CD34、4-1BB、OX40、CD3ε、IgG1、IgG4、PD-1、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD16、CD22、CD33、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM-CSF；

更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB(CD137)、CD19、CD4、CD27、CD28、ICOS(CD278)、CD8α、CD8β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226；

更优选地，所述启动子包括：EF1α启动子、CMV启动子、EFS启动子、CAG启动子、CBh启动子、SFFV启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子；

更优选地，所述自断裂肽包括：T2A、P2A、E2A、F2A；

更优选地，所述检测标签/辅助功能元件包括：tEGFR、tCD34、tCD19、tCD20、tCD22、免疫检查点抑制剂(CTLA-4、PD-1/PD-L1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD226、CD155、CD47、B7-H3、B7-H4)纳米抗体、细胞因子及其受体(IL2、IL2受体、IL7、IL7受体、IL15、IL15受体)；

最优选地，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；

最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；

最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；

最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；

最优选地，所述启动子为EF1α；

最优选地，所述自断裂肽为T2A；

最优选地，所述检测标签/辅助功能元件为tEGFR；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、本发明第一方面所述的纳米抗体中的任意一种、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH01、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到。

在某些实施方案中，本发明中所述的EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，信号肽、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:25所示，对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:26-SEQ IDNO:33所示。

在某些实施方案中，本发明中所述的EF1α、信号肽、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR并不局限于上述序列，只要与上述氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

在本发明中，术语“嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)”通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括抗原(例如，肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号结构域。CAR是工程化的受体，可将任意特异性受体植入到免疫效应细胞上，尤其是T细胞上。在CAR中，可以将特异识别肿瘤抗原的VHH片段或单克隆抗体的scFv片段植入T细胞或NK细胞上。可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸导入T细胞、NK细胞或NK T细胞中。以这种方式，可以生成大量的癌症特异性T细胞、NK细胞或NK T细胞用于过继性细胞转移。在本发明中，所述CAR可以基于抗体的抗原(例如BCMA)特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合在一起。经遗传修饰表达CAR的T细胞可以特异地识别和消除表达靶抗原的恶性细胞。

基于双纳米抗体的嵌合抗原受体

在另一方面，本发明提供了基于双纳米抗体的靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含本发明第一方面所述的纳米抗体中的任意一种和其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体；

优选地，所述其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体为纳米抗体VHH02；

更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15所示；

更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16所示；

最优选地，所述VHH02的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

最优选地，所述VHH02的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

在某些实施方案中，本发明所述的纳米抗体VHH02还包括与上述氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列所对应的纳米抗体，也即在对应的氨基酸序列或核苷酸序列的基础上将任意一个或多个位置的氨基酸或核苷酸替换为其他任意氨基酸或核苷酸之后得到的氨基酸序列或核苷酸序列，只要与本发明上述的氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含启动子；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含自断裂肽；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含检测标签/辅助功能元件；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含tEGFR信号肽；

更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8α、CD28、4-1BB、CD34、CD3ε、PD-1、IgG1、IgG4、OX40、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d；

更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8α、CD28、CD34、4-1BB、OX40、CD3ε、IgG1、IgG4、PD-1、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD16、CD22、CD33、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM-CSF；

更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB(CD137)、CD19、CD4、CD27、CD28、ICOS(CD278)、CD8α、CD8β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226；

更优选地，所述启动子包括：EF1α启动子、CMV启动子、EFS启动子、CAG启动子、CBh启动子、SFFV启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子；

更优选地，所述自断裂肽包括：T2A、P2A、E2A、F2A；

更优选地，所述检测标签/辅助功能元件包括：tEGFR、tCD34、tCD19、tCD20、tCD22、免疫检查点抑制剂(CTLA-4、PD-1/PD-L1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD226、CD155、CD47、B7-H3、B7-H4)纳米抗体、细胞因子及其受体(IL2、IL2受体、IL7、IL7受体、IL15、IL15受体)；

最优选地，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；

最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；

最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；

最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；

最优选地，所述启动子为EF1α；

最优选地，所述自断裂肽为T2A；

最优选地，所述检测标签/辅助功能元件为tEGFR；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、本发明第一方面所述的纳米抗体中的任意一种、Linker、其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体、Linker、本发明第一方面所述的纳米抗体中的任意一种、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH01、Linker、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH02、Linker、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述Linker为(G4S)5。

在某些实施方案中，所述Linker是本领域常规使用的连接子，所述Linker并不局限于(G4S)₅，可以是(GGGGS)n、(GGGS)n、(SSSSG)n、(GSGSA)n、(GGSGG)n或其他连接子中的任意一种，其中，n可以为1-10之间的任意整数。

在某些实施方案中，本发明中所述的EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，信号肽、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:25所示，对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:26-SEQ IDNO:33所示。

在某些实施方案中，本发明中所述的EF1α、信号肽、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR并不局限于上述序列，只要与上述氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

核酸分子

在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子。

进一步，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列；

优选地，本发明第一方面所述的纳米抗体中的VHH01的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优选地，本发明第一方面所述的纳米抗体中的VHH02的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中CD8α跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中tEGFR信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；

优选地，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体或本发明第三方面所述的嵌合抗原受体中tEGFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。

在本发明中，术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

表达载体

在另一方面，本发明提供了一种包含本发明第四方面所述核酸分子的表达载体；

优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、病毒来源的载体；

更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。

在某些实施方案中，本发明对载体没有特别的限制，其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括质粒载体、病毒来源的载体、噬菌体载体和其他常规用于例如遗传工程的载体。可基于本领域技术人员众所周知的方法构建各种质粒和载体。

在某些实施方案中，根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达，并因此保证由此编码的本发明所述的靶向BCMA的纳米抗体或嵌合抗原受体在选择的宿主中的表达。表达载体可以例如是克隆载体、双元载体或整合型载体。表达包括核酸分子的转录，例如转录成可翻译的mRNA。

载体的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适合于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全部为Invitrogen)。适合于在爪蟾属(Xenopus)胚胎、斑马鱼胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。

通常，载体可含有一种或多种用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)和一种或多种表达盒。另外，可以使用已确立的方法将载体中包含的编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列连接。这种调控序列是本领域技术人员所熟知的，并且包括但不限于确保转录起始的调控序列、内部核糖体进入位点(IRES)和任选的确保转录终止和转录物稳定的调控元件。确保转录起始的这种调控元件的非限制性实例包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调控元件，其包括在本发明的核酸分子的下游。进一步的例子包括Kozak序列和侧翼为用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列，编码分泌信号的核苷酸序列，或取决于所用的表达系统的信号序列，其能够将表达的蛋白质引导至细胞区室或培养基。载体也可含有编码一种或多种蛋白伴侣的另外的可表达多核苷酸，以促进正确的蛋白质折叠。

