CN115942877A - 使用克鲁维毕赤酵母生产乳制品和乳制品类似产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在存在蔗糖、果糖、葡萄糖或它们混合物的碳水化合物的情况下，使用克鲁维毕赤酵母和乳酸菌制备发酵食品，包括乳制品或乳制品类似产品。此类产品的发酵可以使用包含克鲁维毕赤酵母菌株和乳酸菌菌株的起子培养物组合物进行。该组合物任选地包含碳水化合物，其是蔗糖、果糖和/或葡萄糖。
Description
技术领域
本发明涉及食品技术领域，具体涉及通过发酵制备乳制品或乳制品类似产品。
背景技术
乳制品是使用产乳动物(例如，奶牛、水牛、山羊、绵羊)的乳作为起始材料的产品。它们可以通过用合适的微生物发酵乳经或未经组成改性并导致pH值降低来获得。乳制品物是旨在替代传统动物源性食料的食品。乳制品类似物最常见的实例是奶酪类似物(仿奶酪、奶酪样产品、奶酪酱)、发酵乳制品类似物(酸奶样产品)、黄油类似物和乳制品甜点类似物。近年来，此类产品越来越受欢迎，并且越来越多的消费者出于医疗原因(例如，乳糖不耐症、牛奶过敏)、生活方式选择(例如，素食者、弹性素食者、宗教团体)或可持续性而使用此类产品。此外，由于对健康的影响，对动物脂肪和蛋白质的过度依赖正在逐渐转变。人们认为食用植物来源的脂肪和蛋白质与心血管疾病和退行性疾病的风险降低有关。
存在提供具有改善的味道、香味和质地的发酵乳制品类似产品的持续需求。优选在制造过程中几乎不形成不需要的副产物，例如醇。期望醇含量低于0.5％(wt)，特别是低于0.1％(wt)。
由豆类制成的乳制品类似物已在亚洲消费了几个世纪，并且在西方世界越来越受欢迎。食用豆类代表多种多样的植物。它们遍布世界各地，并且几乎在世界每个国家均有消费。发展中国家目前可获得的蛋白质中约20％源自豆类食品。
豆类产品往往有豆腥味和油漆味。发酵可以使原料更适口，质地和感官特性(风味、香味、外观和稠度)发生期望的变化。已经进行了一些尝试来发酵豆类产品以去除豆腥味，例如使用乳酸菌(Mital等人，“使用乳酸菌发酵豆乳.综述.(Fermentation of soymilk by lactic acid bacteria.A review.)”食品保护杂志(Journal of foodprotection)42.11(1979):895-899)。
已知酸产生的速率是食品发酵的关键因素。原料的快速酸化可防止非期望微生物的生长，并且对于最终产品的香味、质地和风味也很重要。然而，就大豆而言，一些研究人员观察到，使用益生菌进行豆乳发酵可能需要更长的时间才能完成，并且产生消费者无法接受的非期望变化(Donkor,Osaana N.，等人“凝固型大豆酸乳的流变学特性和感官特性(Rheological properties and sensory characteristics of set-type soy yogurt).”农业和食品化学杂志(Journal of Agricultural and Food Chemistry)55.24(2007):9868-9876)。通常，商业产品添加调味剂来掩盖异味。在工业上，优选短发酵时间以提高产量和效率。因此，需要提供发酵时间短和/或味道、香味和质地得到改善的发酵食品。此外，鉴于全球转向以植物为基础的饮食，需要提供具有改善的味道、香味和质地的来自植物材料的发酵乳制品类似产品。
发明内容
本发明提供了用酵母克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)生产发酵乳制品(来自动物乳)以及发酵乳制品类似产品(来自植物材料，即植物乳，例如来自豆类、坚果或谷物)的方法。已经发现在存在乳酸菌和某些碳水化合物的情况下使用克鲁维毕赤酵母导致改善乳制品和乳制品类似产品的风味特征和适口性。
通过包括乳酸菌并提供蔗糖、果糖和/或葡萄糖作为基质，可以观察到改善香味和减少醇中的协同效应。
乳制品的香味由大量挥发性有机化合物(VOC)组成，例如醇类、醛类、酯类、游离脂肪酸、酮类、内酯类、酚类化合物和硫化合物(Urbach,G.(1993).奶酪风味与化学成分之间的关系(Relations between cheese flavor and chemical composition).国际乳业杂志(International Dairy Journal),3,389-422)。酯类对风味的贡献具有浓度依赖性。在低浓度下，酯类对整体风味平衡有积极贡献；在高浓度下，它们可能导致果味缺陷(S.-Q.Liu,R.Holland,V.L.Crow(2004)综述：酯类及其在发酵乳制品中的生物合成：综述(Review:Esters and their biosynthesis in fermented dairy products:a review).国际乳业杂志(International Dairy Journal)14,923-945)。酯类是风味的重要贡献者，并且过去常用“果味”(例如苹果、香蕉、梨、菠萝等)一词来描述它们。
出乎意料的是，发现特定的特征组合导致VOC的产生增加，例如酯类的总量，具有良好的香味特征。
在第一方面，本发明提供了乳酸菌和选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的碳水化合物用于在由克鲁维毕赤酵母发酵的食品中增加香味和/或降低醇的用途。此类食品可以是乳制品和乳制品类似物。克鲁维毕赤酵母、乳酸菌以及选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物可以一起用于从合适的材料(例如动物乳或植物乳)发酵乳制品或乳制品类似产品。
碳水化合物，蔗糖、果糖和/或葡萄糖在发酵之前、发酵开始时或发酵过程中在起始材料中提供。化合物可以直接添加或通过微生物间接提供。其中，可以通过添加用于乳酸菌的适合糖类来提供果糖或葡萄糖，该乳酸菌能够在发酵过程中代谢糖类并释放果糖或葡萄糖。蔗糖是由一个葡萄糖分子和一个果糖分子组成的二糖。根据细菌的偏好，使用葡萄糖或果糖，并释放偏好较低的单糖。
更优选地，碳水化合物是蔗糖或果糖。
此外，还可以添加乳酸以促进克鲁维毕赤酵母生长和/或降低醇的水平。
在另一方面，本发明提供了生产发酵食品(例如乳制品和乳制品类似产品)的方法，包括在存在一种或多种乳酸菌以及选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物的情况下，用克鲁维毕赤酵母发酵合适的基质。
根据本发明制备的食品由于发酵而具有增加的粘度。产品的粘度可以通过测量产品剪切应力作为剪切速率的函数的流动测试来测量。
在优选的实施方案中，根据本发明的发酵食品的粘度高于5Pa，例如高于10Pa，例如高于20Pa，例如高于30Pa，例如高于40pa，例如高于50Pa，例如高于60Pa，例如高于70Pa，例如高于80Pa，例如高于90Pa，例如高于100Pa(储存7天后于13℃下以300 1/s的剪切速率测量)。
乳制品类似产品
对于乳制品类似产品，可以使用植物基材料作为起始材料。此类材料是植物来源的，并且主要包含植物材料，但已选择这种材料，是因为最终结果是乳制品样的并可用于替代乳制品。乳制品类似产品(或简称为“乳制品类似物”)是指乳制品样产品，其是用作乳制品的烹饪替代品的产品，在制备过程中一种或多种动物乳成分已被其他成分替代，并且所得食物类似于原始产品。实例包括奶、奶油、奶酪、酸奶、涂抹酱、黄油、冰淇淋等。
在另一方面，本发明提供了生产发酵乳制品类似产品的方法，包括提供植物基材料(例如包含豆类、谷物、坚果的植物乳)，并且在存在选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物的情况下，用克鲁维毕赤酵母和乳酸菌发酵该材料。
