CN115944712A - 用于退化椎间盘再生的包含生长因子、软骨素和葡糖胺的组合物及方法 - Google Patents

用于退化椎间盘再生的包含生长因子、软骨素和葡糖胺的组合物及方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于退化椎间盘再生的包含生长因子、软骨素和葡糖胺的组合物及方法。具体地，公开了包含软骨素、葡糖胺、结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子β1(TGFβ1)和WISP‑2的组合的组合物。描述了与缓解从一个身体区域(优选地脊柱或关节)中所发出的患者疼痛的组合物、方法、使用和系统。描述了用于治疗或预防选自椎间盘退行性疾病、椎间盘损伤、疼痛、关节炎、或疑似关节炎的疾病或病症的方法。

Description

用于退化椎间盘再生的包含生长因子、软骨素和葡糖胺的组合物及方法
本申请是与母案发明名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201680077659.4，国际申请号是PCT/CA2016/051291，申请日是2016年11月4日。
相关申请
本申请要求于2015年11月6日提交的美国专利申请第62/252,234号的优先权。
技术领域
本发明总体上涉及椎间盘退化，更具体地涉及用于治疗或预防椎间盘退化的方法、抑制剂、使用和系统。
背景技术
椎间盘退行性疾病(DDD)是发生下腰痛的主要促成因素(～40％)并且是世界范围内导致残疾的主要原因，从而给社会带来了巨大的社会经济负担和临床治疗费用1、2。健康的椎间盘(IVD)是由被同心纤维环(AF)包围且经由薄软骨终板而附着到相邻椎骨的中枢性富含蛋白聚糖的髓核(NP)所组成。在人体中，在儿童期存在于髓核(NP)中的大的空泡化脊索细胞(NC)逐渐地被小的软骨样细胞(CLC)所替代直到青年早期3-5。重要地，在人体中在脊索细胞的损失与椎间盘退行性疾病的发病之间存在着时序关系，其中髓核的退化常常导致椎间盘功能的下降、负重能力的下降、相关的疼痛和残疾3-5。目前，尚没有能够改善该退化过程或者可以促进修复的干预措施。实际上，外科手术(如脊柱融合)会加快相邻节段的退化6-8。因此，微创再生疗法的开发是椎间盘修复的一个有吸引力的替代方法9-15。
不同于人类，非软骨营养不良性犬(NCD)将脊索细胞保持在它们的髓核内，并且相对地对椎间盘退行性疾病具有抗性16、17。从非软骨营养不良性犬(NCD)髓核中获得的脊索细胞来源条件培养液(NCCM)给髓核细胞赋予合成代谢特性18-20。类似地，其他的研究已证明在体外用脊索细胞来源条件培养液(NCCM)进行处理的髓核细胞中有增加的蛋白聚糖合成和细胞增殖21-24。迄今为止在进行NCCM处理时的明显有利效果的原因尚未明朗，然而作为处理剂的NCCM本身具有一些缺点，特别是包括混合物的不均匀性。
因此，对于椎间盘退化的改进治疗方法存在着需求。
发明内容
总体上讲，在一个方面提供一种组合物；该组合物包含：以约0.1％至约2.0重量％的含量而存在的硫酸软骨素；以约1％至约25重量％的含量而存在的盐酸葡糖胺；以约50ng/mg组合物至约500ng/mg组合物的浓度而存在的结缔组织生长因子；以约10ng/mg组合物至约100ng/mg组合物的浓度而存在的转化生长因子β1；任选地，以约0％至约25重量％的含量而存在的右旋葡萄糖；任选地，以约0重量％至约0.5重量％的含量而存在的羧甲基纤维素；及包含水及任选地药学上可接受载体、缓冲剂和/或任选地二甲基亚砜的水溶液，所述水溶液的总含量等于所述组合物剩余部分的重量。
总体上讲，在一个方面提供一种组合物；该组合物包含软骨素、葡糖胺、及选自结缔组织生长因子、WISP-2、和转化生长因子β1的一个因子，或它们的药学上可接受盐。在一个方面，该组合物包含软骨素、葡糖胺、及结缔组织生长因子和转化生长因子β1中的任一个或两个因子；或它们的药学上可接受盐。各实施方案可包含下列中的一个或多个。该组合物还包含水。该组合物还包含右旋葡萄糖或其药学上可接受盐。该组合物还含足以使组合物的pH稳定在约6和约7之间的量的缓冲剂。软骨素是硫酸软骨素。硫酸软骨素是以约0.5％至约2.0％的含量而存在。硫酸软骨素是以约0.1％至约0.5％的含量而存在。葡糖胺是盐酸葡糖胺。盐酸葡糖胺是以约5％至约20％的含量而存在。盐酸葡糖胺是以约1％至约5％的含量、优选地以约1.0％至约1.5重量％的含量而存在。该组合物也包含麻醉剂。麻醉剂是布比卡因。右旋葡萄糖是以高达约25重量％的含量而存在。右旋葡萄糖是以约1％至约2重量％的含量而存在。右旋葡萄糖是以约1.0％至约1.5重量％的含量而存在。结缔组织生长因子(CTGF)是以至少约50ng/mL的浓度而存在。CTGF是以至少约100ng/mL的浓度而存在。CTGF是以至少约200ng/mL的浓度而存在。CTGF是以在约50和约500ng/mL之间的浓度而存在。转化生长因子β1(TGFβ1)是以至少约1ng/mL的浓度而存在。TGFβ1是以至少约5ng/mL的浓度而存在。TGFβ1是以至少约10ng/mL的浓度而存在。TGFβ1是以在约1和约100ng/mL之间的浓度而存在。该组合物还包含药学上可接受的载体。该组合物还包含二甲基亚砜。该组合物还包含羧甲基纤维素。该组合物还包含透明质酸。
总体上讲，在一个方面提供一种组合物；该组合物包含至少一种糖胺聚糖或者其衍生物或前体、及结缔组织生长因子、和转化生长因子β1；或它们的药学上可接受盐。各实施方案可包括下列中的一个或多个。葡糖胺聚糖是软骨素。葡糖胺聚糖是葡糖胺。
总体上讲，在一个方面提供一种缓减患者源于椎间盘的疼痛的方法；该方法包括将治疗有效量的上述组合物中的一个组合物注射入椎间盘或者注射入相邻的椎间盘中。各实施方案可包括下列中的一个或多个。该椎间盘已发生退化。该椎间盘以前已受到过损伤。
总体上讲，在一个方面提供一种治疗患者中的椎间盘退行性疾病(DDD)或椎间盘损伤的方法；该方法包括将治疗有效量的上述组合物中的一个组合物注射入椎间盘或者注射入相邻的椎间盘中。
总体上讲，在一个方面提供一种治疗在患者的一个身体区域中的疼痛、关节炎、或疑似关节炎的方法；该方法包括将治疗有效量的上述组合物中一个组合物注射入该身体区域。各实施方案可包括下列中的一个或多个：该身体区域是脊柱；该身体区域是腿部；该身体区域是关节；该身体区域是膝；该身体区域是肩；该身体区域是臂；该身体区域是肘；或者该身体区域是腕。
具体地，本发明提供了以下方案：
1.一种组合物，包含：
以约0.1重量％至约2.0重量％的含量存在的硫酸软骨素；
以约1重量％至约25重量％的含量存在的盐酸葡糖胺；
以约50ng/mg至约500ng/mg组合物的浓度存在的结缔组织生长因子；
以约10ng/mg至约100ng/mg组合物的浓度存在的转化生长因子β1；
任选地，以约0重量％至约25重量％的含量存在的右旋葡萄糖；
任选地，以约0％重量至约0.5重量％的含量存在的羧甲基纤维素；和
包含水及任选地药学上可接受载体、缓冲剂和/或二甲基亚砜的水溶液，所述水溶液的总含量基于重量等于所述组合物的剩余部分。
2.一种组合物，包含软骨素、葡糖胺、及选自结缔组织生长因子、WISP-2、和转化生长因子β1的因子；或者它们的药学上可接受盐。
3.根据实施方案2所述的组合物，其中所述组合物包含结缔组织生长因子和转化生长因子β1中的任一个或两个；或者它们的药学上可接受盐。
4.根据实施方案3所述的组合物，进一步包含水。
5.根据实施方案4所述的组合物，进一步包含右旋葡萄糖或其药学上可接受盐。
6.根据实施方案4所述的组合物，进一步包含足以使所述组合物的pH值稳定在约6和约7之间的量的缓冲剂。
7.根据实施方案4所述的组合物，其中所述软骨素是硫酸软骨素。
8.根据实施方案7所述的组合物，其中所述硫酸软骨素是以所述组合物的约0.5重量％至约2.0重量％的含量存在。
9.根据实施方案7所述的组合物，其中所述硫酸软骨素是以所述组合物的约0.1重量％至约0.5重量％的含量存在。
10.根据实施方案4所述的组合物，其中所述葡糖胺是盐酸葡糖胺。
11.根据实施方案10所述的组合物，其中所述盐酸葡糖胺是以所述组合物的约5重量％至约20重量％的含量存在。
12.根据实施方案10所述的组合物，其中所述盐酸葡糖胺是以所述组合物的约1重量％至约5重量％的含量、优选地以约1.0重量％至约1.5重量％的含量存在。
13.根据实施方案4所述的组合物，进一步包含麻醉剂。
14.根据实施方案13所述的组合物，其中所述麻醉剂是布比卡因。
15.根据实施方案5所述的组合物，其中所述右旋葡萄糖是以所述组合物的高达约25重量％的含量、优选地以约1重量％至约2重量％的含量、更优选地以约1.0重量％至约1.5重量％的含量存在。
16.根据实施方案4所述的组合物，其中所述结缔组织生长因子是以至少约50ng/mL组合物的浓度而存在。
17.根据实施方案4所述的组合物，其中所述结缔组织生长因子是以至少约100ng/mL组合物的浓度而存在。
18.根据实施方案4所述的组合物，其中所述结缔组织生长因子是以至少约200ng/mL组合物的浓度而存在。
19.根据实施方案4所述的组合物，其中所述结缔组织生长因子是以约50ng/mL组合物至约500ng/mL组合物的浓度而存在。
20.根据实施方案4所述的组合物，其中所述转化生长因子β1是以至少约1ng/mL组合物的浓度而存在。
21.根据实施方案4所述的组合物，其中所述转化生长因子β1是以至少约5ng/mL组合物的浓度而存在。
22.根据实施方案4所述的组合物，其中所述转化生长因子β1是以至少约10ng/mL组合物的浓度而存在。
23.根据实施方案4所述的组合物，其中所述转化生长因子β1是以约1ng/mL组合物至约100ng/mL组合物的浓度而存在。
24.根据实施方案4所述的组合物，进一步包含药学上可接受载体和任选地二甲基亚砜。
25.根据实施方案24所述的组合物，其中所述药学上可接受载体包括羧甲基纤维素。
26.根据实施方案24所述的组合物，其中所述药学上可接受载体包括透明质酸。