经工程改造的宿主细胞

在另一方面，本发明提供了一种经工程改造的宿主细胞。

进一步，所述经工程改造的宿主细胞包含本发明第五方面所述的表达载体；

优选地，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞；

更优选地，所述宿主细胞为免疫细胞；

最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、gdT细胞、iPS来源的任何免疫细胞或其任意组合；

最优选地，所述免疫细胞为T细胞。

在本发明中，术语“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞、如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞、如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞、如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞优选为免疫细胞，所述免疫细胞包括但不限于：T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合，优选为T细胞，此外，本发明所述的“宿主细胞”可以包括单个细胞或细胞群体，也即本发明上述的“经工程改造的宿主细胞”包括单个经工程改造的宿主细胞和经工程改造的宿主细胞群体。

免疫偶联物或检测试剂

在另一方面，本发明提供了一种免疫偶联物或一种用于检测BCMA蛋白的试剂。

进一步，所述免疫偶联物含有本发明第一方面所述的纳米抗体和与其偶联的偶联物；

优选地，所述偶联物包括可检测标记物、放射性核素、细胞因子、治疗剂、细胞毒素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合；

更优选地，所述可检测标记物包括荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂；

更优选地，所述放射性核素包括¹³¹I、³²P、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、²²³Ra、¹²⁵I、¹⁰³Pd；

更优选地，所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、TNF-α、G-CSF、M-CSF；

更优选地，所述治疗剂包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂；

最优选地，所述烷化剂包括双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、溴丙哌嗪、松龙苯芥、磷雌氮芥、环磷酰胺、六甲密胺、异磷酰胺、福替目丁、三胺硫磷、卡氮芥、链唑霉素、英丙舒凡、氮烯咪胺、顺铂、奥沙利铂、卡铂；

最优选地，所述抗代谢物包括甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶、氟苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、克拉屈滨、脱氧柯福霉素、喷司他丁；

最优选地，所述抗肿瘤抗生素包括柔红霉素、阿霉素、去甲氧正定霉素、光神霉素、丝裂霉素C、戊柔比星、盐酸米托蒽醌、博来霉素、更生霉素、光辉霉素、甲基苄肼；

最优选地，所述有丝分裂抑制剂包括紫杉萜、长春碱、紫杉醇、长春新碱、长春酰胺、长春瑞滨；

最优选地，所述染色质功能抑制剂包括依立替康、依托扑沙、托泊替康、磷酸依托扑沙、鬼臼噻吩甙；

最优选地，所述抗血管生成剂包括普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、丙亚胺、马马司他、巴马司他、CGS-27023A、溴氯哌喹酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺；

最优选地，所述抗雌激素包括托瑞米芬、雷洛昔芬、它莫西芬、阿纳托唑、来曲唑、屈洛昔芬、奥多昔芬、依西美坦；

最优选地，所述抗雄激素包括尼鲁米特、比卡鲁胺、安体舒通、氟他米特、非那司提、醋酸环丙氯地孕酮、西咪替丁；

最优选地，所述免疫调节剂包括白介素、肿瘤坏死因子、干扰素、蘑菇多糖、西佐糖、罗喹美克、匹多莫特、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脱氨酶、胸腺肽制剂；

更优选地，所述细胞毒素包括MMAE、DM1、Ozogamicin、Dxd、SN-38、MMAF、PBD、DM2、Amanitin、DM4、PNU-159682、IR700、PE-38、PE24、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40；

优选地，所述用于检测BCMA蛋白的试剂包含本发明第一方面所述的纳米抗体或所述的免疫偶联物；

更优选地，所述试剂还包含与所述纳米抗体或免疫偶联物偶联的诊断剂；

最优选地，所述诊断剂包括放射性核素、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶、光敏诊断剂；

最优选地，所述放射性核素包括¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵⁵Co、⁷²As；

最优选地，所述化学发光剂包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯；

最优选地，所述生物发光剂包括荧光素、荧光素酶、水母发光蛋白；

最优选地，所述顺磁性离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)；

最优选地，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶；

最优选地，所述光敏诊断剂包括二羟基硅酞菁、亚甲基蓝、原卟啉、血卟啉、光卟啉。

药物组合物或试剂盒

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物或一种试剂盒。

进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞和/或本发明第七方面中所述的免疫偶联物；

优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学或生理学上可接受的载体和/或辅料；

优选地，所述药物组合物用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病；

更优选地，所述BCMA阳性相关疾病包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌；

优选地，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第七方面中所述的免疫偶联物或试剂；

更优选地，所述试剂盒用于检测BCMA蛋白。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等，在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于溶解待测样品的裂解介质、检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

在某些实施方案中，本发明所述的药物组合物还可包含其他能够用于辅助治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的治疗剂，所述药物组合物中的本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面中所述的免疫偶联物和/或其他治疗剂可以同时、分开或相继施用。

在某些实施方案中，所述药学或生理学上可接受的载体和/或辅料可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

在某些实施方案中，所述药物组合物中包含的本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞和/或本发明第七方面中所述的免疫偶联物为“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞和/或本发明第七方面中所述的免疫偶联物，其中，“预防有效量”是指足以预防、阻止、或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重程度、患者自身的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄、体重和性别、药物的施用方式、以及同时使用的其他治疗方法等等。

在某些实施方案中，本发明提供的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由临床医师根据受试患者的种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它本领域技术人员公知的任何合适的给药方式。

生产方法、制备方法和检测方法

在另一方面，本发明提供了如下任一种方法：

(1)一种产生本发明第一方面所述的纳米抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞，从而获得含有所述纳米抗体的培养物；

(b)从步骤(a)得到的培养物中分离或回收所述纳米抗体；

(c)纯化步骤(b)得到的纳米抗体得到本发明第一方面所述的纳米抗体；

(2)一种制备本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第四方面所述的核酸分子或本发明第五方面所述的表达载体引入到宿主细胞中；

优选地，所述引入的方法包括脂质转染法、微注射、电穿孔、DNA载体、RNA载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；

优选地，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞；

更优选地，所述宿主细胞为免疫细胞；

最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、gdT细胞、iPS来源的任何免疫细胞或其任意组合；

最优选地，所述免疫细胞为T细胞。

(3)一种非诊断目的地检测BCMA蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与本发明第一方面所述的纳米抗体和/或本发明第七方面中所述的免疫偶联物或试剂接触，检测抗体-抗原复合物的存在。