本文提供了从植物乳基生产发酵乳制品类似产品的方法，包括提供乳基作为基质，向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，在存在乳酸和蔗糖的情况下用克鲁维毕赤酵母发酵所述基质。
本文提供了从植物乳基生产发酵乳制品类似产品的方法，包括提供乳基作为基质，向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，在存在乳酸和果糖的情况下用克鲁维毕赤酵母发酵所述基质。
本文提供了从植物乳基生产发酵乳制品类似产品的方法，包括提供乳基作为基质，向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，在存在乳酸和葡萄糖的情况下用克鲁维毕赤酵母发酵所述基质。
“植物乳”是源自植物来源的类似于乳(有时也称为仿乳)的产品的总称。这些乳类似物的功能特性、营养价值、脂肪和蛋白质的存在以及感官特征具有相似性，使它们可以用作动物乳的替代品。通常，通过以下制造植物乳：植物材料在水中提取，过滤出水提取物，然后进行均质化和热处理，以提高产品的悬浮性和微生物稳定性。
乳制品
在另一方面，本发明提供了从动物乳生产发酵乳制品的方法，包括提供乳基作为基质，向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，在存在乳酸和蔗糖的情况下用克鲁维毕赤酵母发酵所述基质。
在另一方面，本发明提供了从动物乳生产发酵乳制品的方法，包括提供乳基作为基质，向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，在存在乳酸和果糖的情况下用克鲁维毕赤酵母发酵所述基质。
在另一方面，本发明提供了从动物乳生产发酵乳制品的方法，包括提供乳基作为基质，向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，在存在乳酸和葡萄糖的情况下用克鲁维毕赤酵母发酵所述基质。
此类乳制品可以是克菲尔(kefir)。克菲尔是发酵乳饮品，起源于高加索山脉，由克菲尔“粒”(一种酵母/细菌发酵起子)制成。传统上，它通过用克菲尔粒接种奶牛、山羊或绵羊奶并在环境温度下发酵(通常过夜)进行制备。乳糖发酵产生酸味、碳酸味、微酒精饮品，其稠度和味道类似于稀酸奶。碳酸盐和酒精主要由酵母产生。如今，克菲尔每年通过超过100项创新来占领新市场，并且公司需要现代解决方案在标准流程中生产克菲尔，而不使用谷物和具有极少量的气体以避免吹瓶。然而，在一些国家，酵母是法律规定所必需的。
已经发现，克鲁维毕赤酵母可以有利地用于制备具有良好感官特性和高细胞计数的乳制品，这些乳制品在保质期期间可以满足法律要求(例如，根据CODEX STAN 243-2003，克菲尔产品>104cfu/g)。对于在低温(<7℃)下储存并在第2、3、4或5周分析的此类产品，可以看到效果。特别是当发酵基中使用果糖、葡萄糖或蔗糖时，与其他类型的糖相比，可以保持高酵母细胞数。
起子培养物组合物
本发明还提供了起子培养物组合物，其包含克鲁维毕赤酵母和至少一种乳酸菌菌株。菌株可以是乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacteriumspp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、乳球菌属物种(Lactococcus spp.)、片球菌属物种(Pedicoccus spp.)、明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)、酒球菌属物种(Oenococcus spp.)中的一种。
起子培养物组合物可以任选地包含选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物。
微生物的协同作用可以对发酵食品的风味特征以及醇含量产生积极影响。与单独使用克鲁维毕赤酵母相比，可以观察到改善。
在其他方面，本发明还提供了发酵食品，例如乳制品和乳制品类似产品。本文描述的产品包含克鲁维毕赤酵母和乳酸菌，包括本申请中描述的克鲁维毕赤酵母菌株1、2和3。此类产品可以通过本申请中描述的方法获得。
定义
在更详细地概述本发明之前，首先定义一组术语和约定：
除非特别说明，否则术语“乳”以广义使用，包括动物乳和植物乳。
乳基可包括但不限于包含蛋白质的任何乳或乳样产品的溶液或悬浮液，例如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原奶粉、炼乳、奶粉。
如本文所用，术语“乳制品类似物”是指乳制品样产品，其是用作乳制品的烹饪替代品的产品，在制备过程中一种或多种乳成分已被其他成分替代，并且所得食物类似于原始产品。乳成分完全或基本上被植物材料替代，例如，使用源自豆类(例如大豆)、坚果(例如扁桃仁、腰果、椰子)、谷物例如(燕麦、稻、玉米或小麦)的植物基乳。这种由植物材料制备的植物基乳在本文中被称为“植物乳”或“植物乳基”。
需要注意的是，本文中使用的“乳制品类似物”、“植物乳”或“植物乳基”并不是指酒精饮品，或者一般意义上的水果和蔬菜汁，因为此类饮品通常不被视为乳制品的烹饪替代品。
豆类
术语“豆类”是指属于豆科(Fabaceae)植物的任何植物。豆科植物是庞大且经济上重要的开花植物科，俗称豆科(legume family)、豌豆科、菜豆科或豆科(pulse family)。可以食用各种不同的豆类。豆类通常具有豆荚或外壳，当豆类的种子成熟时，豆荚或外壳沿着两条缝打开。豆科植物包括超过750个属和16,000至19,000个种。
“豆类”的实例包括花生(落花生(Arachis hypogaea))、木豆(木豆(Cajanuscajan))、鹰嘴豆(鹰嘴豆(Cicer arietinum))、大豆(大豆(Glycine max))、小扁豆(兵豆(Lens culinaris))、羽扇豆(羽扇豆属物种(Lupinus spp.))、豌豆(豌豆(Pisumsativum))、紫花豌豆(紫花豌豆(Pisum arvense))、菜豆(菜豆属物种(Phaseolus spp.))、普通豆类(四季豆(Phasoolus vulgaris))及其各种栽培品种和变种、野豌豆(野豌豆属物种(Vicia spp.))、蚕豆(蚕豆(Vicia faba))、菜豆(豇豆属(Vigna spp.))、豇豆(豇豆(Vigna unguiculata))、红豆(赤豆(Vigna angularis))和班巴拉豆(班巴拉豆(Voandzeiasubterranea))。
坚果
如本文所用，术语“坚果”可以是来自树或灌木的真正的坚果或烹饪用坚果，其可以是核果或坚果样种子。在植物学术语中，坚果是干燥的单种子果实，其不开裂(即成熟时不沿着明确的缝裂开)。真正的坚果的实例包括橡子(栎属物种(Quercus spp.)、石栎属物种(Lithocarpus spp.)和青冈属物种(Cyclobalanopsis spp.))、栗子(栗属物种(Castanea spp.))、榛子(榛属物种(Corylus spp.))和山毛榉坚果(山毛榉属物种(Fagusspp.))。