27.一种组合物，包含：至少一种糖胺聚糖或者其衍生物或前体、优选地软骨素和/或葡糖胺、和结缔组织生长因子、和转化生长因子β；或者它们的药学上可接受盐。
28.一种减缓患者中来源于椎间盘的疼痛的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据实施方案1-27中任一项所述的组合物注射入所述椎间盘中。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述椎间盘已发生退化。
30.根据实施方案28所述的方法，其中所述椎间盘以前已受到损伤。
31.一种治疗患者中的椎间盘退行性疾病或椎间盘损伤的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据实施方案1-27中任一项所述的组合物注射入所述椎间盘中。
32.一种治疗在患者的身体区域中的疼痛、关节炎、或疑似关节炎的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据实施方案1-27中任一项所述组合物注射入所述身体区域中。
33.根据实施方案32所述的方法，其中所述身体区域是脊柱。
34.根据实施方案32所述的方法，其中所述身体区域是关节。
35.根据实施方案32所述的方法，其中所述身体区域是膝。
36.根据实施方案32所述的方法，其中所述身体区域是肩。
37.根据实施方案32所述的方法，其中所述身体区域是腕。
38.根据实施方案32所述的方法，其中所述身体区域是肘。
在此方面，在详细说明本发明的至少一个实施方式之前，应当理解的是本发明在其应用(application)上并不局限于在以下描述中所陈述或在各附图中所图示的结构的细节和各组分的布置。本发明可以具有其他实施方式并且可以以各种方式而实施和完成。另外，应当理解的是，本文中所使用的用语和术语是为了描述的目的，而不应被看作是限制性的。
附图说明
在各附图中通过举例对本发明的各实施方式加以说明。应当明确理解的是，描述和附图只是为了说明的目的并且是作为对理解的帮助，而并非意图用作对本发明的限制的定义。
现在将参照附图仅通过举例对各实施方式进行描述，在附图中：
图1示出了大鼠尾椎间盘中的针刺损伤导致纤维软骨基质的发育及髓核(NP)中脊索细胞(NC)和干细胞的损失。(a)大鼠尾椎间盘髓核中的荧光影像引导针刺损伤。(b)组织学分析(H&E)和番红O染色显示在损伤后10周的时段内在大鼠髓核中纤维软骨基质的发育。免疫组织化学表明细胞外基质蛋白、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白2以时间依赖性方式损失(健康到损伤后第10周，比例尺50μ)。(c)蛋白质印迹法表明在损伤后大鼠髓核组织裂解液中促炎性细胞因子(IL-1β和TNFα)、炎症介质、Cox2和细胞外基质蛋白(MMP-3、MMP-13、TIMP1、ADAMTS4)的表达以时间依赖性方式而改变。(d)对在从大鼠尾受损伤椎间盘髓核中所获得的组织裂解液中的磷酸化p42/44(Thr202/Tyr204)、总p42/44、磷酸化p38MAPK(Thr180/Tyr182)和总p38 MAPK的蛋白质印迹分析。(e)蛋白质印迹分析表明在10周的时间段内在从大鼠尾受损伤椎间盘中所获得髓核中的脊索细胞标志物(鼠短尾突变体表型、半乳糖凝集素3)和干细胞标记物物(Oct4、Nanog)的损失。在蛋白质印迹法中将β-肌动蛋白用作内参照。免疫荧光法验证了与健康的对照椎间盘髓核(比例尺10μ)相比在大鼠尾受损伤椎间盘髓核中(f)核鼠短尾突变体表型(brachyury)、(g)半乳糖凝集素3(膜/细胞质)和核Oct4表达的减少。
图2表明IL-1β在椎间盘退行性疾病的髓核-细胞外基质退化中发挥作用。火山图描绘了与在细胞外基质基因阵列中的无处理对照(NTC)(n＝3，p<0.05)相比，在用(a)IL-1β单独地或者(b)IL-1β与TNFα的组合进行处理中细胞外基质基因的差异表达。(c)代表性的直方图表明在用IL-1β单独地或者连同TNFα处理达24小时的健康大鼠髓核细胞中细胞外基质基因的显著的差异表达(p<0.05)。(d)蛋白质印迹法表明在从健康鼠椎间盘髓核中所获得髓核细胞中IL-1β和TNFα减少胶原蛋白2，但诱导基质金属蛋白酶类(MMP-3、MMP-13)和炎症介质Cox-2的表达。(e)对在用IL-1β单独地或者连同TNFα进行处理达5-60分钟的健康大鼠髓核细胞中的磷酸化cRaf(Ser259)、磷酸化p42/44(Thr202/Tyr204)、总p42/44、磷酸化p38MAPK(Thr180/Tyr182)和总p38 MAPK的蛋白质印分析。对从在将p42/44(U0126)、p38MAPK(SB203580)、NFκB(BAY-11-7082)、PI3K(渥曼青霉素)、Jak1和STAT3(WP1066)作为标靶的特异性抑制剂存在下用(f)IL-1β单独地、(g)IL-1β与TNFα的组合进行处理的健康大鼠髓核细胞中所获得细胞裂解物中的MMP-3、MMP-13和Cox2的蛋白质印迹分析。(h)蛋白质印迹分析表明在SB203580、BAY-11-7082、Jak1和STAT3(WP1066)抑制剂存在下在人退化椎间盘髓核细胞中细胞因子诱导Cox2的表达减少。
图3表明脊索细胞来源条件培养液(NCCM)赋予使大鼠尾受损伤椎间盘髓核中的退化髓核的合成代谢和抗分解代谢特性。(a)番红O染色表明从正常的大量且大的脊索细胞、富含蛋白聚糖的细胞外基质到基本上没有被小髓核细胞替代的脊索细胞的改变。在用被用作对照的无蛋白质杂交瘤培养液或者脊索细胞来源条件培养液进行处理的大鼠尾受损伤椎间盘的石蜡包埋切片中的聚集蛋白聚糖、胶原蛋白2、鼠短尾突变体表型和Oct4的免疫组织化学(比例尺50μ)。(b)对在从大鼠尾受损伤椎间盘髓核和健康对照中所获得组织裂解液中的胶原蛋白2和干细胞标记物物Oct4和Nanog的蛋白质印迹分析。(c)利用质谱分析对脊索细胞来源条件培养液中的蛋白质进行鉴定的方法的示意图。(d)显示在脊索细胞来源条件培养液中被鉴定的细胞外基质蛋白类的分布的饼图。(e)显示在大鼠髓核(健康和受损伤的椎间盘)和人退化椎间盘髓核的石蜡包埋切片中的CTGF、WISP-2和TGFβ1的表达的免疫组织化学。
图4示出了在椎间盘退行性疾病的体外模型中CTGF、WISP-2和TGFβ1的合成代谢作用。(a)利用在从(a)大鼠尾(健康的/受损伤的)椎间盘(**p＝0.049，*p≤0.02)、(b)牛退化椎间盘髓核(*p<0.01)和(c)人(H1-H4)退化椎间盘髓核(*p<0.005)中所获得髓核细胞中的MTT检测所测定的、用CTGF、WISP-2和TGFβ1单独地或联合地进行处理对细胞存活率(72小时)的影响。各棒代表以一式三份所完成的3个独立试验(n＝9)的平均值+标准差。(d)用比色抗BrdU-ELISA法所测定的在用CTGF和TGFβ1单独地或者联合地进行处理的大鼠髓核细胞(健康的/受损伤的椎间盘)(*p<0.001，**p<0.01)及(e)人(H1、H2)退化椎间盘髓核(*p<0.001)中的细胞增殖检测(72小时)。就用CTGF、WISP-2或TGFβ1单独地或联合地进行处理相对于无处理对照(NTC)而言，p值是利用配对学生t检验而确定。(f)表明通过实时PCR分析所展示的在将人退化椎间盘髓核细胞用CTGF和TGFβ1进行处理中胶原蛋白2、HAPLN1、多能蛋白聚糖和血小板反应蛋白1的增加的表达的直方图。直方图中的各棒代表以一式两份完成的3个独立试验的平均值+标准差(n＝6，*p<0.001)。(g)验证了在用CTGF和TGFβ1进行处理后在人退化椎间盘髓核细胞中增加的胶原蛋白2表达的蛋白质印迹分析。
图5示出了在椎间盘退行性疾病的体外模型中CTGF、WISP-2和TGFβ1的抗分解代谢作用。(a)显示在从用促炎性细胞因子IL-1β和TNFα单独地或者在CTGF、WISP-2和TGFβ1的存在下进行处理的(a)大鼠受损伤椎间盘(*p＝0.008，**p＝0.05)、(b、c)人退化椎间盘髓核(*p<0.05)所得到的髓核细胞中半胱天冬酶3/7活性的直方图。显示在用促炎性细胞因子IL-1β和TNFα单独地或者在CTGF、WISP-2和TGFβ1存在下进行处理的(d)大鼠受损伤椎间盘、(e、f)人退化椎间盘髓核(*p<0.05，**p<0.005)的髓核细胞中的半胱天冬酶9活性的直方图。在半胱天冬酶检测中的各棒表示以一式四份完成的2个独立试验的平均值+标准差(n＝8)。p值是利用配对学生t检验而确定。IL-1β与TNFα的组合是相对于无处理对照(NTC)而言，同时包含生长因子(CTGF、WISP-2或TGFβ1)的各组的p值是相对于仅包含IL-1β与TNFα的组合的组而言。用(g)IL-1β单独地、(h)IL-1β与TNFα联合地且在CTGF、WISP-2或TGFβ1存在下进行处理的大鼠健康椎间盘髓核细胞中的MMP-3、MMP-13和Cox2的蛋白质印迹分析。显示与仅用IL-1β和TNFα进行的处理相比在CTGF和TGFβ1的存在下用IL-1β和TNFα处理的人退化椎间盘髓核细胞中(i)Cox2 mRNA、(j)MMP-13mRNA含量的表达减小的直方图。直方图中的各棒代表以一式两份完成的3个独立试验的平均值+标准差(n＝6，*p<0.001)。
图6示出了对在椎间盘退行性疾病的临床前体内啮齿动物椎间盘损伤模型中CTGF和TGFβ1的再生潜能的评估。(a)在用磷酸盐缓冲盐水(PBS，用作对照)、CTGF、TGFβ1或者CTGF与TGFβ1的组合进行处理的大鼠尾受损伤椎间盘髓核的石蜡包埋切片中细胞外基质蛋白、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白2的代表性番红O和免疫组织化学染色(比例尺50μ)。(b)表明在从用CTGF、TGFβ1或者CTGF与TGFβ1组合进行处理的大鼠尾受损伤椎间盘中所获得髓核组织裂解液中MMP-13和Cox2的表达减小以及脊索细胞标志物、鼠短尾突变体表型和干细胞标记物物Oct4的恢复的蛋白质印迹分析。(c)表明在促炎性细胞因子(IL-1β和TNFα)存在下进行性椎间盘退化的机制及由用于椎间盘髓核再生的潜在治疗剂(CTGF/TGFβ1)所产生的干预措施的效果的推荐模型。