本发明还提供了一种用于诊断受试者是否患有BCMA阳性相关疾病的方法，所述方法包括如下步骤：将来源于受试者的待测样品与本发明第一方面所述的纳米抗体和/或本发明第七方面中所述的免疫偶联物或试剂接触，检测所述纳米抗体、免疫偶联物或试剂与BCMA之间复合物的形成或检测所述复合物的量，其中，所述复合物的形成表明存在BCMA或表达BCMA的细胞。

在某些实施方案中，所述方法诊断受试者是否患有BCMA阳性相关疾病的方法还可以包括：将所述BCMA在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。所述参考值可以是BCMA在来自于已知不具有与BCMA有关的疾病的受试者(例如健康对照者)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。例如，如果BCMA在来自所述受试者的样品中的量相对于阴性参考值升高时，则指示所述受试者患有与BCMA相关的疾病。

在本发明中，术语“待测样品”是指从受试者分离的采集物(如流体、细胞或组织)，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性待测样品为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织的或分泌器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如培养基(包括条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。

在本发明中，术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在某些实施方案中，所述“受试者”优选为人。

本发明还提供了一种用于治疗BCMA阳性相关疾病的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用有效量的本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面中所述的免疫偶联物和/或本发明第八方面所述的药物组合物。

在某些实施方案中，所述施用的方式包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何适当的途径，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短期的还是长期的。本文考虑多种给药时间方案，包括但不限于：单次或在多个时间点多次施用，推注施用和脉冲输注。

在制备治疗试剂和诊断试剂中的应用

在另一方面，本发明提供了如下任一方面的应用：

(1)本发明第一方面所述的纳米抗体在非诊断目的地检测BCMA蛋白中的应用；

(2)本发明第一方面所述的纳米抗体在制备用于检测BCMA蛋白的试剂或试剂盒中的应用；

(3)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明第四方面所述的核酸分子或本发明第五方面所述的表达载体在制备用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的经工程改造的宿主细胞中的应用；

(4)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体或本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的免疫偶联物中的应用；

(5)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞或本发明第七方面中所述的免疫偶联物在制备用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的药物中的应用；

(6)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面中所述的免疫偶联物或本发明第八方面所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的生物制剂中的应用；

优选地，所述BCMA阳性相关疾病包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。

在本发明中，术语“BCMA阳性相关疾病”是指任何与BCMA的表达相关的疾病或病症，包括但不限于：多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。只要与BCMA的表达相关的疾病或病症均在本发明的保护范围内。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

(1)本发明提供了靶向BCMA的纳米抗体VHH01和VHH02，纳米抗体VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示，纳米抗体VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15所示，所述纳米抗体对BCMA均具有较强的特异性和较高的亲和力，均能够与BCMA阳性细胞系以高亲和力发生特异性地结合，并且具有较好的稳定性，结构简单，易于进行工程化改造等优点，为开发有效的靶向BCMA的免疫治疗药物提供了全新的思路。

(2)本发明提供了包含纳米抗体VHH01和/或VHH02的嵌合抗原受体，还提供了基于该嵌合抗原受体制备得到的靶向BCMA的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞能够特异性识别BCMA阳性肿瘤细胞系，对BCMA阳性细胞系具有较高的特异性杀伤效率，且对不表达BCMA的细胞系无不良影响，避免了脱靶带来的治疗毒性安全问题，为本领域提供了一种与BCMA的表达相关的疾病的潜在治疗方案，具有重要的应用前景和临床价值。

附图说明

图1为羊驼免疫及抗体筛选流程示意图；

图2为纳米抗体库富集筛选结果统计图；

图3为抗BCMA纳米抗体单克隆筛选结果统计图；

图4为过表达细胞系K562-BCMA流式细胞术检测结果图；

图5为单VHH CAR结构示意图，其中，A图：单VHH CAR结构组成示意图，B图：单VHHCAR结构在细胞表面的展示示意图；

图6为单VHH CAR-T细胞转导率测定代表性结果图；

图7为单VHH CAR-T细胞表面MFI值统计结果图；

图8为单VHH CAR-T细胞扩增曲线图；

图9为单VHH CAR-T培养过程中CD4/CD8比值统计结果图；

图10为单VHH CAR-T细胞对K562-BCMA的杀伤实验结果图；

图11为双VHH CAR结构示意图，其中，A图：双VHH CAR结构组成示意图，B图：双VHHCAR结构在细胞表面的展示示意图；

图12为K562-dNMC003-A&K562-dNMC003-B细胞表面MFI值统计结果图；

图13为dNMC003-A &dNMC003-B CAR-T细胞转导率测定代表性结果图；

图14为dNMC003-A&dNMC003-B CAR-T细胞扩增曲线图；

图15为dNMC003-A&dNMC003-B CAR-T细胞培养过程中活率统计结果图；

图16为dNMC003-A&dNMC003-B CAR-T培养过程中CD4/CD8比值统计结果图；

图17为dNMC003-A&dNMC003-B CAR-T体外功能验证结果图，其中，A图：dNMC003-A&dNMC003-B、NMC003-01&NMC003-02对细胞系K562-BCMA和细胞系K562的杀伤结果图，B图：dNMC003-A&dNMC003-B对细胞系RPMI 8226和细胞系U87-MG的杀伤结果图；

图18为dNMC003-A&dNMC003-B CAR-T细胞与K562-BCMA、RPMI8226、U87-MG细胞共孵育后IFN-γ检测结果图；

图19为Nb003-01、Nb003-02、dNb003-A、dNb003-B亲和力检测结果(ELISA法)图，其中，A图：Nb003-01与人BCMA抗原的亲和力检测结果图，B图：Nb003-02与人BCMA抗原的亲和力检测结果图，C图：dNb003-A与人BCMA抗原的亲和力检测结果图，D图：dNb003-B与人BCMA抗原的亲和力检测结果图；

图20为Nb003-01、Nb003-02、dNb003-B亲和力检测结果(SPR法)图，其中，A图：Nb003-01与人BCMA抗原的亲和力检测结果图，B图：Nb003-02与人BCMA抗原的亲和力检测结果图，C图：dNb003-B与人BCMA抗原的亲和力检测结果图；

图21为Nb003-01、Nb003-02、dNb003-A、dNb003-B专属性验证结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1抗BCMA的纳米抗体的筛选