烹饪坚果是指那些在植物学上不属于坚果，但具有相似外观和烹饪作用的坚果。许多烹饪坚果是核果的种子，在本文中称为核果坚果。核果是不开裂的果实，其中外部肉质部分围绕单壳(核(pit)或核(stone))硬化的内果皮，内有种子。核果坚果是核果的种子。烹饪坚果的实例包括核果种子，例如腰果(腰果(Anacardium occidentale))、开心果(开心果(Pistacia vera))、扁桃仁(扁桃(Prunus dulcis))、核桃(核桃属物种(Juglans spp.))、山核桃(山核桃属物种(Carya spp.))和椰子(腰果(Anacardium occidentale))。其他烹饪坚果包括巴西坚果(巴西坚果(Bertholletia excelsa))和澳洲坚果(澳洲胡桃属物种(Macadamia spp.))。一些烹饪坚果是裸子植物的种子，例如松子(松属物种(Pinus spp.))和银杏(银杏(Ginkgo biloba))。
谷物
术语“谷物”是指真正的谷物和假谷物。真正的谷物是指禾本科植物的种子。真正的谷物的实例包括燕麦(燕麦(Avena sativa))、黑麦(黑麦(Secale cereale))、稻(稻属物种(Oryza spp.)，例如稻(Oryza sativa))、高粱(高粱属物种(Sorghum spp.)，例如双色高粱(Sorghum bicolor))、黑小麦(黑小麦属(Triciale))、黍类(例如龙爪稷(龙爪稷(Eleusine coracana))、谷子(谷子(Setaria italica))、黄小米(鸭乸草(Paspalumscrobiculatum))、糜子(糜子(Panicum miliaceum))、稗子(稗属物种(Echinochloaspp.)))、福尼奥米(福尼奥小米(Digitaria exilis))、苔麸(苔麸(Eragrostis tef))、大麦(大麦(Hordeum vulgare))、玉米(玉米(Zea mays))和小麦(小麦属物种(Triticumspp.))(例如普通小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、硬粒小麦(硬粒小麦(Triticumdurum))、密穗小麦(密穗小麦(Triticum compactum))、高拉山小麦(东方小麦(Triticumturanicum))和斯佩耳特小麦(斯佩耳特小麦(Triticum spelta)))。
假谷物是不属于禾本科的植物的种子，但其使用方式与谷物大致相同。假谷物的实例包括藜麦(藜麦(Chenopodium quinoa))、荞麦(荞麦(Fagopyrum esculentum))、苋菜(三色苋(Amaranthus tricolor))、面包坚果(面包坚果(Brosimum alicastrum))和金合欢种子(金合欢属物种(Acacia spp.))。
动物乳
术语“动物乳”应理解为通过挤奶任何哺乳动物(例如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)而获得的乳汁分泌物。动物乳基可以从任何生的和/或经加工的动物乳材料以及从复原动物奶粉获得。优选由奶牛的乳或乳成分制备的动物乳基。在一些优选的实施方案中，动物乳是从奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼获得的巴氏杀菌乳。
乳基可以包括但不限于包含蛋白质的任何乳或乳样产品的溶液或悬浮液，例如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原奶粉、炼乳、奶粉。
乳基可以是可以在乳中发现的蛋白质的溶液或悬浮液，所述蛋白质例如乳清蛋白、酪蛋白或其混合物。乳清蛋白的实例包括β-乳球蛋白、α-乳清蛋白或其混合物。酪蛋白的实例包括α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白或其混合物。
“基质”是由克鲁维毕赤酵母发酵的材料。
在本申请的上下文中，术语“乳酸菌”用于指产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的食品级细菌。这些细菌因其共同的代谢和生理特征而相关，通常为革兰氏阳性、低GC、耐酸、不形成孢子、不呼吸、杆状杆菌或球菌。乳酸菌代表一组微生物，它们由其在发酵过程中产生乳酸的能力而在功能上相关。
发明人发现，在发酵阶段期间，这些细菌不仅能够形成克鲁维毕赤酵母可用于维持生长的乳酸，它们还有助于克鲁维毕赤酵母的香味形成和低乙醇产生。
用于制备发酵产品的乳酸菌涵盖但不限于属于以下属的细菌：乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、乳球菌属物种(Lactococcus spp.)、片球菌属物种(Pedicoccusspp.)、明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)、酒球菌属物种(Oenococcus spp.)。实例包括但不限于德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)。
在其他实施方案中，乳酸菌菌株是嗜热链球菌。
起子培养物中菌株的具体选择将取决于待制造的发酵产品的特定类型。
本文中的术语“无醇”是指含量小于0.5％(wt)或5000ppm。
在“醇产生”或“醇形成”的背景下，术语“减少”是指与单独使用克鲁维毕赤酵母相比，对于使用克鲁维毕赤酵母和乳酸菌制备的相同产品，更低的乙醇产生。
术语“改善(产品)的风味”是指使产品更适口。这可以例如通过本领域技术人员已知的感官评估来确定。
术语“酸奶类似物”是指其是乳制品酸奶的烹饪替代品的产品。典型的乳制品酸奶产品的制备涉及使用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的共生培养物。当根据本发明制备酸奶类似物时，使用这些培养物中的一种或两种将有利地释放对克鲁维毕赤酵母有用的乳酸和/或碳水化合物。
术语“突变体”应理解为通过例如基因工程、辐射和/或化学处理的方式源自本发明的克鲁维毕赤酵母的菌株。优选突变体是功能等同的突变体，例如与母菌株具有基本上相同或改善的特性的突变体。在本文中，本发明的突变体优选为在香味形成方面具有相同或改善的特性的突变体。此类突变体是本发明的一部分。突变体可以是通过对本发明的菌株进行任何常规使用的诱变处理而获得的菌株，该诱变处理包括用化学诱变剂(例如乙烷甲磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG))处理、UV光或自发发生的突变体。突变体可能已经历数次诱变处理(单次处理应该被理解为一个诱变步骤随后是筛选/选择步骤)，但目前优选进行不超过1000、不超过100、不超过20、不超过10次或不超过5次处理。在目前优选的突变体中，与母体菌株相比，细菌基因组中少于5％或少于1％或甚至少于0.1％的核苷酸已被改变(例如通过替换、插入、缺失或其组合)。
附图说明
图1显示了在30℃下用克鲁维毕赤酵母发酵的大豆样品的发酵特征。
图2显示了在6℃下储存1天后用克鲁维毕赤酵母发酵的大豆样品中的克鲁维毕赤酵母细胞计数(cfu/g)。
图3显示了在6℃下储存1天后用克鲁维毕赤酵母发酵的大豆样品中的乙醇水平(ppm)。
图4显示了在6℃下储存1天后用克鲁维毕赤酵母发酵的大豆样品中的克鲁维毕赤酵母细胞计数(cfu/g)。
图5显示了用克鲁维毕赤酵母和乳酸菌发酵的大豆样品的描述性感官评估(*＝统计显著属性)的蜘蛛图。
图6显示了用克鲁维毕赤酵母和乳酸菌发酵的大豆样品中存在的乙酸丙酯(S/N)的水平。
图7显示了用克鲁维毕赤酵母或汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)发酵的椰子、大豆和燕麦样品的发酵时间(h)。
图8显示了用克鲁维毕赤酵母或汉逊德巴利酵母发酵的椰子、大豆和燕麦样品中的乙醇水平(ppm)。
图9显示了用克鲁维毕赤酵母或汉逊德巴利酵母发酵的椰子、大豆和燕麦样品中的乙醇水平(ppm)。