图7示出了(a)对在从人退化椎间盘、牛退化椎间盘、非软骨营养不良性犬和健康大鼠椎间盘中所获得髓核的石蜡包埋切片中的鼠短尾突变体表型和Oct4蛋白的番红O染色和免疫组织化学分析(比例尺10μ)。箭头代表CLC、软骨样细胞和NC(脊索细胞)。(b)表明大鼠椎间盘髓核中时间依赖性方式(健康-损伤后10周)的组织学变化，其中用苏木精和伊红(H&E)染色显示脊索细胞损失、番红O(SafO)染色显示纤维软骨基质发育。
图8示出了对在尺寸排阻色谱之后所收集的含蛋白质流分(PF)的生物活性的评估。直方图显示在脊索细胞来源条件培养液或对照培养液(无血清、酚红和蛋白质的杂交瘤培养液)存在下用脊索细胞来源条件培养液、细胞毒药物依托泊甙(300μM，用作阳性对照)进行处理的牛髓核细胞中的(a)细胞存活率、(b)半胱天冬酶3/7活性。各棒代表以一式三份完成的2个独立试验(n＝6)的平均值+标准差。(c)显示在对照培养液(无血清、无酚红的杂交瘤培养液)中或者在含蛋白质流分(PF)存在下用依托泊甙进行处理的牛髓核细胞中半胱天冬酶3/7活性的直方图。各棒代表以一式三份完成的2个独立试验(n＝6)的平均值+标准差。对这些试验，将各含蛋白质流分(PF)与对照培养液(无血清、无酚红的杂交瘤培养液)混合(1:1)，并且与无处理对照(即，洗脱缓冲液+对照培养液(1:1))进行比较。
图9示出了在脊索细胞来源条件培养液(NCCM)的质谱分析中所观察的CTGF、WISP-2和TGFβ1的肽特征峰。
图10示出了利用MTT检测所确定的在从健康大鼠椎间盘中所获得的髓核细胞中用(a)CTGF、(b)WISP-2和(c)GFβ1单独地或者用(d)CTGF与WISP-2和TGFβ1的组合进行处理对细胞存活率的剂量(1ng/mL-100ng/mL)和时间依赖性(24小时-96小时)的影响。各棒代表以一式四份完成的3个独立试验的平均值+标准差(n＝12)。
图11示出了在48小时内从(a)大鼠(健康/受损伤的)椎间盘，*p≤0.02、(b)牛退化椎间盘，*p<0.01、和(c)人(H1-H4)退化髓核细胞(*p<0.005，**p＝0.02)中所获得的髓核细胞中利用MTT检测所确定的用CTGF、ISP-2和TGFβ1单独地或联合地进行处理对细胞存活率的影响。各棒代表以一式三份完成的3个独立试验的平均值+标准差(n＝9)。
图12示出了对在椎间盘退行性疾病的临床前体内啮齿动物椎间盘损伤模型中CTGF和TGFβ1单独地及联合DRS(包含盐酸葡糖胺和硫酸软骨素的溶液)的再生潜能的评估，示出了(a)在大鼠尾受损伤椎间盘髓核的石蜡包埋切片中细胞外基质蛋白类、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白2的番红O和免疫组织化学染色，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS，用作对照)(比例尺50μ)。(b)蛋白质印迹分析，其表明在从用CTGF、TGFβ1；CTGF和TGFβ1组合、DRS、DRS与CTGF的组合；或者DRS、CTGF和TGFβ1的组合进行处理的大鼠尾受损伤椎间盘中所获得的髓核组织裂解液中MMP-13和Cox2的减少的表达、及干细胞标记物Oct4的恢复。
图13示出了在大鼠尾椎间盘损伤模型中在损伤后第20周与PBS注射相比较的TGFβ1+CTGF+DRS的效果。PBS注射椎间盘显示纤维软骨退化变化，包括纤维环的磨损/撕裂、椎间盘高度的损失和髓核细胞类型的退行性改变。TGFβ1+CTGF+DRS注射的椎间盘(c)显示近似正常表现的表型以及富含细胞外基质、脊索样细胞、不变的椎间盘高度和健康纤维环的维持。
具体实施方式
通过参照附图对适用于实施本发明的方法、使用、系统和装置的实施方式进行描述。
在本公开的一个方面提供一种组合物，该组合物包含：在水溶液中的下列成分或者它们的药学上可接受盐；软骨素(优选地硫酸软骨素)、葡糖胺(优选地盐酸葡糖胺)、结缔组织生长因子(CTGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)中的一个或两个，并且任选地还包含右旋葡萄糖、羧甲基纤维素、二甲基亚砜、和/或透明质酸。
在本公开的一些方面，处理包括将治疗有效量的组合物向受试者进行给药，优选地在需要治疗的部位直接地注射。
本文中所使用的“治疗有效量”是指在剂量上和需要的时间段中可有效地获得所期望的治疗结果的量。所公开组合物的治疗有效量可根据例如该个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素，以及组合物在个体中引起期望的反应的能力而变化。治疗有效量也是其中治疗有利效果超过任何毒性或有害作用的量。
本文中所描述的治疗有效组合物合适地包含至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、或100ng/mL的TGFβ1，或者在约1至约100ng/mL范围内的TGFβ1。本文中所描述的治疗有效组合物合适地包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、或500ng/mL的CTGF，或者在约50至约500ng/mL范围内的CTGF。在使用1ng/mL的TGFβ1、优选地5ng/mL TGFβ1、更优选地10-100ng/mL的TGFB1的试验中并且在使用至少约50ng/mLCTGF的试验中看到治疗效果。
在本文中描述的组合物中所使用的化合物可以以由无机酸或有机酸所得到的药学上可接受盐的形式而使用。药学上可接受盐在本技术领域是公知的。为清楚起见，本文中所使用的术语“药学上可接受盐”通常是指由药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机酸和碱及有机酸和碱)所制备的盐。合适的药学上可接受的碱加成盐包括：由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌所制备的金属盐；或者由赖氨酸、N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因所制备的有机盐。合适的无毒酸包括无机酸和有机酸，如乙酸、海藻酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯基磺酸、甲酸、富马酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、羟乙基磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、硝酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、硫酸、酒石酸、和对甲苯磺酸。具体的无毒酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、和甲磺酸。因此，具体盐的例子包括盐酸盐和甲磺酸盐。其他的盐在本技术领域是公知的。参见例如《雷明登药学大全(Remington's PharmaceuticalSciences)》，第18版(Mack出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿：1990年)和《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》，第19版(Mack出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿：1995年)。在本文中描述的组合物中所使用的化合物的酸加成盐、羧酸盐、氨基酸加成盐、和两性离子盐的制备和使用也可被认为是药学上可接受的，如果它们是在可靠医学判断的范围内，适用于与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应；与合理的获益/风险比相称，并且对于它们的预期用途是有效的。
在一个实施方式中，提供一种包含CTGF和TGF-β1中的至少一个及一个细胞外基质成分的组合物。在一个实施方式中，所述至少一个细胞外基质成分包括糖胺聚糖或者其衍生物或前体。在一个实施方式中，糖胺聚糖或者其衍生物或前体包括软骨素。在一个实施方式中，糖胺聚糖或者其衍生物或前体包括葡糖胺。在一个实施方式中，该组合物包含软骨素和葡糖胺。在一个实施方式中，该组合物包含CTGF、TGF-β1、软骨素和葡糖胺。
在一个实施方式中，该组合物还包含至少一种糖。在一个实施方式中，该糖是纤维素衍生物。在一个实施方式中，该糖是羧甲基纤维素。在一个实施方式中，该糖是右旋葡萄糖。
在一个实施方式中，该组合物可包含另一个生长因子。在一个实施方式中，该另一个生长因子是WISP-2。
在一个方面，提供一种包含软骨素、葡糖胺、CTGF、和TGF-β1或者它们的药学上可接受盐的组合物。该组合物合适地还包含水和二甲基亚砜(DMSO)，其中基于组合物总重量DMSO高达15％、高达10％、或优选地小于约5％。在一个实施方式中，该组合物是盐水溶液。在一个实施方式中，该组合物还包含右旋葡萄糖或其药学上可接受盐。
在一个实施方式中，该组合物还包含以足以使该组合物稳定在期望pH值的量的缓冲剂。在一个实施方式中，使该组合物稳定在约6和约7之间的pH值。
在一个实施方式中，该组合物包含软骨素，优选地硫酸软骨素。
在一个实施方式中，软骨素(优选地硫酸软骨素)是以基于总组合物约0.1％至约2.0％、在一个实施方式中约0.1％至约1.0％、在另一个实施方式中0.5％至约2重量％的含量而存在。
在一个实施方式中，葡糖胺(优选地盐酸葡糖胺)是以基于总组合物约1％至约25％、在一个实施方式中约1％至约10％、在另一个实施方式中约5％至约25重量％的含量而存在。