1、动物免疫及效价测定

(1)抗原制备

利用RNA提取试剂盒提取RPMI 8226细胞中的RNA。参考SuperScript^TMII ReverseTranscriptase使用说明书，利用random primers引物进行反转录，获得cDNA。以cDNA为模板，通过PCR获得抗原BCMA的胞外区基因序列。将BCMA胞外区基因序列连接入蛋白表达载体中进行表达，并进行Ni柱纯化，获得纯化的BCMA蛋白。

(2)动物免疫

利用本发明自主纯化的BCMA-His蛋白进行羊驼免疫，具体羊驼免疫流程见图1。每周进行1次免疫，共连续进行6次免疫；第6次免疫之前，抽血5mL进行效价预测试，最后一次免疫7天后采集外周血100mL进行抗体库的构建与筛选。

2、纳米抗体库的构建与富集筛选

(1)纳米抗体库的构建

最后一次免疫7天后，采集羊驼外周血100mL，通过Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞，并进行RNA的提取，并利用反转录试剂盒进行cDNA的制备。

以cDNA为模板，使用免疫球蛋白重链区特异的引物CALL001和CALL002，从cDNA中扩增出所有免疫球蛋白重链(VHs和VHH)的可变区，其中大小约为700bp的片段代表仅有重链的抗体库，大小约为1000bp的片段对应于传统抗体的重链。用1％(wt/Vol)琼脂糖凝胶对扩增产物进行分析。并通过胶回收的方法对大小约700bp的产物进行回收。

以胶回收产物为模板，用简并引物VHH-BACK和VHH-FOR对VHHs序列进行特异扩增，用1％(wt/Vol)琼脂糖凝胶对扩增产物进行分析。并将其连接入pMES4噬菌体展示载体，将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，所得菌库即为构建的BCMA的单域重链抗体噬菌体展示文库；文库构建完成后，为检测文库的插入效率，随机选择25个克隆利用引物MP57以及GⅢ进行了菌落PCR，并将PCR产物进行Sanger测序，纳米抗体库的构建流程如图1所示，用到的引物序列见表1。

表1引物列表

引物名称	引物序列
		CALL001	5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’
CALL002	5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’
		VHH-BACK	5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3’
VHH-FOR	5’-CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3’
		MP57	5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’
GⅢ	5’-CCACAGACAGCCCTCATAG-3’

(2)抗体库的富集筛选

取TG1大肠杆菌纳米抗体文库转接到2-YT液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD值为0.5，然后加入辅助噬菌体VCSM13对细胞进行侵染。轻轻混合后在37℃下孵育30分钟。离心菌液以去除微量葡萄糖，再将沉淀重悬于同时加有氨苄和卡那霉素抗性的2-YT培养基中，37℃，200rpm摇培过夜，以扩增展示纳米抗体的噬菌体；将过夜培养物转移到50mL离心管中，离心取上清液，并添加20％(wt/vol)PEG6000/2.5M NaCl溶液沉淀噬菌体。离心弃上清，并将沉淀重新悬浮于1mL PBS中。离心后将上清液转移到新的离心管中，添加甘油至终浓度为20％保存于-80℃中；噬菌体纳米抗体库滴度测定，将噬菌体按10倍梯度进行稀释，取不同稀释倍数的噬菌体对对数生长期的TG1细菌进行侵染，37℃过夜培养，通过第二天的菌斑数目推算噬菌体纳米抗体库的滴度。

通过ELISA的方法对纳米抗体进行淘选，将重组BCMA-His蛋白包被在酶标板上，在4℃下孵育过夜；用250μL PBST清洗酶标板三次，添加200μL封闭液，于室温孵育酶标板2h；在每个孔中加入相对应的噬菌体，室温孵育2h；250μL PBST洗板15次；每孔添加100μL胰蛋白酶，室温700rpm孵育0.5h；用AEBSF洗脱噬菌体；将洗脱下的噬菌体进行滴度测定和噬菌体侵染扩增；洗脱下的噬菌体数量阳性：阴性≥100时，停止淘选，抗体库的富集筛选流程如图1所示。

3、单克隆鉴定

从经过两轮筛选后得到的TG1大肠杆菌文库中挑选单个克隆进行扩大培养，并利用辅助噬菌体VCSM13进行侵染，进行单克隆噬菌体的制备。将单克隆噬菌体加入到包被有BCMA蛋白，并用2％脱脂奶粉封闭的酶标板中，室温孵育2h；PBST清洗板子后，加入HA-HRP抗体，室温孵育1h；PBST清洗板子后，加入100μL TMB单组份显色液，室温孵育30min后加入100μL终止液；利用酶标仪检测450nm处的吸光度；当样品孔的OD450值与空白对照比例大于2时判定为阳性克隆，单克隆鉴定流程如图1所示；对阳性克隆进行菌液PCR，进行Sanger测序；经过Sanger测序的单克隆，利用软件DNAMAN进行序列比对。并筛选出序列特异性的克隆。

4、实验结果

纳米抗体库构建的结果显示，成功构建BCMA的纳米抗体文库，库容量为3E8，插入率接近95％。

抗体库的淘选结果见图2，经过两轮富集筛选，最终噬菌体数量阳性：阴性比例达到262.1倍，已达到了筛选单克隆的标准。所以淘选两轮后，停止淘选，进行下一步单克隆的筛选和鉴定。

经过序列鉴定，最终筛选得到两株序列特异且ELISA检测OD450值较高的克隆，分别命名为Nb003-01(VHH01)和Nb003-02(VHH02)。OD450结果如图3所示。其中，纳米抗体VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示，对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示，纳米抗体VHH01的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；纳米抗体VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15所示，对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16所示，纳米抗体VHH02的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

实施例2K562-BCMA稳转细胞系的构建

1、实验方法

以实施例1中获得的cDNA为模板，用PCR的方式获得BCMA全长序列，并且两端带有Xho I和EcoR I酶切位点，通过双酶切、连接方式将该序列插入慢病毒载体pLVX-Puro载体中，重组质粒命名为pLVX-BCMA-Puro。该重组质粒采用CMV启动子，并带有嘌呤霉素抗性基因。

将目的质粒pLVX-BCMA-Puro连同辅助质粒一起进行慢病毒包装。CAR-T细胞制备前，首先进行慢病毒的包装：将目的质粒与三个辅助质粒(pMD2.G、pRSV-REV、pMDLg/RRE)在PEI-Pro作用下共转染293FT细胞；包装6小时进行换液；包装48小时后进行慢病毒收获；收获的慢病毒原液进行超速离心浓缩，用DMEM高糖培养基重悬慢病毒颗粒，并进行分装备用。