图10显示了用克鲁维毕赤酵母或汉逊德巴利酵母发酵的椰子、大豆和燕麦样品中的乙醇水平(ppm)。
图11显示了用LAB起子培养物和相应酵母发酵的克菲尔样品中的克鲁维毕赤酵母和汉逊德巴利酵母细胞计数(cfu/g)。样品在6℃下储存，在第0天、第1天、第7天、第15天和第28天测量细胞计数。
具体实施方式
本发明涉及使用酵母发酵食品。酵母是真核微生物，其生存在各种生态位，例如水、土壤、空气以及植物和水果的表面。通常，它们存在于成熟果实的分解过程中并参与发酵过程。在这种自然环境中，酵母寻找其新陈代谢和发酵活性所必需的营养物质和基质。
酵母分为两大类，即酵母属(Saccharomyces)和非酵母属。关于它们的新陈代谢，酵母通常以发酵广谱糖类为特征，其中包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖。酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)是研究最多的物种，由于其出色的发酵能力、快速生长和易于适应，因此在葡萄酒和啤酒的发酵中应用最多。非酵母属酵母是一组具有特定代谢特征和在发酵过程中使用的高潜力的遗传多样性微生物。
酵母属和非酵母属酵母共享碳的中心代谢的共同途径。两组均通过糖酵解代谢葡萄糖。然而，参与调节呼吸发酵代谢的机制在不同的酵母中可存在显著差异(Flores等人,“非常规酵母中碳水化合物和能量产生代谢(Carbohydrate and energy-yieldingmetabolism in non-conventional yeasts)”,FEMS微生物学综述(FEMS microbiologyreviews)24.4(2000)；507-529)。
本发明的关键发酵微生物克鲁维毕赤酵母是已用于啤酒发酵的非酵母属酵母。专利WO2014135673(Chr.Hansen A/S，丹麦)公开了使用该酵母发酵麦芽汁得到低度啤酒。如所公开，克鲁维毕赤酵母仅使用麦芽汁中的葡萄糖并且能够将这种基质转化成高浓度的特定风味化合物。发酵产物含有风味化合物乙酸异戊酯，其是啤酒中的关键风味。
WO2020/035268A1(Chr.Hansen A/S，丹麦)公开了使用克鲁维毕赤酵母来减少由土臭素引起的泥土味，土臭素是根茎类蔬菜汁中的典型化合物。
这些专利均未描述乳制品或乳制品类似产品的发酵或如何进一步修饰克鲁维毕赤酵母所使用的基质以进行改进。
本发明适用于制备发酵食品，其中发酵以受控方式进行，即具有确定的接种物和加工条件。这与自发发酵形成对比，在自发发酵中允许发酵通过未限定的环境野生微生物自然发生。自发发酵产生不一致的结果，并且经常导致腐败、异味或形成乙醇的非期望缺点。
本发明基于出乎意料的发现，即克鲁维毕赤酵母能够在乳酸上生长，但不形成香味，并且为了允许香味发展，必须同时使用乳酸菌和特定碳水化合物的组合。进一步发现，在存在蔗糖、果糖和葡萄糖的情况下与乳酸菌共发酵可允许风味发展和/或减少乙醇形成，其中蔗糖和果糖产生甚至更好的结果。
此外，使用本文所述的发明可以检测样品中乙酸丙酯的形成，当使用果糖时观察到最高量。这之前尚未结合克鲁维毕赤酵母进行过描述。
关于糖发酵，克鲁维毕赤酵母不能利用蔗糖，但能利用果糖或葡萄糖。在果糖或葡萄糖方面，出乎意料地发现，虽然克鲁维毕赤酵母在存在果糖或葡萄糖的情况下能生长，但除非还存在乳酸菌，否则不形成香味。因此，香味形成需要添加乳酸菌。酵母生长本身并不一定表明香味形成。如前所述，克鲁维毕赤酵母能够在存在果糖和葡萄糖的情况下生长，但不能合成风味化合物。因此，发明人首次确定使用克鲁维毕赤酵母组合乳酸菌以及碳水化合物蔗糖、果糖和/或葡萄糖作为补充基质用于共培养，导致克鲁维毕赤酵母形成香味的协同效应。现有技术之前对此尚未进行描述或启示。
在第一方面，本发明提供了克鲁维毕赤酵母、乳酸菌以及选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物用于增加发酵食品(包括乳制品和乳制品类似产品)的香味的用途。优选地，碳水化合物是蔗糖或果糖。
本文还提供了克鲁维毕赤酵母、乳酸菌以及选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物用于制备发酵食品(包括乳制品和乳制品类似产品)的用途。
在一些实施方案中，碳水化合物在发酵之前、发酵开始时或发酵过程中添加。表述“在发酵开始时”意指在将克鲁维毕赤酵母添加到乳基之前不久、同时或之后不久。此处，术语“不久”意指小于30分钟。表述“在发酵过程中”意指在发酵开始之后和发酵结束之前的、发酵过程中的任何时间。
在一些实施方案中，在发酵之前添加包含至少一种克鲁维毕赤酵母菌株、至少一种乳酸菌菌株以及任选的蔗糖、果糖和/或葡萄糖的组合物。
优选地，乳酸菌是同型发酵乳酸菌。本领域已知同型发酵乳酸菌产生乳酸作为主要代谢物。同型发酵细菌可以选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和片球菌属。
在一个实施方案中，本发明提供了用于生产发酵食品的方法，包括：
-提供基质，其是可以是植物乳基和/或动物乳基的乳基
-向基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株(例如DSM 28484)和至少一种乳酸菌菌株，所述乳酸菌菌株任选地是同型发酵乳酸菌菌株，所述基质任选地由豆类、坚果或谷物制备
-在存在选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物的情况下发酵所述基质，优选直至pH低于4.6，
-获得发酵食品。
在本申请的后面部分中更详细地描述了此类组合物。
优选的克鲁维毕赤酵母包括克鲁维毕赤酵母菌株1(DSM 28484)、克鲁维毕赤酵母菌株2(PK-KR1)和克鲁维毕赤酵母菌株3(PK-KR2)，以及可从其获得的突变体。
克鲁维毕赤酵母PK-KR1是已知的，并且根据布达佩斯条约于2006年8月24日由奥克兰大学生物科学学院(奥克兰1142，新西兰)保藏于国家计量研究所(541-65克拉克街，南墨尔本，维多利亚州3205，澳大利亚)，并被给予保藏号V06/022711。
克鲁维毕赤酵母PK-KR 2是已知的，并且根据布达佩斯条约于2006年8月24日由奥克兰大学生物科学学院(奥克兰1142，新西兰)保藏于国家计量研究所(541-65克拉克街，南墨尔本，维多利亚州3205，澳大利亚)，并被给予保藏号V06/022712。
为了实施本发明的方法，提供合适的起始材料。这可以是动物来源的乳基，例如牛奶。在一些实施方案中，可以使用由植物材料制备的乳基。这在本文中被称为“植物乳”或“植物乳基”。植物乳是由溶解和分解的植物成分组成的胶体悬浮液或乳液。总体的制备大纲非常相似。它们大多是通过将原料研磨制成浆料，然后通过过滤去除粗颗粒进行制备。对于大规模生产，可以将植物材料浸泡并湿磨以提取植物乳，或者将原料干磨并在水性介质中提取可溶性物质。通过过滤或倾析分离不溶性物质，然后添加期望的成分以获得可接受的产品制剂。通常进行均质化和巴氏灭菌/UHT处理以提高悬浮性和稳定性。5-20μm范围内的粒径分布将在外观和稠度方面模拟牛奶。
根据植物类型，对原料进行预处理。有时优选或需要使用如脱壳、浸泡和热烫等技术。例如，热烫可以使在豆乳和花生乳中产生异味的胰蛋白酶抑制剂和脂氧合酶失活。另一个实例，原料的烘烤通常可以增强最终产品的香味和风味。