在一个实施方式中，该组合物还包含麻醉剂，合适地布比卡因。
在一个实施方式中，该组合物还包含造影剂，在一个实施方式中是非离子型造影剂。
在一个实施方式中，右旋葡萄糖是以基于总组合物≤约25重量％的含量而存在。在一个实施方式中，右旋葡萄糖不存在。在一个实施方式中，右旋葡萄糖是以基于总组合物≤约5重量％的含量而存在。在另一个实施方式中，右旋葡萄糖是以基于总组合物在约1％和约2重量％之间的含量而存在。
CTGF合适地是以至少约50ng/mL组合物的浓度、在一个实施方式中至少约100ng/mL、在另一个实施方式中至少约200ng/mL、在一个实施方式中在约50和约500ng/mL之间的浓度而存在于该组合物中。
TGFβ1合适地以至少约1ng/mL组合物、在一个实施方式中至少约5ng/mL、在另一个实施方式中至少约10ng/mL、在另一个实施方式中在约1和约100ng/mL之间的浓度而存在于该组合物中。
在一个实施方式中提供一种组合物，该组合物包含、由下列组成或者基本上由下列组成：
以约0.1％至约2.0重量％的含量存在的硫酸软骨素；
以约1％至约25重量％的含量存在的盐酸葡糖胺；
以约50ng/mg至约500ng/mg组合物的浓度存在的结缔组织生长因子；
以约10ng/mg至约100ng/mg组合物的浓度存在的转化生长因子β1；
任选地，以约0重量％至约25重量％的含量存在的右旋葡萄糖；
任选地，以约0％至约0.5重量％的含量存在的羧甲基纤维素；及
包含水及任选地药学上可接受载体、缓冲剂和/或二甲基亚砜的水溶液，所述水溶液的总含量等于该组合物剩余部分的重量。
如在各实例中的说明，本文中所描述的组合物可合适地用于椎间盘退化或损伤的治疗。
在一个实施方式中，提供一种缓解患者中源于椎间盘的疼痛的方法；该方法包括将治疗有效量的本文中所描述的组合物注射入椎间盘中。椎间盘可以是退化的椎间盘和/或以前受损伤的椎间盘。
在一个实施方式中，提供一种治疗患者中的椎间盘退行性疾病或椎间盘损伤的方法；该方法包括将治疗有效量的本文中所描述的组合物注射入椎间盘中。
虽然在一个实施方式中对治疗的时间安排没有限制，但在一个实施方式中治疗是在损伤后的约10周内、在其他实施方式中在损伤后的4周内、在损伤后的2周内或者在损伤后的96小时内完成。
在一个实施方式中，提供一种治疗在患者的一个身体区域中的疼痛、关节炎、或疑似关节炎的方法；该方法包括将治疗有效量的本文中所描述的组合物注射入该身体区域中。该身体区域可以是但不限于脊柱或关节。根据本文中所描述的方法可合适地进行处理的其他身体区域是肩、腕或肘。
应当理解的是，在适当的情况下，治疗可包括预防性(prophylactic；preventative)治疗，包括对相邻身体区域(例如在脊柱的相邻椎间盘中)的治疗。
本领域技术人员将理解是，在不背离本发明范围的前提下，也可实施本文中所描述实施方式的其他变型。因此，其他修改也是可行的。
在本文中所鉴定的是由具有通过改变退化椎间盘的分解代谢状态而恢复健康髓核的能力的脊索细胞所分泌的因子(TGFβ1和CTGF)。在包括人类的多个物种中也表明：在退化椎间盘内TGFβ1和CTGF两者的损失与椎间盘退化的形成和进展是相关的。这些实例表明了使用TGFβ1与CTGF的组合在用于椎间盘退行性疾病的新型分子再生疗法中的效用(参见例如图4(e)、图5(i)、和图5(j))。此外，TGFβ1和CTGF与以前在美国专利8,048,865中所确认的治疗剂和其他制剂的组合也有额外的效用。在一个实施方式中，这些制剂包括软骨素、葡糖胺、和右旋葡萄糖。在一个实施方式中，这些制剂包括载体，如羧甲基纤维素和/或透明质酸。在一个实施方式中，存在于组合物中的羧甲基纤维素的量小于约0.5重量％。此外，对合适的药学上可接受载体的选择取决于：期望的剂型、受影响的身体区域、和给药途径等。
尽管已用示例性的形式以某种程度的特殊性对本公开进行了描述和说明，但应注意的是描述和说明只是通过举例而完成。在各部件和各步骤的结构及组合和安排的细节中可做出许多变化。因此，这种变化意图是包含在本发明中，本发明的范围是由权利要求所限定。
实施例
利用液相色谱法和串联质谱法(LC-MS/MS)对存在于脊索细胞来源条件培养液的生物活性流分中的蛋白质进行了鉴定。利用椎间盘退行性疾病的体外(大鼠、牛和人髓核细胞)和临床前啮齿动物模型，对在脊索细胞来源条件培养液中所鉴定的TGFβ1、CTGF和Wnt诱导可溶性蛋白-2(WISP2)的再生潜能进行了评估。
椎间盘退行性疾病的临床前模型的开发
缺乏椎间盘退行性疾病的良好表征动物模型给潜在治疗剂的比较分析和准确评价带来了重大挑战。此外，对治疗剂的反应有可能受到各物种之间组织学差异和表型差异的影响25、26。在对模仿人椎间盘退行性疾病且适合于治疗剂评估的合适动物模型的寻找中，将人退化椎间盘髓核的组织学特性与牛、非软骨营养不良性犬和Wistar大鼠椎间盘进行了比较。观察到从人和牛退化椎间盘中所获得髓核中的纤维软骨基质的强番红O染色指示(图7a)。相反，健康的富含脊索细胞的非软骨营养不良犬(NCD)及幼小的健康Wistar大鼠具有微弱的番红O染色的富含高度蜂窝状脊索细胞的髓核(>90％)(图7a)。利用brachyury(鼠短尾突变体表型，一个脊索细胞特异性标志物)和Oct4(干细胞的已知标志物)的免疫组织化学验证了在各髓核之间细胞表型的差异4、5。免疫组织化学分析未显示在人或牛退化椎间盘髓核中有鼠短尾突变体表型或Oct4的可检测表达(图7a)。然而，在健康的幼小非软骨营养不良犬和Wistar大鼠椎间盘中观察到brachyury(鼠短尾突变体表型)和Oct4的强核表达，从而证实脊索细胞和干细胞在这些髓核中的存在(图7a)。
为了建立用于对各治疗剂进行评估的平台，而采用了椎间盘退行性疾病的临床前啮齿动物模型。在12周龄健康Wistar大鼠(n＝21，每只物4个椎间盘)的尾部(尾)椎间盘中执行了影像引导的针刺损伤。以时间依赖性的方式确定了细胞外基质(ECM)和细胞表型的变化(72小时-10周，图1a-图1g)。组织学分析显示从2-10周脊索细胞的逐渐损失(>70％)以及增加的番红O染色强度，从而提示在损伤后髓核中的细胞外基质重构(图1b、图7b)。到损伤后第10周结束时为止，也观察到聚集蛋白聚糖和胶原蛋白2的表达减少(图1b)。值得注意的是，早在损伤后的72小时，针刺损伤增加髓核中的促炎性细胞因子、肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达(图1c)。然而，直到第10周未观察到活性形式的IL-1β(～17kDa)，这与炎症介质环氧合酶2(COX2)和细胞外基质降解酶、基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-13，图1c)表达的突然增加一致。令人关注地，在损伤后第10周的结束观察到金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP1)(MMP的天然抑制剂)的损失，这与MMP的发生一致(图1c)。在损伤后的第1周，观察到具有血小板反应蛋白1型4基元(ADAMTS4)的解整联蛋白样金属蛋白酶(其是导致聚集蛋白聚糖降解的主要酶中的一个酶)的表达的显著增加(图1c)。另外，针刺损伤也诱导p42/44(Thr202/Tyr204)和p38 MAPK(Thr180/Tyr182)的磷酸化，从而表明它们在椎间盘退化中的作用(图1d)。并行地，蛋白质印迹分析和使用共焦显微镜的免疫荧光法显示在损伤后第10周在受损伤椎间盘髓核中脊索细胞标志物(鼠短尾突变体表型和半乳糖凝集素3)和干细胞标记物物(Oct4和Nanog)的损失(图1e-图1g)。这些发现明确地表明髓核环境从健康的自我平衡调节环境到促炎性分解代谢状态的变换、以及在退化椎间盘中脊索细胞和干细胞两者的损失。
对椎间盘退行性疾病中细胞外基质更新的调节
不同于在健康髓核中所看见的亲水性富含蛋白聚糖的细胞外基质，退化椎间盘微环境是分解代谢的、富含促炎性细胞因子(IL-1β和TNFα)并且表现稳态的破坏，如在大鼠尾椎间盘损伤模型中所显示。为了确定IL-1β和TNFα对细胞外基质更新的影响，而将大鼠髓核细胞用IL-1β单独地或者连同TNFα处理达24小时，并且使用细胞外基质和细胞黏附分子基因阵列(包含84个基因)执行实时定量PCR。与无处理对照(NTC)相比用IL-1β单独地或者连同TNFα对大鼠髓核细胞进行处理显示22个mRNA转录子的表达中有显著变化(p<0.05)，包括健康基质基因(HAPLN1、CTGF、血小板反应蛋白1和2)的下调和基质降解酶MMP(MMP-3/9/11/13)的上调(图2a-c，表1)：
表1.在用IL1β单独地/IL1β+TNFα的组合进行处理中相对于无处理对照(NTC)显示上调/下调的细胞外基质(ECM)基因的列表
基因符号 倍数调节(IL1β对NTC) P值 倍数调节(IL1β+TNFα对NTC) P值
MMP9 1252.77 0.000 1218.76 0.000
Adamats8 139.39 0.000 81.95 0.000
MMP3 68.04 0.000 71.56 0.000
MMP13 36.82 0.005 42.39 0.000
Cd44 23.57 0.000 22.48 0.003
Itga3 9.22 0.000 7.04 0.003
Icarn1 6.56 0.000 5.84 0.000
Itga5 5.23 0.000 8.12 0.034
Timp1 5.04 0.000 5.02 0.000
Emilin1 4.42 0.000 4.87 0.000
Col4a1 4.24 0.001 5.12 0.000
Lamc1 4.24 0.009 4.25 0.000
Co14a2 3.20 0.000 2.75 0.000
Itgav 2.14 0.000 2.22 0.004
Cdh3 -6.18 0.410 -8.59 0.035
Hapln1 -6.01 0.001 -12.59 0.000