2、实验结果

结果见图4，结果显示，构建得到的K562-BCMA稳转细胞系高表达BCMA，即本发明成功构建得到了K562-BCMA稳转细胞系。

实施例3单VHH CAR-T细胞的制备及体外功能验证

1、单VHH CAR结构构建

将序列特异性的克隆进行单VHH CAR结构的构建。首先，以测序成功的质粒为模板，用引物NCAR-F1和NCAR-R1扩增阳性克隆株的VHH序列；第一轮PCR结束后，以第一轮PCR产物为模板，用引物NCAR-F2和NCAR-R2进行第二轮PCR；将第二轮PCR产物通过同源重组的方式，连接入载体Senl-S88BZ，载体用Not I单酶切。至此，包含有靶向BCMA的单VHH的CAR结构构建成功，结构示意图见图5，引物序列见表2。

表2单VHH CAR结构构建用引物列表

共构建2个单VHH CAR结构，分别命名为NMC003-01、NMC003-02，结构如图5所示，EF1α为延长因子1α的启动子，Leader是信号肽的编码序列，VHH是抗BCMA的纳米抗体的编码序列，CD8αH+TM为CD8α铰链区和跨膜区，4-1BB和CD3ζ胞内信号区为胞内共刺激域，通过T2A肽连接表达tEGFR胞外区域，以便慢病毒转导后检测CAR的表达。所述NMC003-01为EF1α、信号肽、VHH01、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；所述NMC003-02为EF1α、信号肽、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到。其中，EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，信号肽、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:25所示，对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:26-SEQ ID NO:33所示。

2、慢病毒包装

CAR-T细胞制备前，首先进行慢病毒的包装：将目的质粒与三个辅助质粒(pMD2.G、pRSV-REV、pMDLg/RRE)在PEI-Pro作用下共转染293FT细胞；包装6小时进行换液；包装48小时后进行慢病毒收获；收获的慢病毒原液进行超速离心浓缩，用DMEM高糖培养基重悬慢病毒颗粒，分装备用。

3、单VHH CAR-T细胞制备

慢病毒包装完成后，进行CAR-T细胞的制备：采集患者或健康供者外周血单个核细胞(PBMC)；通过CD3磁珠进行αβT细胞分选；分选完成的αβT细胞在TexMACS GMP培养基(MACS)中进行培养；2天后进行慢病毒的转导；继续培养到12-14天进行CAR-T细胞收获，获得靶向BCMA的VHH CAR-T细胞(分别命名为NMC003-01和NMC003-02)；培养过程中进行流式检测，测定CAR+细胞的比例，用抗EGFR抗体检测tEGFR的表达，用BCMA-His蛋白作一抗，抗His标签抗体为二抗检测细胞表面纳米抗体的表达情况，并且对用BCMA-His抗原检测CAR-T细胞表面VHH的MFI值进行统计。在细胞培养的第6天、第9天、第12天分别进行细胞计数，统计细胞扩增，并在培养的第6天、第12天取样进行流式检测，对CAR-T细胞CD4/CD8比例进行统计。

4、单VHH CAR-T细胞的体外功能验证

为了验证本实施例制备得到的抗BCMA VHH CAR-T细胞的体外生物学活性，培养过程中进行了体外杀伤实验的验证：首先收集靶细胞，分别收集实施例2中所述的过表达细胞系K562-BCMA(K562为人慢性髓原白血病细胞)，2000rpm离心5min，DPBS重悬计数，按1×10⁵个/孔的数量加到96孔板中。然后根据不同效靶比(E：T＝0.3：1、1：1、3:1)向靶细胞中添加适量的效应细胞，混合后孵育4小时，流式细胞术检测细胞杀伤比例。

5、实验结果

将单VHH结构转导T细胞制备CAR-T细胞，CAR-T细胞培养6天后的流式细胞术代表性检测结果见图6，图中CAR(Erb)展示的是细胞表面tEGFR的表达情况，CAR(BCMA)展示的是细胞表面纳米抗体的表达情况，由结果可知，NMC003-01和NMC003-02两种CAR-T细胞均特异性的表达CAR(Erb)和CAR(BCMA)。并且对CAR-T细胞表面纳米抗体MFI进行了统计，结果见图7，由结果可知，与空白T相比，NMC003-01和NMC003-02表面的纳米抗体的MFI均有显著的提高。以上结果证明了单VHH CAR结构中的tEGFR和纳米抗体均成功进行了表达。

单VHH CAR-T培养过程中，对细胞扩增倍数、CD4/CD8比值进行了统计分析，图8展示的是单VHH CAR-T扩增曲线，从开始培养到12天收获，NMC003-01、NMC003-02、空白T细胞的扩增倍数分别为26.8、20.6、29.2，NMC003-01、NMC003-02的扩增倍数与空白T细胞相当。细胞培养过程中CD4/CD8比值如图9所示，培养过程中CD4/CD8比例有一定变化，最终收获时NMC003-01、NMC003-02的CD4/CD8比值分别为2.75、2.56，空白T细胞CD4/CD8比例为2.07。以上结果证明了单VHH CAR-T细胞成功进行了扩增，并且扩增过程中CD4/CD8比例趋于正常水平。

通过对K562-BCMA的杀伤实验来验证单VHH CAR-T细胞的体外生物学活性，图10展示的是单VHH CAR-T对K562-BCMA的体外杀伤结果，在杀伤比例为0.3：1、1：1、3：1时，NMC003-01、NMC003-02对K562-BCMA均产生了特异性的杀伤，并且随着效靶比的升高，杀伤率逐渐升高。NMC003-01和NMC003-02对K562-BCMA的杀伤比例显著高于空白T细胞。以上结果表明了单VHH CAR-T细胞对BCMA表达阳性的细胞系均产生了特异性的杀伤。

实施例4双VHH CAR-T(dNMC003-A、dNMC003-B)细胞的制备与功能验证

1、dNMC003-A和dNMC003-B结构构建

将本发明筛选到的纳米抗体Nb003-01和Nb003-02用于构建双VHH的CAR结构目的质粒，结构示意图如图11所示，dNMC003-A抗原结合区包括两个VHH02，dNMC003-B抗原结合区包括VHH01和VHH02。首先，利用PCR的方法扩增VHH02序列；第一轮PCR结束后，以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，引物序列见表3。然后，将第二轮PCR产物通过同源重组的方式分别连接入载体NMC003-01和NMC003-02中，载体用Not I单酶切，连接入载体NMC003-02的重组质粒命名为dNMC003-A，连接入载体NMC003-01的重组质粒命名为dNMC003-B，结构示意图如图11。

