CN115944778A - 一种可注射骨修复凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种可注射骨修复凝胶及其制备方法和应用。本发明属于生物材料领域。本发明的目的是为了解决现有目前水凝胶存在流变性不可控的技术问题。本发明的方法：先将多肽溶于水，得到肽溶液；然后将ZnCl2和硼酸溶于水，得到锌溶液；最后在36‑39℃下，将肽溶液和锌溶液等体积混合2‑4h，得到可注射骨修复凝胶。所述可注射骨修复凝胶具有流变性可控的网状结构。它作为骨组织修复材料在医药领域的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种可注射骨修复凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
研究表明，水产品中的蛋白质在有限的水解条件下，某些球状蛋白的有效疏水性可以通过暴露极性残基而增加，从而导致聚集物的形成。酶处理可以改善蛋白质的功能特性，改性效果与蛋白底物特性、酶特异性、水解度密切相关。酶处理的过程中，蛋白质的结构性质发生了明显的变化，这些结构性质的变化与改性工具酶的特异性有着密切的关系这正是改性蛋白质功能性质发生变化的根本原因。在控制性的酶解条件下，原本埋藏于球状分子内部的疏水性基团暴露出来，使蛋白质表面疏水性能提升，从而导致蛋白发生聚集，蛋白凝胶形成。而对多肽来说，组装过程是一个热力学自发的分子规整排列的过程，可自发形成，也可由引入的外源物质诱导发生，最终形成稳定组装体。多肽的组装可分为自发性组装及触发型组装，在组装体系中，有一种材料是通过分子间或分子内相互作用形成类似果冻的胶状物，称为水凝胶。水凝胶是由分子通过非共价键或者共价交联形成的三维网状结构，是一种包裹大量水的生物材料。多肽通过组装的方式形成凝胶，通常需要多种刺激，如体系的pH、外援引入的氧化还原剂使肽发生交联或利用金属离子进行诱导等，这类物质的加入使凝胶形成条件偏离生理条件，限制了肽组装凝胶的应用。
多肽分子的有效组装是其分子内部各种作用力相互影响的结果，多肽进行组装的驱动力主要是一些非共价键作用力，这一过程的推动力为非共价相互作用，包括分子间及分子内氢键(含羟基羧基较多的极性氨基酸)、静电力(酸性氨基酸及碱性氨基酸)、疏水相互作用(疏水性氨基酸)、范德华力及π-π共轭效应(芳香族氨基酸)等。这些非共价键作用力虽然十分微弱，但多肽小分子依靠其氨基酸含量及排序方式的不同，仍能通过自身实现有效的组装。在上述相互作用推动下，几种非共价作用力相互协调，达到平衡时，便形成特殊而有序的纳米结构，肽分子可形成多种形貌的自组装结构，如片状纳米结构、带状纳米结构、管状纳米结构、短棒状纳米结构、管状纳米结构等。其中长径比较大的形貌如纤维状纳米结构、带状纳米结构等，在其密度足够高时，可支撑体系形成多肽水凝胶。
对于一些慢性骨疾病患者的骨内假体植入术后往往会导致骨整合不良，这主要是由于植入物引发的炎细胞因子的增加导致骨吸收，损害骨形成。水凝胶具有生物相容性和柔软性。人们已经尝试开发用于组织工程应用的水凝胶，然而目前水凝胶仍存在流变性不可控等问题亟待解决。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种可注射骨修复凝胶及其制备方法和应用。
本发明的目的之一是提供一种可注射骨修复凝胶的制备方法，所述可注射骨修复凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1：将多肽溶于水，得到肽溶液；
S2：将ZnCl2和硼酸溶于水，得到锌溶液；
S3：在36-39℃下，将肽溶液和锌溶液等体积混合2-4h，得到可注射骨修复凝胶。
作为本发明的一种优选方案，其中：S1中多肽为海洋蛋白源多肽。
作为本发明的一种优选方案，其中：S1中肽溶液的浓度为15-20mM。
作为本发明的更进一步优选的方案，其中：S1中肽溶液的浓度为18mM。
作为本发明的一种优选方案，其中：S2中锌溶液中ZnCl2的浓度为15-20mM，且ZnCl2与多肽摩尔比为1:1。
作为本发明的更进一步优选的方案，其中：S2中锌溶液中ZnCl2的浓度为18mM。
作为本发明的一种优选方案，其中：S2中锌溶液中硼酸的浓度为230-270mM。
本发明的目的之二是提供一种上述方法制备得到的可注射骨修复凝胶。
作为本发明的一种优选方案，其中：所述可注射骨修复凝胶具有流变性可控的网状结构。
本发明的目的之三是提供一种上述方法制备得到的可注射骨修复凝胶作为骨组织修复材料在医药领域的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明首次对多肽进行水凝胶流变性能的调控，使其在特定温度与特定离子强度的条件下，制备出不同形貌、不同流变特性的多肽水凝胶。
(2)本发明使用的组分来源安全无毒，首次将凝胶用于体外骨损伤模型的修复中，为天然食品源物质在生物医学修复领域的应用拓宽思路。