Thbs2 -4.14 0.001 -5.90 0.000
Mmp11 -3.86 0.004 -6.51 0.001
Col3a1 -3.80 0.000 -3.53 0.000
Thbs1 -3.35 0.000 -2.87 0.000
Ctgf -2.40 0.001 -2.71 0.000
Ncam1 -2.00 0.001 -3.63 0.000
蛋白质印迹分析验证了在用IL-1β和TNFα处理的大鼠髓核细胞中MMP-3和MMP-13表达水平的显著增加(图2d)。另外，对IL-1β和TNFα处理作出反应，也观察到在大鼠髓核细胞中Cox2的增加，但却观察到胶原蛋白2表达的减少(图2d)。
显著地，IL-1β或者其与TNFα的组合提高c-Raf(S259)、p42/44(Thr202/Tyr204)和p38 MAPK(Thr180/Tyr182)的磷酸化水平并且它们的总蛋白质含量没有任何显著变化(图2d、图2e)。在大鼠髓核细胞中存在U0126(p42/44MAPK的特异性抑制剂)的情况下，IL-1β和TNFα两者未能诱导MMP-3、MMP-13或Cox2表达(图2f、图2g)。在p38 MAPK抑制剂SB203580存在的情况下，在IL-1β处理的大鼠髓核细胞中观察到MMP-3、MMP-13和Cox2的表达的减少(图2f)。这些观察支持体内数据，从而证明IL-1β和TNFα对下游p42/44和p38 MAPK的活化在椎间盘退化期间细胞外基质蛋白的调节中是重要的(图1d)。所获得的结果也表明核因子κB(NFκB)、Jun活化激酶1(JAK1)、及信号转导和转录激活因子3(STAT3)参与了髓核细胞中IL-1β和TNFα诱导的MMP-3、MMP-13和Cox2表达。在BAY-11-7082(NFκB抑制剂)、JAK1或STAT3特异性抑制剂存在下用IL-1β和TNFα处理的大鼠髓核细胞中显示MMP-3、MMP-13和Cox2蛋白质的表达的减少(图2f、图2g)。相反，渥曼青霉素(PI3K抑制剂)的存在仅减少MMP-3和MMP-13的表达(图2f、图2g)。类似地，在从人退化椎间盘中获得的髓核细胞中，在p38 MAPK、NFκB、JAK1或STAT3的抑制剂存在下，IL-1β和TNFα未能诱导Cox2(图2h)。这些发现表明p38 MAPK、NFκB、JAK1和STAT3蛋白在进行性椎间盘退化中的重要性。
脊索细胞来源条件培养液(NCCM)促进细胞外基质更新并减轻体内炎症
本发明人以前证明来源于脊索细胞的条件培养液(NCCM)显示抗凋亡作用和在体外诱导聚集蛋白聚糖和胶原蛋白2mRNA含量的上调19、20。然而，尚未对脊索细胞来源条件培养液在椎间盘退行性疾病的临床前体内模型的再生潜能进行评估。通过将从非软骨营养不良犬中获得的富含脊索细胞髓核置于无酚红、无血清杂交瘤培养液和根据以前研究方案收获的条件培养液中，而收集脊索细胞来源条件培养液18-20。利用荧光成像，将浓缩的脊索细胞来源条件培养液或对照培养液(～8μL/椎间盘)注射入受损伤的(损伤后第4周)大鼠尾椎间盘髓核中。在损伤的十周后，组织学分析表明在脊索细胞来源条件培养液注射的大鼠尾受损伤椎间盘中富含脊索细胞的髓核适度的番红O染色(图3a)。相反，用对照培养液注射的大鼠尾受损伤椎间盘显示低细胞结构和强番红O染色的纤维软骨基质(其是纤维软骨形态的指示物)(图3a)。免疫组织化学和蛋白质印迹分析表明：与假对照(sham control)相比，在用脊索细胞来源条件培养液注射的大鼠尾受损伤椎间盘中聚集蛋白聚糖、胶原蛋白2、鼠短尾突变体表型、Oct4和Nanog的恢复(图3a、图3b)。这些结果表明在脊索细胞来源条件培养液中的可溶性因子在体内对椎间盘退行性疾病具有再生潜能。
利用质谱法对脊索细胞来源条件培养液中的可溶性因子的鉴定
为了鉴定由脊索细胞分泌的可溶性因子，相继地利用50kDa和3kDa过滤器将脊索细胞来源条件培养液加以浓缩，接着利用尺寸排阻色谱法进行分级分离(图3c)。在各含蛋白质的流分中，仅五个流分(50PF4、50PF5、50PF6、3PF4和3PF5)降低牛髓核细胞中依托泊甙诱导的半胱天冬酶3/7活性(图8a-图8c)。这些生物活性流分的质谱分析导致对与犬蛋白质数据库相对应的303种非冗余蛋白质的鉴定(图3c)。
大约31％的这些蛋白质具有分泌肽信号序列，并且被报告是在细胞外基质内(图3d)。鉴定了生长因子及它们的调节物，包括TGFβ1、结缔组织生长因子(CTGF)、Wnt诱导可溶性蛋白-2(WISP-2)、腱蛋白、骨硬化蛋白、软骨间层蛋白(CILP)和CD109(图9)。免疫组织化学分析显示在健康大鼠尾椎间盘髓核中的脊索细胞的细胞质和细胞外基质(ECM)中CTGF、WISP-2和TGFβ1的中等到强的免疫染色。然而，受损伤的大鼠尾椎间盘和人退化椎间盘髓核不显示CTGF、WISP-2或TGFβ1在细胞外基质内的可检测表达(图3e)。这些发现表明CTGF、WISP-2或TGFβ1的损失与椎间盘退行性疾病的发展是相关的。
在体外CTGF和TGFβ1给髓核细胞赋予合成代谢和抗分解代谢作用
用CTGF、WISP-2或TGFβ1对大鼠尾椎间盘髓核细胞(健康的/退化的)进行处理，以便评估它们以剂量和时间依赖性方式对细胞存活率的影响(24小时-96小时，图10a-图10d)。利用基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)的比色分析来测定细胞存活率。用CTGF(100ng/ml)或TGFβ1(10ng/ml)单独地或联合地进行处理提高来源于大鼠尾椎间盘(健康的/受损伤的)和牛椎间盘的髓核细胞在48小时-72小时内的存活率(图4a、图4b、图11a、图11b)。显著地，在人退化椎间盘髓核细胞中用CTGF(100ng/ml)与TGFβ1(10ng/ml)的组合进行处理提高细胞存活率达≥35％(图4c、图11c)。然而，在用WISP-2进行的处理中，未观察到在髓核细胞(大鼠和人)的存活率中有显著变化(图4a-图4c、图10b、图5a-图5c)。利用采用溴脱氧尿苷(BrdU)掺入的细胞增殖检测对此做出了进一步的确认。在用TGFβ1单独地进行的处理中，在大鼠尾(健康的/受损伤的)和人退化椎间盘髓核细胞中观察到DNA合成的显著增加(图4d、图4e)。在用TGFβ1单独地或者连同CTGF进行的处理中，在人退化椎间盘髓核细胞中也观察到胶原蛋白2、透明质酸蛋白聚糖连粘蛋白1(HAPLN1)、多能蛋白聚糖(versican)和血小板反应蛋白1(THBS1)的mRNA含量增加(图4f)。蛋白质印迹分析验证了在用TGFβ1单独地或连同CTGF进行的处理中在24小时内胶原蛋白2表达的增加(图4g)，从而支持这些生长因子的合成代谢作用。
对CTGF和TGFβ1抑制炎症诱导的半胱天冬酶活性和MMP的表达的潜能进行了评估。在CTGF、WISP-2或TGFβ1的存在下，将大鼠和人退化椎间盘髓核细胞两者用IL-1β单独地或连同TNFα进行处理达48小时。结果表明在TGFβ1单独地存在下，在退化椎间盘髓核细胞(大鼠/人)中细胞因子(IL-1β和TNFα)诱导的半胱天冬酶3/7活性有显著的降低(图5a-图5c)。相反，在人退化椎间盘髓核细胞中CTGF、WISP-2或者TGFβ1的存在下，观察到IL-1β和TNFα诱导半胱天冬酶9活性的显著降低(图5e、图5f)。在用IL-1β和TNFα进行处理的大鼠尾髓核细胞中，用CTGF、WISP-2或TGFβ1进行处理减少MMP-3、MMP-13和Cox2蛋白的表达(图5g、图5h)。类似地，用IL-1β和TNFα处理的人退化椎间盘髓核细胞在CTGF与TGFβ1的组合存在下显示较低的Cox2和MMP-13mRNA含量，从而证明这些生长因子的抗分解代谢作用(图5i、图5j)。
在体内用CTGF和TGFβ1进行处理使退化椎间盘髓核再生
到目前为止的结果提示CTGF和TGFβ1在体外具有抗分解代谢和促进合成代谢作用。为了测试在啮齿动物模型中CTGF和TGFβ1的再生潜能，在2个独立试验中实施了影像引导的尾椎间盘损伤(n＝30，4个椎间盘/动物)。在损伤的四周后，将动物随机分入5个组(n＝6只动物/组)，并且给予CTGF(100ng/mL)、TGFβ1(10ng/mL)、CTGF(100ng/mL)与TGFβ1(10ng/mL)的组合、或者作为赋形剂对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS，1×，pH＝7.2)的椎间盘内注射。对用PBS(1×，pH＝7.2)注射的椎间盘的组织学分析显示少数细胞具有纤维软骨基质和在髓核内的强番红O染色(图6a)。然而，用CTGF或TGFβ1单独地或联合地进行处理的受损伤大鼠尾椎间盘在损伤的10周后显示富含脊索细胞的健康椎间盘(图6a)。免疫组织化学分析确认健康髓核的恢复，从而表明与用赋形剂对照注射的受损伤椎间盘髓核相比聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II的强表达(图6a、图6b)。用CTGF与TGFβ1的组合进行处理抑制MMP-13和Cox2蛋白，并且在大鼠尾受损伤椎间盘髓核中恢复了鼠短尾突变体表型和Oct4的表达(图6b)。
椎间盘退行性疾病是特征为椎间盘结构完整性受损、及常常导致椎间盘疼痛和运动受限的内部髓核细胞外基质形成的多因素过程27-31。在健康的椎间盘髓核中，亲水性的细胞外基质在维持脊柱的生物力学特性中发挥了重要作用。各实施例表明在椎间盘退行性疾病的啮齿动物模型中髓核-细胞外基质的退化与炎症、及脊索细胞和干细胞的损失是相关的，所述炎症及脊索细胞和干细胞的损失共同地导致纤维软骨髓核的形成，这类似于在人退化椎间盘中所观察到的情况。这些发现表明在椎间盘退行性疾病中在促炎性细胞因子(TNFα和IL-1β)的表达与基质降解酶(MMP-3、MMP-13、ADAMTS4)之间有直接关系。在进行性椎间盘退化期间，在体外用这些促炎性细胞因子进行处理证实了炎症在对细胞外基质退化和更新的调节中发挥了显著作用。因此，在退化椎间盘髓核中将炎症作为标靶对于椎间盘退行性疾病的治疗会是关键的。现已设计并测试了在椎间盘退行性疾病中将炎症作为标靶的若干个单药策略，包括白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)、以及将TNFα及其主要下游靶NFκB32-39作为标靶的合成肽和抑制剂。支持地，也证明对NFκB或MAPK(p42/44和p38 MAPK)、Jak1和STAT3的抑制能够减少在髓核细胞中IL-1β和TNFα下游的Cox2、MMP-3和MMP-13表达。然而，作为治疗剂的这些特异性抑制剂的作用局限于抗分解代谢活性。这些治疗剂未能显示在正在退化的椎间盘中的催化健康髓核细胞外基质的从头合成或者促进髓核细胞存活和增殖的任何合成代谢反应。