制备植物乳例如花生乳、稻乳、燕麦乳、芝麻乳、椰乳、扁桃仁乳、大麻乳、榛子乳、油莎豆(tiger nut)乳、羽扇豆乳和藜麦乳等的方法是已知的(例如，Sethi等人“植物基乳替代品是功能性饮品的新兴部分：综述(Plant-based milk alternatives an emergingsegment of functional beverages:a review).”食品科学与技术杂志(Journal of foodscience and technology)53.9(2016):3408-3423)。
在优选的实施方案中，植物乳包含至少1％蛋白质，例如至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％或至少7％蛋白质。
在优选的实施方案中，植物乳包含至少2％脂肪，例如至少3％、至少4％、至少5％、至少6％或至少7％脂肪。
蛋白质和/或可能已经固有存在于植物乳中或在加工过程中补充。
豆类
本发明特别适用于豆类发酵。优选的豆类包括大豆、豌豆、菜豆、羽扇豆、小扁豆。优选地，豆类是大豆。发明人观察到，由大豆制成的发酵基几乎不含碳水化合物，因此对于克鲁维毕赤酵母发酵是不良基质。因此，应针对克鲁维毕赤酵母发酵对基料进行改良。
发明人还观察到，克鲁维毕赤酵母在发酵豆乳时仅产生非常微量的醇，这使其理想用于其中乙醇产量应最少的乳制品类似物。在优选的实施方案中，食品是豆类基乳制品替代产品，例如大豆酸奶类似物。
在优选的实施方案中，发酵乳制品或乳制品类似产品的醇含量小于5000ppm，例如小于4000ppm，例如小于3000ppm，例如小于2000ppm，例如小于1000ppm，例如小于900ppm，例如小于800ppm，例如小于700ppm，例如小于600ppm，例如小于500ppm。
由豆乳制备的乳制品类似物已为人所知一段时间。然而，它始终面临着豆腥味的挑战，这是西方消费者所不熟悉的并且是消费的障碍。本发明人发现，使用克鲁维毕赤酵母可以大大改善大豆基乳制品类似物的风味和味道，如果补充适当的基质，则产生更多的香味。在其他植物乳(例如坚果基植物乳和谷物基植物乳)以及乳制品中也发现了香味的形成。
本申请提供了从大豆材料制备发酵食品的方法。例如，可以提供豆乳作为起始材料。豆乳已被广泛消费并且制备方法是本领域技术人员已知的。例如，在Shurtleff,William和Akiko Aoyagi.豆腐和豆乳生产：工艺和技术手册.第2卷.大豆信息中心,2000(Tofu&Soymilk production:A Craft and Technical Manual.Vol.2.Soyinfo Center,2000)的第5章和第11章中对它们进行了描述。豆乳通常通过以下进行制作：浸泡大豆，研磨浸泡的大豆以获得浆料，过滤浆料以获得豆乳。可以在蒸煮之前或之后从浆料提取豆乳。
目前已知的去除豆腥味的方法包括：1)高温真空处理，导致大部分挥发性化合物脱离，2)热磨法，其中将浸泡的大豆在80℃的温度下用沸水或蒸汽研磨以获得浆料，然后在该温度下保持10min以使脂氧合酶失活，以及3)预热烫法，其中将浸泡的大豆在沸水中热烫以使脂氧合酶失活。本发明代表了改善源自植物材料的发酵产品的感官特性的替代策略。
在其他优选的实施方案中，豆类来源为花生并且发酵基为花生乳。花生乳可以通过湿法研磨和包括脱脂、烘烤、碱浸泡、蒸煮等技术获得，如下所述：Lee等人“受加工条件影响的花生乳的化学、物理和感官特性(Chemical,physical and sensory characteristicsof peanut milk as affected by processing conditions).”食品科学杂志(Journal ofFood Science)57.2(1992):401-405，Diarra等人“花生乳和花生乳基产品生产：综述(Peanut milk and peanut milk based products production:a review).”食品科学与营养的关键综述(Critical reviews in food science and nutrition)45.5(2005):405-423，以及Galvez等人“花生饮品加工优化(Optimization of Processing of PeanutBeverage).”感官研究杂志(Journal of Sensory Studies)5.1(1990):1-17。
坚果
本发明特别适用于发酵由坚果制备的植物材料。本文提供了从坚果获得发酵乳制品类似产品的方法，包括提供包含源自坚果的植物材料的基质，在存在乳酸以及选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物的情况下用克鲁维毕赤酵母发酵该基质。
在优选的实施方案中，由坚果制备的植物乳被用作起始材料。优选的坚果包括椰子、扁桃仁、腰果(cash)和核桃。坚果乳具有低升糖指数的健康脂肪酸和碳水化合物，以及维生素、抗氧化剂和膳食纤维成分的特征。它可能由杏仁、腰果、椰子等制成。
优选地，植物材料是由椰肉制备的椰乳或椰奶油。椰乳是固体椰子胚乳的水提取物，其可以任选地包括一些椰子水。它是白色、不透明的蛋白质-油-水乳液，通过压榨磨碎或粉碎的固体椰子胚乳获得。制备方法是已知的，例如，如Cancel,L.E.“椰子食品和基质(Coconut food products and bases)”Woodroof,JG Coconuts(1970)中所述。Seow等人“椰乳：化学和技术(Coconut milk:chemistry and technology).”国际食品科学与技术杂志(International journal of food science&technology)32.3(1997):189-201综述了提取过程。椰奶油比椰乳含有更少的水，而更高的脂肪含量赋予其光滑、浓稠和丰富的稠度。
通常，将蛋白质添加到含有椰乳的发酵基中，并且在许多情况下，使用豌豆蛋白质或蚕豆蛋白质。这可能导致非期望的豆腥味，这是消费的障碍。
本发明人发现椰子基乳制品类似产品的风味和味道可以通过使用克鲁维毕赤酵母来改善，其中产品被认为比用克菲尔酵母制备的样品更芳香(实施例4)。
在优选实施方案中，发酵食品是坚果基乳制品替代产品，例如椰子酸奶类似物。
在其他实施方案中，可以从扁桃仁制备坚果乳。与大豆乳一样，扁桃仁乳是浓郁的乳脂样的乳样的白色液体，其在外观和稠度上与牛奶相似。它是营养丰富的产品，并且是α-生育酚形式的维生素E和锰的优质来源。扁桃仁乳可以例如通过在水中浸泡、湿磨和过滤浆料从去壳扁桃仁中提取而获得。制备扁桃仁乳的方法是本领域技术人员已知的，例如，如美国专利号5656321中所描述。通常进行均质化，例如，如Briviba等人“扁桃仁乳的超高压均质化：物理化学和生理效应(Ultra high pressure homogenization of almond milk:Physico-chemical and physiological effects).”食品化学(Food Chemistry)192(2016):82-89中所述。
谷物
本发明也可用于谷物的发酵。本文提供了从谷物获得发酵乳制品类似产品的方法，包括提供包含源自谷物的植物材料的基质，在存在乳酸和选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物的情况下用克鲁维毕赤酵母发酵该基质。
优选的谷物包括燕麦、小麦、黑麦和黍类。更优选地，谷物是燕麦。
本发明人发现谷物基乳制品类似物的风味和味道可以通过使用克鲁维毕赤酵母和乳酸菌来改善，其中使用本文提供的合适的碳水化合物产生更多香味。
在优选的实施方案中，食品是谷物基乳制品替代产品，例如燕麦酸奶类似物。