附图说明
图1为实施例1以及对比例1-3所得样品小瓶倒置图；其中a-对比例1，b-实施例1，c-对比例2，d-对比例3；
图2为实施例1的凝胶的透射电子显微镜负染图(TEM)；
图3为对比例1的凝胶的透射电子显微镜负染图(TEM)；
图4为对比例2的凝胶的透射电子显微镜负染图(TEM)；
图5为对比例3的凝胶的透射电子显微镜负染图(TEM)；
图6为实施例1以及对比例1-3所得样品粘度随剪切速率的变化图；
图7为实施例1的凝胶的1HNMR的信号；
图8为对比例1的凝胶的1HNMR的信号；
图9为对比例2的凝胶的1HNMR的信号；
图10为对比例3的凝胶的1HNMR的信号；
图11为实施例1的凝胶的MicroCT三维及二维扫描图；
图12为对比例1的凝胶的MicroCT三维及二维扫描图；
图13为对比例2的凝胶的MicroCT三维及二维扫描图；
图14为对比例3的凝胶的MicroCT三维及二维扫描图；
图15为实施例1的凝胶的胫骨H&E染色切片图；
图16为对比例1的凝胶的胫骨H&E染色切片图；
图17为对比例2的凝胶的胫骨H&E染色切片图；
图18为对比例3的凝胶的胫骨H&E染色切片图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
下述实施例中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
下述实施例中所使用的多肽P-2-CG来源参见CN111387508A。
实施例1：一种可注射骨修复凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1：将多肽P-2-CG溶于pH＝7.0的水中，得到浓度为18mM的肽溶液；
S2：将ZnCl2和硼酸溶于水，得到ZnCl2浓度为18mM、硼酸浓度为250mM的锌溶液；
S3：在37℃下，将S1得到的肽溶液和S2得到的锌溶液等体积混合2h，得到可注射骨修复凝胶。
将装有样品的小瓶倒置，如图1所示，观察凝胶形成，倒置完全不脱落。
对比例1：一种多肽水凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1：将多肽P-2-CG溶于pH＝7.0的水中，得到浓度为18mM的肽溶液；
S2：将ZnCl2和硼酸溶于水，得到ZnCl2浓度为18mM、硼酸浓度为250mM的锌溶液；
S3：在20℃下，将S1得到的肽溶液和S2得到的锌溶液等体积混合2h，得到多肽水凝胶。
将装有样品的小瓶倒置，如图1所示，观察凝胶形成，倒置不脱落，但凝胶澄清度较低，出现白色析出物质。
对比例2：一种多肽水凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1：将多肽P-2-CG溶于pH＝7.0的水中，得到浓度为18mM的肽溶液；
S2：将ZnCl2和硼酸溶于水，得到ZnCl2浓度为18mM、硼酸浓度为250mM的锌溶液；
S3：在60℃下，将S1得到的肽溶液和S2得到的锌溶液等体积混合2h，得到多肽水凝胶。
将装有样品的小瓶倒置，如图1所示，观察凝胶未形成，倒置液体洒落。
对比例3：一种多肽水凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1：将多肽P-2-CG溶于pH＝7.0的水中，得到浓度为18mM的肽溶液；
S2：将ZnCl2和硼酸溶于水，得到ZnCl2浓度为18mM、硼酸浓度为250mM的锌溶液；
S3：在90℃下，将S1得到的肽溶液和S2得到的锌溶液等体积混合2h，得到多肽水凝胶。
将装有样品的小瓶倒置，如图1所示，观察凝胶未形成，倒置液体完全洒落。
检测试验
(一)取实施例1以及对比例1-3的样品，使用透射电子显微镜进行外观形貌的分析：取10μL所述待测试样滴落在附有超薄碳膜的铜网上，5分钟后用滤纸吸干；滴落10μL醋酸双氧铀(2％)于铜网上并保持5分钟后用滤纸吸干；放置在透射电子显微镜上，使用80kV的电压观测样品形貌。在不同的区域观察相同的样本，以避免实验误差，结果分别如图2、图3、图4、图5所示。图2的透射电镜视野下可见凝胶纤维在电镜观察下的网络结构，呈长细丝状的接枝交联态、接枝度高。图3的透射电镜视野下呈现较厚的凝胶结构，更多的活性成分被束缚进凝胶结构中，对比例1在应用于体外修复时活性成分的释放缓慢。图4、图5的透射电镜视野下的样品失去特征水凝胶的微观结构，网络结构消失，均呈现团簇状聚集体或聚集颗粒。
(二)取实施例1以及对比例1-3的样品使用DiscoveryHR-1流变仪测定样品的流变性质。使用动态应变扫描。测定条件为剪切速率为1-100s-1，测定温度为25℃。结果如图6所示，实施例1制备的水凝胶在粘度-剪切速率的曲线中呈斜率较小的趋势，粘度适度，对比例1的样品曲线过小，粘度过大，对比例2、对比例3的样品曲线基本贴近于横轴，斜率较小，基本无粘度。