本发明人鉴定了在脊索细胞来源条件培养液中的TGFβ1、CTGF和WISP-2并且证明了它们的再生潜能。TGFβ1在处于胚胎期的椎间盘和软骨的发育以及出生后脊柱的发育中起关键作用40。在终板软骨细胞和内层纤维环细胞中TGFβ信号转导的损失导致基质组织的损失、和在TGFβ1缺失小鼠脊柱中的异常生长板形态40。数据也表明在人和受损伤大鼠尾椎间盘两者中的退化纤维软骨髓核中TGFβ1表达的减少。在退化椎间盘髓核中TGFβ1的损失指示TGFβ信号转导对于维持健康的富含脊索细胞髓核的重要性。与用对照腺病毒载体或盐水注射的椎间盘相比，在健康的兔髓核中TGFβ1过表达表明蛋白聚糖合成有显著增加41。
在脊索细胞来源条件培养液中被鉴定的另一个治疗剂CTGF是基质细胞蛋白，该基质细胞蛋白具有一个氨基末端分泌肽接着是具有与胰岛素样生长因子结合蛋白的序列同源性的四个保守结构域、血管性血友病因子C(VWC)结构域、血小板反应蛋白1型重复区(TSR)和含有半胱氨酸结基序的羧基末端结构域。CTGF是椎间盘微环境的一个重要组分，并且与若干生长因子和基质蛋白(包括整合素类和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖类)发生相互作用。如在各实施方案中所示，在椎间盘退行性疾病的体外和体内模型的两者中，用CTGF与TGFβ1的组合进行处理显著地减少Cox2和基质降解酶(MMP-3和MMP-13)的IL-1β诱导表达，这表明了这些潜在治疗剂(图6c)的联合作用。
CTGF和TGFβ单独地和联合DRS组合物的再生潜能
图12(a)示出了对在上述椎间盘退行性疾病的体内啮齿动物椎间盘损伤模型中CTGF和TGFβ1单独地及连同DRS(包含盐酸葡糖胺和硫酸软骨素的组合物，依照“方法”制备)的再生潜能的评估。该附图示出了使用磷酸盐缓冲盐水(PBS，用作对照)对细胞外基质蛋白、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白2的番红O和免疫组织化学染色。该评估表明：基于与健康对照的比较，DRS+CTGF+TGFβ1是一个特别有效的治疗方案。图12(b)提供了蛋白质印迹分析，该分析表明在从用CTGF、TGFβ1、CTGF与TGFβ1的组合、DRS、DRS连同CTGF、或者DRS、CTGF和TGFβ1的组合进行处理的大鼠尾受损伤椎间盘中所获得的髓核组织裂解液中MMP-13和Cox2表达的减少、及干细胞标记物Oct4的恢复。
图13示出了在椎间盘退行性疾病的大鼠尾损伤模型中经过20周的进一步评估。存在三种不同的状态。(a)是大鼠尾椎间盘(IVD)的番红O染色的矢状切面，该切面描绘了健康的髓核、纤维环和椎体终板(红色箭头)。(b)通过针刺损伤所引起的番红O染色的退化椎间盘。按照常用方法使椎间盘受损伤4周后注射PBS缓冲盐水，并且在注射的16周后采集(损伤20周后)。损伤对照的结果显示具有高度和组织形态学的显著损失、脊索细胞的损失和纤维软骨细胞外基质形成的严重退化表型。(c)进行相同的试验，除损伤后的4周，注射包含CTGF、TGFβ1和DRS的组合物而不是盐水。该经处理的椎间盘显示接近正常的表型和形态，并且维持椎间盘高度、健康的锥体终板和持续不变的细胞结构及健康的细胞外基质。
方法
如前所述，从由非软骨营养不良性犬的椎间盘中所获得的富含脊索细胞的髓核(NP)中收集脊索细胞来源条件培养液(NCCM)18。所有动物(n＝12)是与获得许可的动物设施合作而获得，并且所有操作是依据动物养护政策及加拿大安大略省多伦多市的多伦多西区医院的伦理批准委员会。所有非软骨营养不良性犬的年龄为8至14月，并且收养失败，或者为其他目的将被实施安乐死。利用采用1mL/15Kg体重的复合剂量的乙酰丙嗪(10mg/mL，Atravet-Aerst制药公司，加拿大魁北克省圣劳伦斯)与甲苯胺噻嗪100mg/mL(Xylomax-Bimeda-NHC动物健康，爱尔兰都柏林塔拉理的布鲁姆希尔路)混合的组合，实现深度镇静。一旦深度镇静已发生，则通过以30mL/kg体重的剂量静脉注射戊巴比妥钠(CDMV)(St.Hyacinthe，加拿大魁北克省)而完成安乐死。在安乐死的2小时内，取出腰椎并且在无菌条件下分离出髓核18。将髓核用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.2)清洗，在低氧状态(3.5％O2、和5％CO2，NuAire培养箱)下于37℃将2-3个髓核置于6孔平板中包含100单位青霉素/链霉素CD杂交瘤培养液中的带10μ过滤器的组织培养插入物中(无蛋白质和酚红，目录编号11279-023，Life Technologies，美国)。在24小时-48小时后收集在下文中被称为脊索细胞来源条件培养液的条件培养液，以8000rpm离心达30分钟，经过0.2μ注射器针头过滤器进行过滤，于-80℃下贮存直到将来使用。
于室温(RT)下将脊索细胞来源条件培养液解冻，并且按照生产商的说明书利用50kDa和3kDa旋转超滤蛋白质浓缩机相继地进行浓缩(EMD Millipore，美国马萨诸塞州)。通过在Superose 12HR10/30快速蛋白质液相色谱(FPLC)柱(Pharmacia)中在含有10mM磷酸钠、150mM NaCl、1mM EDTA(pH 7.4)的运行缓冲液中的尺寸排阻，对各个经浓缩脊索细胞来源条件培养液样品进行分离。收集三十个流分(～1ml)，利用在280nm处的吸光度测量蛋白质浓度，于-80℃下贮存直到将来使用。将各连续的含蛋白质部分成对地汇合，并且如下所述评估它们在牛尾椎间盘髓核细胞中对依托泊甙(细胞毒药物)诱导的半胱天冬酶3/7活性的影响。各生物活性部分被定义为在用依托泊甙进行处理后显示牛髓核细胞中的半胱天冬酶3/7活性下降的蛋白质流分。随后，利用质谱法对这些生物活性流分进行分析以便对蛋白质进行鉴定。
将生物活性流分用二硫苏糖醇(DTT)进行还原，用碘乙酰胺将游离的半胱氨酸残基烷基化并且用改性的牛胰蛋白酶(Promega，美国麦迪逊市)消化过夜。将胰蛋白酶消化肽进行脱盐并加载到带集成发射器的容纳RSLC 2μm C18填充材料(EASY-Spray，Thermo-Fisher，丹麦欧登塞市)的50cm×75μm ID柱上。以在0.1％甲酸中的0％至35％乙腈的90分钟梯度，将各肽洗脱入使用Easy-Spray nLC 1000色谱系统(Thermo-Fisher，丹麦欧登塞市)的Q-Exactive混合型质谱仪(Thermo-Fisher，加尼福尼亚州圣荷西市)中。质谱仪是以数据依赖性方式利用1个MS接着是10个MS/MS谱而操作。以70,000FWHM的分辨率、1×106离子的靶和120ms的最大扫描时间获得MS。以17,500FWHM的分辨率、1×106离子的靶和120ms的最大扫描时间并且使用27％的相对碰撞能量进行MS/MS扫描。在MS/MS扫描中采用15秒的动态排除时间。将原始数据文件提供给XCalibur 2.2(Thermo-Fisher Scientific)并且用使用具有28,460条录入并具有X！-Tandem(Beavis Informatics，Winnipeg，MAN)的UniProt犬数据库2014年8月12日版本的Sequest搜索引擎(Thermo-Fisher Scientific)进行处理。将经处理的数据输入Scaffold 3.2(Proteome Software，俄勒冈州波特兰市)。如果Scaffold得分超过0.1％错误发现率(FDR)(如通过在反向UniProt犬数据库中搜寻而确定)，则认为肽已被鉴定。
从六头3岁阉牛中获得牛尾椎间盘髓核。从在多伦多市多伦多西部医院的大学健康网络接受椎间盘切除术或融合手术的患者(n＝4)(有知情通知书)中，获得人退化椎间盘髓核细胞。
使用12周龄雌性Wistar大鼠(Charles River Laboratories国际有限公司，美国马萨诸塞州)开发椎间盘退行性疾病的临床前啮齿动物模型并且在这些临床前啮齿动物模型中对脊索细胞来源条件培养液、CTGF和TGFβ1的治疗潜能进行评估。根据用于实验动物的养护与使用的指导进行试验，并且试验研究方案得到了加拿大安大略省多伦多市的多伦多西部医院的伦理批准委员会的批准。外科手术如下：使用异氟烷(5L/min加1L/min O2)并维持在3L/min而实现麻醉。一旦被深度麻醉，则将动物固定到带鼻锥吸入器的立体定向手术装置上(型号900，Kopf Instruments，美国加尼福尼亚州)。在动物试验中，以无菌方式将尾剃毛并且用异丙醇洗涤。利用荧光透视法使针穿刺可视化并且确保针穿刺进入髓核的中心。就椎间盘损伤而言，使用安装在汉密尔顿注射器上的26Gauge(G)35°斜角、高度为0.75英寸的针(Hamilton公司，美国)。使针完全地行进经过所选的尾椎间盘从而穿过包括在椎间盘两侧上的纤维环的全厚度。利用荧光透视法进行针放置的确认，并且将针保持在其位置达2分钟，拔出一半到髓核的中心并停留在那里达1分钟，然后在1分钟的时间段内缓慢地将针完全地拔出。然后，将动物从立体定向装置中移出并使它们在加温的笼中恢复。在研究期(即72小时-10周)的结束，利用CO2将动物人道地安乐死并且将各腰椎/尾侧运动节段无菌地切开。将椎间盘固定于甲醛溶液中以便进行组织学分析或者将髓核(健康的/受损伤的)收集并溶解于RIPA缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷，pH＝7.4，150mM NaCl、1％ NP-40和蛋白酶抑制剂混合物)中以便进行蛋白质印迹分析。