优选地，用作起始材料的植物材料是燕麦乳。燕麦乳具有类似于牛奶的乳脂样质地。制备燕麦乳的方法是已知的，例如，如Deswal等人“使用响应曲面法优化燕麦乳的酶法生产工艺(Optimization of enzymatic production process of oat milk usingresponse surface methodology).”食品和生物加工技术(Food and bioprocesstechnology)7.2(2014):610-618和美国专利号5686123中所描述。由于淀粉构成燕麦的主要部分，加热后，淀粉开始糊化并且液态乳趋于达到凝胶状稠度，粘度高，导致其可接受性较低。酶促水解(例如，使用α淀粉酶)通常用于防止热处理过程中的糊化，并提供葡萄糖以增加甜味感。
根据本发明的方法包括向基质添加克鲁维毕赤酵母和一种或多种乳酸菌。应当理解，可以添加一种或多种克鲁维毕赤酵母菌株，例如2、3、4、5种或更多种菌株。如本文所用，术语“菌株”具有其在微生物学领域中的常见含义并且是指酵母或细菌的遗传变体。如本文所用，克鲁维毕赤酵母菌株是指克鲁维毕赤酵母的遗传变体，其可由技术人员基于基因组成确定。
同样，应当理解可以添加一种或多种乳酸菌菌株，例如2、3、4、5种或更多种菌株。
将微生物以足以引发和维持发酵的量添加到基质中。技术人员能够使用常规方法并鉴于当前的描述和实例来确定合适的接种浓度。
在优选的实施方案中，克鲁维毕赤酵母以至少1×104CFU/ml，例如至少5×104CFU/ml，例如至少1×105CFU/ml，例如至少5×105CFU/ml，例如至少1×106CFU/ml，例如至少5×106CFU/ml的浓度接种。
在优选的实施方案中，乳酸菌以至少1×104CFU/ml，例如至少5×104CFU/ml，例如至少1×105CFU/ml，例如至少5×105CFU/ml，例如至少1×106CFU/ml，例如至少5×106CFU/ml的浓度接种。
此外，添加的克鲁维毕赤酵母和乳酸菌可以是冷冻的、液体的或干燥的形式，包括例如冻干形式和喷雾/流化床干燥形式，或冷冻或冻干浓缩物。
在优选的实施方案中，克鲁维毕赤酵母细胞可以是水合的或脱水的。水合细胞的实例包括面包酵母饼、压缩酵母和酵母乳。脱水细胞的实例包括速溶干酵母、活性干酵母(ADY)和部分干燥的压缩酵母。
术语“压缩酵母”在本文中是指干物质含量为35％至90％(w/w)的酵母，其通常通过以下生产：在发酵罐中繁殖酵母，然后浓缩、过滤、挤出和任选地在干燥机(例如流化床干燥机)上部分干燥。在一些实施方案中，干物质含量为30％至45％，例如30％至40％或35％至45％。
术语“酵母乳”在本文中是指干物质含量低于28％(w/w)的液体酵母，其通常通过在发酵罐中繁殖酵母然后通过离心浓缩进行生产。
术语“活性干酵母”或“ADY”在本文中是指干物质含量超过90％(w/w)的酵母，其通常通过以下生产：在发酵罐中繁殖酵母，然后浓缩、过滤、挤出并在流化床干燥机上干燥。
因此，术语“部分干燥的压缩酵母”在本文中是指干物质含量为45％至90％(w/w)的酵母，其通过以下生产：在发酵罐中繁殖酵母，然后浓缩、过滤、挤出和在干燥机(例如流化床干燥机)上部分干燥。
根据本发明的方法包括发酵含有克鲁维毕赤酵母和乳酸菌的基质的步骤。基质的发酵优选通过在无菌环境中的受控发酵来进行。在发酵过程中，本领域技术人员能够调整他已知的其他发酵参数以获得期望的终产物。
克鲁维毕赤酵母发酵基质的特征在于存在乳酸和选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物。实施方案包括但不限于，1)一种或多种乳酸菌菌株和蔗糖，2)一种或多种乳酸菌菌株和果糖，和3)一种或多种乳酸菌菌株和葡萄糖，以及4)一种或多种乳酸菌菌株和以下至少两种或全部的混合物：蔗糖、果糖和葡萄糖。
可以直接提供果糖和葡萄糖，也可以间接提供合适的糖类供乳酸菌菌株代谢，从而提供果糖和葡萄糖。这可以根据乳酸菌的发酵特征来选择。
发明人表明克鲁维毕赤酵母在发酵培养基中不需要大量的糖类来形成香味，如实施例3所示。
优选地，发酵基包含约1-10％(wt)的蔗糖、果糖和葡萄糖。在这方面，已观察到大量葡萄糖可能对酵母生长造成压力。因此，优选葡萄糖浓度低于20％，例如低于15％或低于10％(wt)。
乳酸菌和碳水化合物可以在发酵前、发酵开始时或发酵过程中添加。在一些实施方案中，它们在发酵开始之前或开始时添加，优选地作为起子培养物组合物一起添加。
之后，将发酵基置于合适的条件下，并且发酵工艺开始并持续一段时间。本领域普通技术人员知晓如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧气和工艺时间。
发酵可以在20-38℃的温度下进行。在优选的实施方案中，发酵在22至35℃的温度下进行，例如25-32℃之间，例如28-30℃。在一些优选的实施方案中，发酵温度为23-26℃。
使用克鲁维毕赤酵母的发酵条件可以是半厌氧的。发酵以有氧方式开始，并在所有氧气消耗后以厌氧方式进行。使用克鲁维毕赤酵母的发酵条件也可以是有氧的。技术人员可以选择适合预期产品类型的条件。
高于4.6的pH可被认为对发酵食品不安全。使用本发明的方法，在很短的时间内，可以达到低于5的pH，例如pH 4.6或更低。优选地，使用克鲁维毕赤酵母和乳酸菌的发酵进行12小时，例如18小时，例如24小时，例如36小时，例如48小时。
在一个实施方案中，乳酸和果糖均存在于发酵基中。果糖可以通过直接或间接提供，例如通过向基质添加至少一种乳酸菌菌株和蔗糖并发酵基质，其中所述乳酸菌菌株能够利用构成蔗糖部分的葡萄糖，并释放果糖。
技术人员能够基于其糖发酵模式来选择合适的乳酸菌，可以用本领域已知的方法确定糖发酵模式。LAB菌株之间对糖需求的差异已用于计数、选择和鉴定(Kandler,O.和N.Weiss“常规无孢子革兰氏阳性杆菌.第14节载于：Garrity,G.(编辑)Bergey的系统手册细菌学(Regular nonsporing Gram positive rods.Section 14In:Garrity,G.(Ed)Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology).”Springer,New York 2(1986):1208-1260，并且由Kandler“乳酸菌中的碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism in lacticacid bacteria).”Antonie van Leeuwenhoek 49.3(1983):209-224综述)。通常，通过来自生长培养基中给予的糖的酸形成来检测糖发酵。
在其他实施方案中，植物材料经处理以提供果糖和/或葡萄糖，例如通过酶促水解。
在一个实施方案中，乳酸和葡萄糖均存在于发酵基中。葡萄糖可以通过直接或间接提供，例如通过向基质添加至少一种乳酸菌菌株和蔗糖并发酵基质，其中乳酸菌菌株能够利用构成蔗糖部分的果糖，并释放葡萄糖。
可以通过本领域已知的任何合适的方法终止发酵，包括冷却，优选地低于4℃。任选地，可以对终产品进行巴氏灭菌以延长保质期。
进一步发现，乳酸菌和果糖或葡萄糖的组合可以导致乙酸丙酯的最高形成，特别是在豆乳中。乙酸丙酯是以其令人愉悦的苦甜味而闻名的化合物，稀释后令人联想到梨(Burdock,G.A.(编辑).Fenaroli的风味成分手册(Fenaroli's Handbook of FlavorIngredients).第6版.Boca Raton,FL 2010,p.1739)。