EF1α为延长因子1α的启动子，Leader是信号肽的编码序列，VHH01和VHH02是抗BCMA的纳米抗体的编码序列，CD8αH+TM为CD8α铰链区和跨膜区，4-1BB和CD3ζ胞内信号区为胞内共刺激域，通过T2A肽连接表达tEGFR胞外区域，以便慢病毒转导后检测CAR的表达。所述dNMC003-A为EF1α、信号肽、VHH02、Linker((G4S)₅)、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；所述dNMC003-B为EF1α、信号肽、VHH01、Linker((G4S)₅)、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到。其中，EF1α、信号肽、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR的序列信息如实施例3中所示。

表3双VHH CAR结构构建用引物列表

2、K562-dNMC003-A和K562-dNMC003-B细胞制备

按实施例3的制备流程进行慢病毒包装，慢病毒包装完成后，将慢病毒进行K562细胞系的转导。并将转导dNMC003-A和dNMC003-B系列慢病毒的K562进行培养，培养3天后进行流式细胞术检测，用BCMA-His蛋白作一抗，抗His标签抗体为二抗检测细胞表面纳米抗体的表达情况。并对K562表面VHH的MFI进行统计。

3、dNMC003-A和dNMC003-B CAR-T细胞的制备

按照实施例3中的制备流程进行dNMC003-A和dNMC003-B CAR-T细胞的培养，并同时进行NMC003-01、NMC003-02 CAR-T细胞的培养，培养过程中进行流式检测，测定CAR+细胞的比例，用抗EGFR抗体检测tEGFR的表达，用BCMA-His蛋白作一抗，抗His标签抗体为二抗检测细胞表面纳米抗体的表达情况。在细胞培养的第6天、第9天、第13天分别进行细胞计数，统计细胞扩增和活细胞比例，并取样进行流式检测，对CAR-T细胞CD4/CD8比例进行统计。

4、dNMC003-A和dNMC003-B CAR-T细胞的体外功能验证

为了验证本实施例制备得到的dNMC003-A、dNMC003-B、NMC003-01、NMC003-02CAR-T细胞的体外生物学活性，培养过程中进行了体外杀伤实验的验证。首先收集靶细胞，分别收集K562(人慢性髓原白血病细胞)和BCMA过表达细胞系K562-BCMA，2000rpm离心5min，DPBS重悬计数，按1×10⁵个/孔的数量加到96孔板中。然后以按照效应细胞：靶细胞(E:T)＝3:1的比例向靶细胞中添加相应的效应细胞dNMC003-A、dNMC003-B、NMC003-01、NMC003-02 CAR-T细胞，混合后孵育4小时，流式细胞术检测细胞杀伤比例。

同时，按照以上方法测试dNMC003-A、dNMC003-B CAR-T细胞对人多发性骨髓瘤外周血B淋巴细胞RPMI 8226(购自北纳生物)和BCMA表达阴性细胞系人脑胶质瘤细胞系U87-MG(购自北纳生物)的体外杀伤效果。

另外取靶细胞，调整细胞密度为2×10⁶个/mL，加入96孔板中，每孔100μL，孔密度为2×10⁵个/孔，按照效应细胞：靶细胞(E:T)＝3:1，向每孔靶细胞中添加适量的效应细胞dNMC003-A、dNMC003-B CAR-T细胞，混匀后，共同孵育18小时，取上清检测IFN-γ的分泌。

5、实验结果

将双VHH结构转导K562细胞后，K562-dNMC003-A和K562-dNMC003-B细胞BCMA抗原染色的MFI统计结果如图12所示，由结果可知，K562-dNMC003-A和K562-dNMC003-B表面VHH的表达强度均高于空白T细胞，表明了双VHH CAR结构中的纳米抗体成功在K562细胞中进行了表达。

CAR-T细胞培养6天后的流式细胞术代表性检测结果见图13，图中CAR(Erb)展示的是细胞表面tEGFR的表达情况，CAR(BCMA)展示的是细胞表面纳米抗体的表达情况，由结果可知，dNMC003-A和dNMC003-B两种双VHH CAR-T细胞均特异性的表达CAR(Erb)和CAR(BCMA)。

本实施例CAR-T细胞培养过程中，对细胞扩增倍数、CAR-T细胞活率、CD4/CD8比值进行了统计分析。图14展示的是NMC003-01、NMC003-02、dNMC003-A、dNMC003-B CAR-T扩增曲线，由图可知，扩增到第13天，NMC003-01的扩增倍数为56.9倍，NMC003-02的扩增倍数为60.6倍，dNMC003-A的扩增倍数为63.6倍，dNMC003-B的扩增倍数为59.1倍，空白T细胞的扩增倍数为68.5倍。图15展示的是NMC006-04、NMC006-06、dNMC006-A CAR-T细胞培养过程中细胞活率的统计结果，由图可知，整个扩增过程中，CAR-T细胞均保持较高的细胞活率。细胞培养过程中CD4/CD8比值如图16所示，培养过程中CD4/CD8比例有所下降，最终收获时NMC003-01、NMC003-02、dNMC003-A、dNMC003-B的CD4/CD8比值分别为0.24、0.31、0.26、0.23，与空白T细胞处于相当的水平(0.36)。以上结果证明了双VHH CAR-T细胞成功进行了扩增，并且扩增过程中具有较高的活率，与空白T相比，CD4/CD8比例趋于正常水平。

通过对K562、K562-BCMA、RPMI 8226和U87-MG的杀伤实验来验证双VHH CAR-T细胞的体外生物学活性，图17A展示的是双VHH CAR-T对K562和K562-BCMA的体外杀伤结果，结果显示，4种CAR-T对K562-BCMA均产生了特异性的杀伤，并且在效靶比均为3:1的前提下，双VHH CAR-T的杀伤比例要高于单VHH CAR-T；图17B展示的是双VHH CAR-T对RPMI 8226和U87-MG的体外杀伤结果，结果显示，双VHH CAR-T对BCMA阳性细胞系RPMI 8226也产生了特异性的杀伤，对BCMA阴性细胞系U87-MG未产生明显的杀伤。

并且，双VHH CAR-T细胞分别与K562-BCMA、RPMI 8226共孵育后的培养基上清液中INF-γ的浓度远高于与U87-MG孵育后的培养基(见图18)。以上结果表明了双VHH CAR-T细胞对BCMA表达阳性的细胞系均产生较高的杀伤效果，对BCMA表达阴性的细胞系未产生杀伤效果，表明两种双VHH CAR-T细胞对BCMA阳性细胞系产生的杀伤是特异的。