(三)取实施例1以及对比例1-3的样品，利用BrukerAVANCEIII500MHz核磁共振谱仪在298K的温度条件下，样品溶于500μL含有10％氘代水的PBS缓冲溶液中，通过收集和分析1D1HNMR图谱，对样品主链和侧链的1H和13C化学位移进行了归属分析，数据用Topspin(Bruker)软件及NMRPipe软件进行去除溶剂峰及相位校正处理，结果分别如图7、图8、图9、图10所示。实施例1的样品在高场区的峰信号出现，且信号明显多于对比例2、对比例3，如图9-10所示，在60℃制备水凝胶时，高场区的峰信号逐渐降低，90℃制备的样品高场区的峰信号基本消失。说明水凝胶受温度响应性很强，且维持水凝胶形貌的主要作用力为氢键。
应用例：实施例1以及对比例1-3的样品作为骨组织修复材料的应用，具体过程如下：
将10周龄的雌性SD大鼠(体重200g)腹腔注射麻醉后，在右侧后腿胫骨上，用牙科空心钻钻深度4mm的孔，钻孔内径为3mm，外径为4mm，将钻下的骨块简单清洗后，分别在实施例1以及对比例1-3的水凝胶中浸泡10min，随后将其回填至孔洞中，逐层缝合，术后不限活动，正常饲养。
在第28天取出大鼠胫骨进行MicroCT成像，对经空心钻钻孔附近局部的胫骨部分进行3D模型重构后，对其正视图、俯视图及左视图的形貌进行分析，如图11所示，实施例1骨结构完整，说明受损的部位在实施例1水凝胶的作用下恢复良好，骨创伤完全愈合。图12，13，14中对比例1、对比例2和对比例3的3D模型均可见明显的骨受损痕迹，相比于实施例2骨愈合效果较差。
将MicroCT拍摄结束的胫骨分别剔除肌肉组织脱钙处理后进行H&E染色，并采用光学显微镜观察，图15、16、17、18中的虚线部分为空心钻钻孔内径钻取的骨芯外周区域，虚线外侧表示受损胫骨在样品处的骨生长情况，如图15所示，实施例1虚线外侧的骨组织密度均一，生长情况最优，图16、17、18中对比例1，对比例2和对比例3虚线外侧的骨组织密度分布不均，存在一定的空隙区域(骨组织未生长完全的区域)。说明实施例1对体外骨损伤的愈合具有明显的促进效果，其形成的水凝胶具有促进骨组织生长的活性。
综上可知，实施例1在37℃制备的水凝胶最粘稠、流动性能较差，且凝胶制备温度接近于大鼠最适的生命活动温度，对骨的生长起到了明显的促进作用，其凝胶组织的微观结构呈现长细丝状紧密的接枝交联态，有益于内部活性物质的释放，更利于受损面骨细胞的粘附与生长。而对比例1中呈现的更厚的凝胶不利于其内部活性物质的缓释；对比例2，对比例3凝胶未形成，其透射电镜结构呈现团簇状聚集体，在骨受损处流动性强；可见，对比例1，对比例2和对比例3对骨创伤修复的效果较差。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种可注射骨修复凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1：将多肽溶于水，得到肽溶液；
S2：将ZnCl2和硼酸溶于水，得到锌溶液；
S3：在36-39℃下，将肽溶液和锌溶液等体积混合2-4h，得到可注射骨修复凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中多肽为海洋蛋白源多肽。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中肽溶液的浓度为15-20mM。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1中肽溶液的浓度为18mM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中锌溶液中ZnCl2的浓度为15-20mM，且ZnCl2与多肽摩尔比为1:1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S2中锌溶液中ZnCl2的浓度为18mM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中锌溶液中硼酸的浓度为230-270mM。
8.权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的可注射骨修复凝胶。
9.根据权利要求8所述的可注射骨修复凝胶，其特征在于，它具有流变性可控的网状结构。
10.权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的可注射骨修复凝胶作为骨组织修复材料应用于医药领域。
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2023
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