为了确定脊索细胞来源条件培养液、CTGF或TGFβ1的再生潜能，如上所述利用26G针使12周龄大鼠的每只动物的4个椎间盘受损伤。在损伤的四周后，将动物随机分入六只动物的各组，并且在局部麻醉下执行脊索细胞来源条件培养液、CTGF(100ng/mL)或者TGFβ1(10ng/mL)的椎间盘内注射(～8μL)。就脊索细胞来源条件培养液注射的动物而言，对照组是由仅接受杂交瘤培养液的椎间盘内注射(～8μL)的动物所组成，同时将磷酸盐缓冲盐水(PBS，1×，pH＝7.2)用作CTGF和TGFβ1注射动物组的对照。六周后，收集来自受损和对照椎间盘的髓核并固定于甲醛溶液中以便进行组织学分析或者溶解于RIPA裂解液中以便进行蛋白质印迹分析。独立地重复每个该试验以确保重现性。
包含针对磷酸化p42/p44(Thr202/Tyr204)、磷酸化p38(Thr180/Tyr182)、磷酸化cRaf(Ser338)、总p42/p44、p38 MAPK蛋白的兔多克隆/单克隆抗体的细胞信号转导技术采样器套件是从New England Biolabs有限公司(加拿大安大略省)获得。针对胶原蛋白2(ab34712)、MMP-13(ab39012)、Cox2(ab15191)、Oct4(ab18976)、Nanog(ab106465)、CTGF(ab6995)、STAT3(ab7966)的兔多克隆抗体、针对MMP-3(ab52915)的兔单克隆壳体、及针对半乳糖凝集素3(ab2785)和β-肌动蛋白(ab6276)的小鼠单克隆抗体是从Abcam有限公司(加拿大多伦多市)购得。针对聚集蛋白聚糖(sc-25674)、TIMP-1(sc-5538)、ADAMTS-4(sc-25582)、TNFα(sc-8301)、TGFβ1(sc-146)的山羊多克隆鼠短尾突变体表型抗体(sc-17743)和兔多克隆抗体、及小鼠单克隆WISP2(sc-514070)是从Santa Cruz Biotechnology有限公司(美国加尼福尼亚州)获得。将p42/44(U0126)、p38MAPK(SB203580)、NFκB(BAY-11-7082)、PI3K(渥曼青霉素)作为标靶的特异性抑制剂、JAK1抑制剂和STAT3抑制剂是从EMDMillipore(加拿大安大略省)购得。人重组IL-1β、TNFα、CTGF、WISP2和TGFβ1蛋白是从Peprotech有限公司(加拿大魁北克省)购得。
将组织固定于10％甲醛溶液中并且在10％ EDTA溶液中进行脱钙。首先使脱钙的椎间盘在正中矢状面中分开，包埋于石蜡中，获得厚度为5μ的切片以便进行组织学评估。执行苏木精和伊红(H&E)和番红O染色，以便如前所述确定在这些组织切片中的一般形态和蛋白聚糖含量16。就免疫组织化学/免疫荧光法(IF)而言，在二甲苯中将人退化椎间盘髓核、牛髓核、健康犬(NCD)和大鼠(健康的/受损伤的)椎间盘的石蜡包埋切片(5μm)脱蜡，在梯度酒精中水合，接着在三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液(pH＝9.0)中进行抗原修复。利用在甲醇中的过氧化氢(0.3％v/v)将各切片保温达15分钟以淬灭内源性过氧化物酶活性，接着用10％血清进行封闭以排除非特异性结合。其后，将各玻片与兔或山羊多克隆/小鼠单克隆一级抗体一起于4℃下保温过夜(O/N)。利用来自Vectastain ABC套件的各个二级抗体(兔/山羊/小鼠)和作为色原的二氨基联苯胺(DAB)对蛋白质表达进行检测。在阴性对照中，用同型匹配的IgG代替一级抗体。通过使用ScanScope XT、从先进光学显微镜设备(AOMF)和多伦多医学研究(TMDT)所获得的Aperio全滑动扫描仪的光学显微镜检查，对亮场切片进行评估。利用Aperio ImageScope(版本10)对图像进行分析。就免疫荧光法而言，利用Alexa fluor染料(488/568nm)标记的各个二级抗体(兔/山羊/小鼠，Invitrogen，Life Technologies，美国加尼福尼亚州)对一级抗体进行检测。用DAPI将切片复染色并且用抗荧光猝灭(Sigma-Aldrich，美国)封片培养液进行封片。所有图像是利用从AOMF、多伦多医学研究(TMDT)所获得的Fluoview 1000倒置显微镜(Olympus IX81，Olympus)而获得。利用Fluoview1000(版本3.1)软件对各图像进行分析。
在实施安乐死后，无菌地取出健康的大鼠腰部/尾侧脊柱椎间盘、受损伤的尾椎间盘和牛尾侧椎间盘髓核，单独地取出髓核(NP)并且根据由本发明人所确定的方法进行酶消化16。类似地，利用链霉蛋白酶对人退化椎间盘髓核进行酶消化(0.4％，1小时，于37℃下)接着进行胶原蛋白酶II处理(0.015％，过夜，37℃)。在第二天，将细胞用70μ细胞过滤器进行过滤，并且在低氧培养箱(NuAire，美国明尼苏达州)内，在3.5％ O2、5％CO2中，在补充8％胎牛血清(FBS)及青霉素和链霉素(100U/mL)补加的高级杜尔贝科改良伊格尔培养基(ADMEM)中进行培养。在处理中，将细胞在无血清ADMEM(无处理对照)中进行培养，或者在各种时间点在低氧条件下利用白细胞介素-1β(IL-1β，10ng/mL)、肿瘤坏死因子α(TNFα，50ng/mL)、结缔组织生长因子(CTGF，10-100ng/mL)、Wnt诱导可溶性蛋白2(WISP2，10-100ng/mL)或转化生长因子β1(TGFβ1，5-20ng/mL)进行处理。
使利用RIPA裂解液所制备的相等量的全细胞或组织裂解液经过蛋白质印迹分析，如前所述18、19。将全部的裂解物(30μg)在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上在还原条件下进行分解，然后将蛋白质电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(BioRad，加尼福尼亚州)上。在利用在三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS，0.1M，pH＝7.4)中的5％脱脂奶粉进行封闭之后，将印迹与兔或山羊多克隆/小鼠单克隆一级抗体一起于4℃下保温一夜。将膜用Tween(0.1％)-三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TTBS)清洗三次，然后与按照生产商的说明书在TBS(pH＝7.2，1×)中的2％脱脂奶中稀释的各自的HRP偶联抗IgG二级抗体(BioRad，加尼福尼亚州)一起于室温(RT)下保温达2小时。将各印迹用TTBS清洗三次达15分钟，在柯达超薄膜上利用增强化学发光法(BioRad，加尼福尼亚)对各蛋白质带进行检测。
将髓核细胞(大鼠、牛和人)置于96孔平底板中，以评估用生长因子进行处理对细胞存活率和增殖测试中的作用。以剂量(1ng/mL-100ng/mL)和时间依赖性的方式(24小时-96小时)用CTGF、WISP-2和TGFβ1对大鼠髓核细胞进行处理，以确定用于评价这些生长因子对存活率影响的最佳剂量和时间。如前所述，利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT，Sigma-Aldrich，美国)测定细胞存活率44。按照生产商的说明书，利用BrdU-ELISA(比色)测试(目录编号ab126556，Abcam)来确定用CTGF或TGFβ1进行处理对人和大鼠髓核细胞(健康的/受损伤的)的影响。简略地，在各孔中添加BrdU试剂过夜之后，将髓核细胞用CTGF或TGFβ1单独地或联合地进行处理达48小时。利用抗BrdU抗体来测定在增殖细胞的DNA中所掺入的BrdU，并按照生产商的说明书利用ELISA进行定量。
利用半胱天冬酶3/7和半胱天冬酶9特异性Lumi-Glo测试(Promega，麦迪逊市)对由于用促炎性细胞因子(IL-1β和TNFα)进行处理所导致的髓核细胞(大鼠和人)中诱导的凋亡进行测定。简略地，将髓核细胞涂平板并且用IL-1β单独地、或仅联合TNFα、或者在CTGF和TGFβ1存在下进行处理达48小时，接着按照生产商的说明书添加用于半胱天冬酶3/7和半胱天冬酶9的特异性试剂。将细于37℃下保温达另外的4小时，在多孔发光板阅读器中对各平板进行阅读。
利用RNA快速提取试剂盒(目录编号74134，Qiagen)对来自健康和经处理的(IL-1β单独地或连同TNFα)大鼠髓核细胞的总RNA加以分离，并且使用Nanodrop分光光度计进行定量。按照生产商的说明书，利用RT2First Strand试剂盒(目录编号#330401，Qiagen)对总RNA(～400ng)进行反转录以制备cDNA。为了评估IL-1β单独地或者连同TNFα对大鼠髓核细胞中的细胞外基质(ECM)基因的作用，使用RT2 ProfilerTMPCR阵列大鼠细胞外基质和Adhesion Molecules(PARN-013Z，Qiagen)并且在3个独立试验中利用在ABI 7900HT 384孔快速封闭机上执行的实时PCR与无处理对照(NTC)进行了比较。利用在线获得的软件(https://www.qiagen.com/ca)执行包括ΔΔCt值、差异倍数和p值的计算的数据分析。从用CTGF、TGFβ1、CTGF+TGFβ1处理的人退化椎间盘髓核细胞(H1/H2)中分离总RNA，以便利用基因特异性引物来评估它们对胶原蛋白2、HAPLN1、多能蛋白聚糖和血小板反应蛋白1的作用。类似地，从在CTGF和TGFβ1存在下用IL-1β单独地或者连同TNFα进行处理的人髓核细胞中分离RNA，以便利用qRT-PCR来确定它们对Cox2和MMP-13表达的影响。