实施例5抗体特性鉴定

1、重组抗体表达

为了进一步确认实施例1筛选到的纳米抗体Nb003-01、Nb003-02，以及双纳米抗体dNb003-A、dNb003-B的特性，本实施例对所述纳米抗体进行了体外表达与纯化。首先，通过分子克隆的方式将纳米抗体Nb003-01、Nb003-02、dNb003-A、dNb003-B插入至pET-28a-Sumo-Nb-Fc(本实验室留存)质粒的BamH I和NHE I酶切位点之间。在纳米抗体序列的N端包括SUMO标签(SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白，研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，还具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能)，在纳米抗体序列的C端带有人IgG1 Fc标签，用于蛋白纯化。测序正确后提取质粒，然后转化至大肠杆菌菌株BL21中，并在IPTG诱导下进行蛋白表达；表达完成后收集菌体进行超声裂解菌体获得粗提蛋白；经过Protein A亲和层析纯化获得纯度较高的纳米抗体。纯化获得纳米抗体分别命名为Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-A-Fc、dNb003-B-Fc。

2、亲和力检测

(1)ELISA检测抗体亲和力

本实施例中采用ELISA检测方法分别测定纳米抗体Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-A-Fc、dNb003-B-Fc对人BCMA的亲和力。将实施例1中制备得到的BCMA-His蛋白进行过夜包被，以经过表达纯化后不同稀释度的纳米抗体作为一抗，抗人IgG1 Fc-HRP抗体为二抗，检测各个抗体与对应抗原之间的亲和力。(2)SPR方法检测抗体亲和力

将表达纯化后的纳米抗体Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-B-Fc用于SPR测定。使用Biacore 8K分析系统通过SPR测定纳米抗体Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-B-Fc对人BCMA的亲和力。

各纳米抗体与BCMA-His的亲和力检测方法：首先，使用捕获法将BCMA-His固定在NTA芯片上；再将倍比稀释的Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-B-Fc作为流动相以30μL/min的流速注射，然后进行解离；最后，使用Biacore T200 Evaluation Software Kinetic1:1Binding模式对结果进行分析。

3、专属性检测方法

流式细胞术检测Nb003-01、Nb003-02、dNb003-A、dNb003-B对BCMA的专属性。流式细胞术检测Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-A-Fc、dNb003-B-Fc对BCMA阳性细胞系的专属性。分别以生物素化的纯化后纳米抗体Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-A-Fc、dNb003-B-Fc为一抗，以SA-PE抗体为二抗通过流式细胞术检测各纳米抗体与人BCMA阳性细胞系K562-BCMA、RPMI 8226，BCMA阴性的细胞系K562细胞系的结合情况；以此来确定各纳米抗体对人BCMA抗原的专属性。

4、实验结果

ELISA方法检测抗体亲和活性结果见图19，结果显示，Nb003-01-Fc与人BCMA的EC50值为2.048nM；Nb003-02-Fc与人BCMA的EC50值为0.6518nM；dNb003-A-Fc与人BCMA的EC50值为0.02227nM；dNb003-B-Fc与人BCMA的EC50值为0.3458nM。

SPR方法检测抗体亲和活性结果如表4和图20所示，Nb003-01与人BCMA的之间的亲和力常数为6.20×10^-8；Nb003-02与人BCMA之间的亲和力常数为1.79×10^-9；dNb003-B与人BCMA之间的亲和力常数为1.94×10^-9。

上述结果表明了本发明经筛选鉴定得到的2个抗BCMA的纳米抗体Nb003-01和Nb003-02与人BCMA具有较好的亲和力；dNb003-B双纳米抗体与人BCMA具有较好的亲和力，并且有高于单纳米抗体的趋势。

流式结果显示，Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-A-Fc、dNb003-B-Fc均未与K562发生特异性结合，但是均与BCMA阳性细胞系K562-BCMA、RPMI 8226发生了特异性结合(见图21)，证明了Nb003-01-Fc、Nb003-02-Fc、dNb003-A-Fc、dNb003-B-Fc是BCMA的特异性抗体。

表4SPR方法测定抗体亲和力的结果统计

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想，本领域技术人员还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.靶向BCMA的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括VHH01、VHH02；

优选地，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示；

更优选地，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8所示；

最优选地，所述VHH01的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

最优选地，所述VHH01的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15所示；

更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16所示；

最优选地，所述VHH02的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

更优选地，所述VHH02的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

2.基于单纳米抗体的靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含启动子；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含自断裂肽；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含检测标签/辅助功能元件；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含tEGFR信号肽；

更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8α、CD28、4-1BB、CD34、CD3ε、PD-1、IgG1、IgG4、OX40、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d；

更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8α、CD28、CD34、4-1BB、OX40、CD3ε、IgG1、IgG4、PD-1、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD16、CD22、CD33、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM-CSF；

更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB(CD137)、CD19、CD4、CD27、CD28、ICOS(CD278)、CD8α、CD8β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226；

更优选地，所述启动子包括：EF1α启动子、CMV启动子、EFS启动子、CAG启动子、CBh启动子、SFFV启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子；

更优选地，所述自断裂肽包括：T2A、P2A、E2A、F2A；

更优选地，所述检测标签/辅助功能元件包括：tEGFR、tCD34、tCD19、tCD20、tCD22、免疫检查点抑制剂(CTLA-4、PD-1/PD-L1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD226、CD155、CD47、B7-H3、B7-H4)纳米抗体、细胞因子及其受体(IL2、IL2受体、IL7、IL7受体、IL15、IL15受体)；

最优选地，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；

最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；

最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；

最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；

最优选地，所述启动子为EF1α；

最优选地，所述自断裂肽为T2A；

最优选地，所述检测标签/辅助功能元件为tEGFR；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH01、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到。

3.基于双纳米抗体的靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种和其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体；

优选地，所述其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体为VHH02；

更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15所示；

更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16所示；

最优选地，所述VHH02的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

最优选地，所述VHH02的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含启动子；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含自断裂肽；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含检测标签/辅助功能元件；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含tEGFR信号肽；

更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8α、CD28、4-1BB、CD34、CD3ε、PD-1、IgG1、IgG4、OX40、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d；

更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8α、CD28、CD34、4-1BB、OX40、CD3ε、IgG1、IgG4、PD-1、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD16、CD22、CD33、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM-CSF；

更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB(CD137)、CD19、CD4、CD27、CD28、ICOS(CD278)、CD8α、CD8β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226；

更优选地，所述启动子包括：EF1α启动子、CMV启动子、EFS启动子、CAG启动子、CBh启动子、SFFV启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子；