在还一方面，本发明提供了酵母发酵的乳制品或乳制品类似产品。根据本发明制备的产品具有改善的风味特征并且包含克鲁维毕赤酵母和乳酸菌。可以使用克鲁维毕赤酵母菌株1(DSM 28484)、克鲁维毕赤酵母菌株2(PK-KR1)、克鲁维毕赤酵母菌株3(PK-KR2)、或其突变体或任何其组合。克鲁维毕赤酵母菌株PK-KR1和PK-KR2最初公开于WO2009110807，其中描述了它们可用于提高葡萄酒发酵过程中的硫醇水平(3MH和3MHA)。PK-KR1和PK-KR2还与不同的啤酒花品种一起用于酿造啤酒(WO2013030398)以及低醇或无醇啤酒(WO2014135673)。
此外，使用本文公开的方法，获得具有高粘度的乳制品类似产品是可能的。如果使用的乳基富含脂肪，可以观察到更高的粘度。例如，由大豆和燕麦制成的酸奶类似物具有至少约30-40Pa的粘度。对于椰子酸奶类似物，可以获得超过100Pa或甚至200Pa的粘度。
起子培养物组合物
本发明还提供了起子培养物组合物，其包含至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，例如至少2种、至少3种、至少4种或至少5种菌株。术语“起子培养物”是指包含活微生物的组合物，所述活微生物能够在单独的起子培养基中培养后引发或影响生物材料发酵以获得高密度培养物。
发明人发现，与单独使用克鲁维毕赤酵母相比，在存在某些碳水化合物的情况下这些微生物之间的协同作用对发酵食品的风味特征有积极贡献。
酵母和细菌可以作为冷冻或冻干培养物提供，用于批量起子繁殖，也可以作为所谓的“直投式”(DVS)培养物提供，用于直接接种到发酵容器或发酵罐中以生产发酵产品，例如发酵乳制品或乳制品类似产品。起子培养物组合物优选为冷冻、干燥或冷冻干燥的形式，例如作为直投式(DVS)培养物。然而，该组合物也可以是在将冷冻的、干燥的或冷冻干燥的细胞浓缩物悬浮于液体介质(例如水或PBS缓冲液)中之后获得的液体。当本发明的组合物是悬浮液时，活细胞的浓度在每ml组合物104至1012cfu(菌落形成单位)的范围内，包括每ml组合物至少104cfu，例如至少105cfu/ml，例如至少106cfu/ml，例如至少107cfu/ml，例如至少108cfu/ml，例如至少109cfu/ml，例如至少1010cfu/ml，例如至少1011cfu/ml。
包含酵母的不同形式的起始培养物的制备是本领域已知的并且例如在WO2011/134952(Chr.Hansen A/S)中描述。克鲁维毕赤酵母可以在发酵罐中生长并浓缩。此外，可以添加冷冻保护剂以维持酵母在低温下的活力。可以包括缓冲剂和生长刺激营养物质、防腐剂或本领域已知的其他载体。
在优选的实施方案中，起子培养物包含至少104CFU/g菌落形成单位(CFU)/g克鲁维毕赤酵母，例如至少105CFU/g，例如至少106CFU/g，例如至少107CFU/g，例如至少108CFU/g，例如至少109CFU/g，例如至少1010CFU/g，例如至少1011CFU/g，例如至少1012CFU/g，例如至少1013CFU/g。
在优选的实施方案中，起子培养物含有至少104菌落形成单位(CFU)/g乳酸菌，优选嗜热链球菌或乳杆菌属物种，例如至少105CFU/g，例如至少106CFU/g，例如至少107CFU/g，例如至少108CFU/g，例如至少109CFU/g，例如至少1010CFU/g，例如至少1011CFU/g，例如至少1012CFU/g，例如至少1013CFU/g乳酸菌。
在优选的实施方案中，本申请提供了起子培养物组合物，其包含克鲁维毕赤酵母和乳酸菌菌株以及选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的碳水化合物。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一(a/an)”和“所述”以及类似的指示物应被解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即意思是“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的列举仅旨在用作单独指代落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独的值均被并入说明书中，如同其在本文中被单独列举一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言均不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
保藏和专家解决方案
申请人要求在授予专利之日之前，只能向专家提供下述保藏微生物的样品。
申请人于2014年3月5日将克鲁维毕赤酵母菌株1保藏在莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ),布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)，并获得保藏号：DSM28484。
保藏根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的条件进行。
实施例
实施例1
样品制备
有机无糖大豆乳(NATURLI’Foods A/S，丹麦)用作起始材料。在存在添加的乳酸或乳酸菌(FDVS-YF-L01，含有嗜热链球菌；Chr.Hansen Denmark)的情况下添加不同量的葡萄糖(Cargill)、蔗糖(Nordic sugar)和果糖(Hamburg Fructose GmbH International)，如表1所示。选择的乳酸的量为0.5％，与LAB在植物基(例如大豆乳)中预期产生的乳酸的量相同。确定添加的葡萄糖、果糖和蔗糖的量，使得所有样品具有基于甜度指数等于5的相同的甜味感觉，其中蔗糖等于1，果糖等于1.65，以及葡萄糖等于0.69。在添加糖类和/或乳酸后对大豆乳进行巴氏杀菌(90℃，持续20分钟)以避免污染。然后将基质冷却至发酵温度30℃。以1×106cfu/g的量接种克鲁维毕赤酵母菌株1，并且在发酵开始时按照表1中所示的量接种乳酸菌。在本实施例中，发酵以5L规模进行。37.8h后，用有孔圆盘破碎凝结物。然后，冷却至25℃，然后进行机械后处理(2巴背压；FH Scandinox A/S，Tarm，丹麦)以允许平滑加工。将样品收集在120ml塑料杯中，并储存在6℃下以供进一步分析。
表1：实施例1的实验设计
发酵特征
使用Axone系统(
Sensors,Mettler Toledo)记录发酵特征。
克鲁维毕赤酵母计数
在YGC琼脂培养皿上通过扩散法进行克鲁维毕赤酵母计数。简言之，YGC琼脂在水浴中于99℃下融化45-55分钟，然后冷却至约52℃并在使用前置于培养皿中约1小时。在蛋白胨水中进行一系列稀释，然后涂板100μl的10-4稀释液。还使用对照板。之后，样品被琼脂吸附，并将板倒置并于20℃下在塑料袋中孵育3天。孵育后对菌落进行计数并以CFU/g报告结果。CFU/g计算为重复板的平均值，并除以克重量乘以稀释因子(等式1)。
挥发性有机化合物(VOC)分析
该方法通过顶空(HS)(Perkin Elmer TurboMatrix110顶空进样器，PerkinElmer，丹麦)气相色谱(GC)和火焰离子化检测器(FID)(Perkin Elmer Autosystem XL GC耦合，Perkin Elmer，丹麦)分析挥发性馏分来利用挥发性。HS-GC-FID用于定量挥发性化合物(乙醛、丙酮、3-甲基-丁醛、乙醇、二乙酰、丁-1-醇和乙偶姻)。通过向1ml发酵样品添加200μl的4N H2SO4并立即通过HSGC分析来制备样品。GC配备HP-FFAP柱(25m×0.20mm×0.33mm，Agilent Technologies，德国)。进样器保持在180℃。进样前，样品在顶空自动进样器中在70℃下加热36.5分钟(针头温度：180℃)。氦气用作载气，压力为32psi。传输线保持在210℃。SOF程序工作如下：在60℃开始后，柱温在2分钟后以45℃/min的速度从60℃升至230℃，最后保持在230℃持续0.5min。FID温度保持恒定在220℃，氢气和空气流量分别为45和450mL/min。FID信号以-6衰减，偏移量为5mV。数据通过Chromeleon软件(7.2.7版，ThermoFisher Scientific Inc.，丹麦)处理。