所有数据被表示为平均值±标准偏差。利用配对学生t检验来确定在试验和无处理对照中的显著性差异。利用Graphpad Pris执行统计学分析。就所有试验而言，p<0.05被定义为具有统计学意义。
示例性组合物的制备
向容纳有30ml 1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液的管中通过喷洒添加0.048g羧甲基纤维素(目录编号419273，Sigma)。在包裹于铝箔中的同时，将该管于室温下振摇达2-3小时。然后添加0.384g右旋葡萄糖(目录编号D8066，Sigma)。然后添加0.384g盐酸葡糖胺(目录编号G1514，Sigma)。然后添加72mg硫酸软骨素(目录编号C4384，Sigma)，利用1ml无菌塑料头使任何材料的块分散并溶解；然后将该管振摇直到全部被溶解。用1.0N NaOH将pH值调节至pH 7.4，从而形成“DRS储备溶液”。
为了制备“DRS工作溶液”，在1×PBS中制备DRS储备溶液的1:10稀释液，在生物安全柜中经过0.22um注射器式过滤器进行过滤并且于4℃下贮存。
为了制备“CTGF储备溶液”，从Peprotech有限公司购得CTGF(目录编号120-19)。将20ug的冻干CTGF离心，用1ml的无菌去离子水溶解。
为了制备在DRS中的“CTGF工作溶液”，将5ul的CTGF储备溶液添加到995ul的DRS工作溶液中，从而形成100ng/m的CTGF。
为了制备“TGF-β1储备溶液”，从Peprotech有限公司(目录编号100-21)购得TGF-β1。将10ug的冻干TGF-β1离心，用1ml的无菌10mM柠檬酸(pH约为3.0)溶解。
为了制备在所提供的附图中该工作溶液具有最显著的作用的在DRS中的“CTGF+TGF-β1工作溶液”，将1ul的TGF-β1储备溶液、5ul的CTGF储备溶液、和994ul的DRS储备溶液加以混合，并且等分入各自为250ul的四个管中。
尽管在本文中已描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应当理解的是在不背离本发明的精神或者所附权利要求的范围的前提下可在这些优选实施例中做出变更。本文中所公开的所有文件(包括在以下参考文献列表中的文件)以参考的方式并入本文中。
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Claims (39)

1.一种药物组合物，其为适于椎间盘注射的剂型，所述组合物包含：
软骨素、硫酸软骨素、葡糖胺、盐酸葡糖胺或其组合；和
(a)在所述组合物中作为唯一生长因子的结缔组织生长因子(CTGF)；
(b)在所述组合物中作为唯一生长因子的转化生长因子β1(TGFβ1)；
或
(c)在所述组合物中作为仅有的生长因子的CTGF和TGFβ1。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述软骨素或硫酸软骨素占所述组合物重量的高达2.0％。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述软骨素或硫酸软骨素占所述组合物重量的0.024％、0.1％、0.5％或2.0％。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述葡糖胺或盐酸葡糖胺占所述组合物重量的高达25％。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述葡糖胺或盐酸葡糖胺占所述组合物重量的0.128％、1％、1.5％、5％、20％或25％。
6.根据权利要求l所述的组合物，其中所述CTGF的浓度为50ng/mL至500ng/mL。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CTGF的浓度为50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、125ng/mL、150ng/mL、175ng/mL、200ng/mL、225ng/mL、250ng/mL、275ng/mL、300ng/mL、325ng/mL、350ng/mL、375ng/mL、400ng/mL、425ng/mL、450ng/mL、475ng/mL或500ng/mL。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述TGFβl的浓度为lng/mL至100ng/mL。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述TGFβl的浓度为lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其包含至少一种药学上可接受的载体。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述软骨素、硫酸软骨素、葡糖胺和/或盐酸葡糖胺是溶液的形式。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其为溶液形式。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其还包含水。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述软骨素、硫酸软骨素、葡糖胺和/或盐酸葡糖胺是水溶液的形式。
15.根据权利要求13所述的组合物，其为水溶液形式。
16.根据权利要求14所述的组合物，其为水溶液形式。
17.根据权利要求l-9中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种糖。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述一种或多种糖包含右旋葡萄糖或其药学上可接受的盐。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述右旋葡萄糖或其药学上可接受的盐占所述组合物重量的高达25％。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中所述右旋葡萄糖或其药学上可接受的盐占所述组合物重量的1％、1.5％、2％或25％。
21.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其还包含羧甲基纤维素。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述羧甲基纤维素占所述组合物重量的高达0.5％或0.5％。
23.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其还包含透明质酸。
24.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其还包含缓冲剂。
25.根据权利要求24所述的组合物，所述缓冲剂的量足以使所述组合物的pH值稳定在6和7.4之间。
26.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其还包含麻醉剂。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述麻醉剂是布比卡因。
28.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其还包含二甲基亚砜。
29.根据权利要求l至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物促进退化或损伤的IVD髓核(NP)的再生。
30.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物增加IVD髓核(NP)细胞的增殖和/或活力。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的组合物在制备用于注射入患者的椎间盘中以减缓或抑制所述患者中来源于所述椎间盘的疼痛的药物中的用途。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述椎间盘已发生退化或已受到损伤。
33.根据权利要求1-30中任一项所述的组合物在制备用于注射入患者的椎间盘中以在患有椎间盘退行性疾病或椎间盘损伤的所述患者中治疗椎间盘退化或预防椎间盘退化的进展的药物中的用途。
34.根据权利要求l-30中任一项所述的组合物在制备用于注射到入患者的椎间盘中以在患有椎间盘退行性疾病或椎间盘损伤的所述患者中再生椎间盘组织的药物中的用途。
35.根据权利要求1-30中任一项所述的组合物在制备用于注射到患者的椎间盘中以在患有椎间盘退行性疾病或椎间盘损伤的所述患者中预防椎间盘高度损失进展的药物中的用途。
36.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物在制备用于注射到患者的椎间盘中以在所述患者中治疗椎间盘退行性疾病或椎间盘损伤的药物中的用途。
37.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物在制备用于注射到具有退化的髓核(NP)和/或纤维环的患者的椎间盘中以抑制所述椎间盘的NP的细胞外基质退化的药物中的用途。
38.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物在制备用于注射到患者的退化的椎间盘中以促进所述退化的椎间盘恢复的药物中的用途。
39.根据权利要求l至30中任一项所述的组合物在制备用于注射到患者的退化的椎间盘中以促进所述退化的椎间盘中的髓核(NP)细胞的生长或增强其存活的药物中的用途。
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