更优选地，所述自断裂肽包括：T2A、P2A、E2A、F2A；

更优选地，所述检测标签/辅助功能元件包括：tEGFR、tCD34、tCD19、tCD20、tCD22、免疫检查点抑制剂(CTLA-4、PD-1/PD-L1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD226、CD155、CD47、B7-H3、B7-H4)纳米抗体、细胞因子及其受体(IL2、IL2受体、IL7、IL7受体、IL15、IL15受体)；

最优选地，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；

最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；

最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；

最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；

最优选地，所述启动子为EF1α；

最优选地，所述自断裂肽为T2A；

最优选地，所述检测标签/辅助功能元件为tEGFR；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种、Linker、其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体、Linker、权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH01、Linker、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH02、Linker、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；

最优选地，所述Linker为(G4S)₅。

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列；

优选地，权利要求1所述的纳米抗体中的VHH01的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；

优选地，权利要求1所述的纳米抗体中的VHH02的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中CD8α跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中tEGFR信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；

优选地，权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体中tEGFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。

5.一种包含权利要求4所述核酸分子的表达载体；

优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、病毒来源的载体；

更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。

6.一种经工程改造的宿主细胞，其特征在于，所述经工程改造的宿主细胞包含权利要求5所述的表达载体；

优选地，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞；

更优选地，所述宿主细胞为免疫细胞；

最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；

最优选地，所述免疫细胞为T细胞。

7.一种免疫偶联物或一种用于检测BCMA蛋白的试剂，其特征在于，所述免疫偶联物含有权利要求1所述的纳米抗体和与其偶联的偶联物；

优选地，所述偶联物包括可检测标记物、放射性核素、细胞因子、治疗剂、细胞毒素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合；

更优选地，所述可检测标记物包括荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂；

更优选地，所述放射性核素包括¹³¹I、³²P、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、²²³Ra、¹²⁵I、¹⁰³Pd；

更优选地，所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、TNF-α、G-CSF、M-CSF；

更优选地，所述治疗剂包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂；

最优选地，所述烷化剂包括双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、溴丙哌嗪、松龙苯芥、磷雌氮芥、环磷酰胺、六甲密胺、异磷酰胺、福替目丁、三胺硫磷、卡氮芥、链唑霉素、英丙舒凡、氮烯咪胺、顺铂、奥沙利铂、卡铂；

最优选地，所述抗代谢物包括甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶、氟苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、克拉屈滨、脱氧柯福霉素、喷司他丁；

最优选地，所述抗肿瘤抗生素包括柔红霉素、阿霉素、去甲氧正定霉素、光神霉素、丝裂霉素C、戊柔比星、盐酸米托蒽醌、博来霉素、更生霉素、光辉霉素、甲基苄肼；

最优选地，所述有丝分裂抑制剂包括紫杉萜、长春碱、紫杉醇、长春新碱、长春酰胺、长春瑞滨；

最优选地，所述染色质功能抑制剂包括依立替康、依托扑沙、托泊替康、磷酸依托扑沙、鬼臼噻吩甙；

最优选地，所述抗血管生成剂包括普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、丙亚胺、马马司他、巴马司他、CGS-27023A、溴氯哌喹酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺；

最优选地，所述抗雌激素包括托瑞米芬、雷洛昔芬、它莫西芬、阿纳托唑、来曲唑、屈洛昔芬、奥多昔芬、依西美坦；

最优选地，所述抗雄激素包括尼鲁米特、比卡鲁胺、安体舒通、氟他米特、非那司提、醋酸环丙氯地孕酮、西咪替丁；

最优选地，所述免疫调节剂包括白介素、肿瘤坏死因子、干扰素、蘑菇多糖、西佐糖、罗喹美克、匹多莫特、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脱氨酶、胸腺肽制剂；

更优选地，所述细胞毒素包括MMAE、DM1、Ozogamicin、Dxd、SN-38、MMAF、PBD、DM2、Amanitin、DM4、PNU-159682、IR700、PE-38、PE24、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40；

优选地，所述用于检测BCMA蛋白的试剂包含权利要求1所述的纳米抗体或所述的免疫偶联物；

更优选地，所述试剂还包含与所述纳米抗体或免疫偶联物偶联的诊断剂；

最优选地，所述诊断剂包括放射性核素、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶、光敏诊断剂；

最优选地，所述放射性核素包括¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵⁵Co、⁷²As；

最优选地，所述化学发光剂包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯；

最优选地，所述生物发光剂包括荧光素、荧光素酶、水母发光蛋白；

最优选地，所述顺磁性离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)；

最优选地，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶；

最优选地，所述光敏诊断剂包括二羟基硅酞菁、亚甲基蓝、原卟啉、血卟啉、光卟啉。

8.一种药物组合物或一种试剂盒，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的纳米抗体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞和/或权利要求7中所述的免疫偶联物；

优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学或生理学上可接受的载体和/或辅料；

优选地，所述药物组合物用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病；

更优选地，所述BCMA阳性相关疾病包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌；

优选地，所述试剂盒包含权利要求1所述的纳米抗体、权利要求7中所述的免疫偶联物或试剂；

更优选地，所述试剂盒用于检测BCMA蛋白。

9.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)一种产生权利要求1所述的纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞，从而获得含有所述纳米抗体的培养物；

(b)从步骤(a)得到的培养物中分离或回收所述纳米抗体；

(c)纯化步骤(b)得到的纳米抗体得到权利要求1所述的纳米抗体；

(2)一种制备权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体引入到宿主细胞中；

优选地，所述引入的方法包括脂质转染法、微注射、电穿孔、DNA载体、RNA载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；

优选地，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞；

更优选地，所述宿主细胞为免疫细胞；

最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；

最优选地，所述免疫细胞为T细胞；

(3)一种非诊断目的地检测BCMA蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1所述的纳米抗体和/或权利要求7中所述的免疫偶联物或试剂接触，检测抗体-抗原复合物的存在。

10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：

(1)权利要求1所述的纳米抗体在非诊断目的地检测BCMA蛋白中的应用；

(2)权利要求1所述的纳米抗体在制备用于检测BCMA蛋白的试剂或试剂盒中的应用；

(3)权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体在制备用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的经工程改造的宿主细胞中的应用；

(4)权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的免疫偶联物中的应用；

(5)权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞或权利要求7中所述的免疫偶联物在制备用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的药物中的应用；

(6)权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7中所述的免疫偶联物或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防BCMA阳性相关疾病的生物制剂中的应用；

优选地，所述BCMA阳性相关疾病包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌。

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