为了筛选，动态顶空耦合气相色谱和质谱检测器(DHS-GC-MS)用于识别和半定量(作为相对强度)样品中存在的挥发性成分。在20ml顶空瓶(ML-33015SPME,MikrolabAarhus A/S,
丹麦)中添加0.2mL200μL 2M H2SO4和1g的样品。小瓶加盖(ML-33041C，Mikrolab Aarhus A/S，
丹麦)。储存在最高-18℃直至分析。使用动态顶空在30℃下将小瓶中样品上方的顶空提取挥发物提取到TenaxTA管(Gerstel#020810，MSCI，Skovlunde，丹麦)30min后，使用气相色谱仪(Agilent 7890B，Agilent Technologies，丹麦)耦合单四极质谱仪(Agilent 5977A，Agilent Technologies，丹麦)分析样品。TenaxTA管在热解吸装置(TDU，Gerstel，MSCI，Skovlunde，丹麦)中在270℃下解吸5min。在TenaxTA衬管(Gerstel#012438，MSCI，Skovlunde，丹麦)中，挥发物于10℃下在冷却入口中被捕获。通过在不分流模式下将TenaxTA衬管快速加热至270℃，挥发物解吸到GC柱：压力：170kPa，总流量：40ml/min传输模式：不分流，时间：2min。挥发物在非极性柱(DB-5MS UI 30m×0.25mm×1μm，Agilent#122-5533UI，Agilent Technologies，丹麦)上使用170kPa恒压分离，使得起始流速为在32℃下2.6ml/min，结束流速为在325℃下0.85ml/min。柱温程序如下：32℃持续2min，以10℃/min升温至102℃，5℃/min至145℃，15℃/min至200℃，20℃/min至325℃，总运行时间为27.5min。质谱仪在-70eV下以电子碰撞模式运行，分析仪从29-209amu扫描。高度响应用于使用MassHunter软件(10.0版，型号10.0.707.0，AgilentTechnologies，丹麦)计算半定量结果。
结果
发酵特征
上述大豆样品(表1)的发酵特征如图1所示。如所示，在存在蔗糖或果糖(大豆4和大豆5)的情况下使用乳酸菌可以实现快速发酵，其中在约17小时内pH降至约4.5。相反，如样品大豆2和大豆3所示，如果仅添加葡萄糖和果糖而不添加乳酸菌，克鲁维毕赤酵母发酵缓慢，37小时后达到pH为5.5。
这表明，在存在蔗糖或果糖的情况下组合使用克鲁维毕赤酵母、乳酸菌导致快速发酵，产生发酵食品可接受的pH范围以确保食品安全。
克鲁维毕赤酵母的生长
储存1天后，对样品中的克鲁维毕赤酵母生长进行评价，如图2所示。分别从大豆2和大豆3制备另外两个样品大豆7和大豆8，通过用乳酸将pH调节至4.55以不影响感官评价，因为酸度可以影响描述。
如图2所报告，克鲁维毕赤酵母能够在所有大豆样品中生长。据观察，克鲁维毕赤酵母在含有乳酸的样品(大豆1和大豆6)中生长最快。这也可以在大豆7和大豆8样品中观察到，其中与未调节pH的原始样品(大豆2和大豆3)相比，添加乳酸导致细胞计数更高。
这证明可以向克鲁维毕赤酵母供应乳酸以进一步促进其生长。这可能对微生物细胞计数很重要的产品(例如克菲尔产品)有用。
感官评价
储存2天后，对所有样品进行感官评价。评价两个主要属性，即甜味和果味感。评估员被要求对样品的甜味和果味强度从最低(6)到最高(1)进行排序，6表示甜味/果味最低，并且1表示甜味/果味最高。
表2：发酵大豆样品的甜味和果味感排序
关于甜味，表现最佳的样品是在存在蔗糖和果糖(大豆4、大豆6和大豆5)的情况下用克鲁维毕赤酵母、乳酸菌发酵的。具体地，大豆4(5％蔗糖和乳酸菌)被认为最甜，其次是大豆6(5％蔗糖、乳酸菌和0.5％乳酸)，然后是大豆5(3％果糖和乳酸菌)。
尽管具有相同的最甜指数，但不含乳酸菌的样品(大豆2和大豆3)被认为甜味最低。
在大豆1中，其中仅添加0.5％的乳酸，因此没有糖和乳酸菌，尽管克鲁维毕赤酵母生长，但未检测到甜味。这清楚地表明甜味感需要乳酸菌。
关于果味，大豆6(5％蔗糖、乳酸菌和0.5％乳酸)的果味感最高，其次是大豆4(5％蔗糖和乳酸菌)，然后是大豆5(3％果糖和乳酸菌)。在大豆1中，也没有感觉到果味，这与甜味的观察结果一致。
感官评价的结果表明，在存在蔗糖或果糖的情况下，使用克鲁维毕赤酵母、乳酸菌可以获得最佳风味。可以添加乳酸以增强果味。在存在某些糖类的情况下，使用克鲁维毕赤酵母和乳酸菌在香味形成中存在有协同效应。
此外，提供的数据表明，高细胞数不一定与香味形成有关(参见大豆1)。添加乳酸不导致香味发展。
挥发性有机化合物(VOC)分析
图3显示了所有样品中的乙醇水平。出乎意料地发现，通过添加乳酸菌，减少由酵母的乙醇形成是可能的。如所示，在大豆4(5％蔗糖和乳酸菌)、大豆5(3％果糖和乳酸菌)和大豆6(5％蔗糖、乳酸菌和0.5％乳酸)中检测到的乙醇量最低。
实施例2
样品制备
有机无糖大豆乳(NATURLI’Foods A/S，丹麦)用作起始材料。在存在添加的乳酸(Lactol Vinoferm，Brouwland，比利时)或存在乳酸菌(FDVS-YF-L01，含有嗜热链球菌；Chr.Hansen Denmark)的情况下添加不同量的葡萄糖(Cargill)、蔗糖(Nordic sugar)和果糖(Hamburg Fructose GmbH International)，如表3中所示。在添加糖和/或乳酸后对大豆乳进行巴氏杀菌(90℃，持续20分钟)以避免污染。以1×106cfu/g的量接种克鲁维毕赤酵母菌株1，并在发酵开始时按照表3所示的量接种乳酸菌。在本实施例中，发酵在30℃下以200mL规模进行43.5小时。之后，用有孔圆盘破碎凝结物，并将样品储存在6℃下以供进一步分析。
表3：实施例2的实验设计，和通过嗅觉对感知香味的非正式评价。
克鲁维毕赤酵母计数
储存后一天，根据实施例1所述的方法对克鲁维毕赤酵母进行计数。
非正式感官评价
检测香味形成的非正式感官评价通过对其嗅闻并将感知到的香味从不存在到极低、低、中等和高来进行分级。结果如表3所示。
结果
克鲁维毕赤酵母的生长
储存1天后，对所有样品中的克鲁维毕赤酵母生长进行评价，结果如图4所示。可以看出，乳酸能够促进克鲁维毕赤酵母的生长，细胞数与添加的乳酸呈正相关(参见大豆10、大豆11和大豆12，分别含有0.3％、0.5％和1％乳酸)。
在仅存在碳水化合物的情况下，添加葡萄糖或果糖时可见更高的细胞计数(大豆14和大豆15，分别含有5％葡萄糖和果糖)。然而，当添加5％蔗糖(大豆13)时，未见生长。这表明克鲁维毕赤酵母不能使用蔗糖作为基质。此外，更高量的葡萄糖显示抑制克鲁维毕赤酵母的生长(大豆16)。
通过添加乳酸菌(比较大豆13与大豆17)克服了不能利用基质中蔗糖的限制因素。在这种情况下，克鲁维毕赤酵母在存在蔗糖的情况下表现出生长，达到与存在葡萄糖的情况相似的水平(比较大豆17与大豆14)。在既不添加碳水化合物也不添加乳酸的大豆样品(大豆9)中，克鲁维毕赤酵母不生长，并且细胞计数降至约6×104cfu/g。
非正式感官评价
虽然克鲁维毕赤酵母能够在添加乳酸或合适的碳水化合物的情况下生长良好，但很少或没有香味形成被感知。出乎意料的是，当添加乳酸菌时，可以检测到香味形成增加(比较大豆13-大豆17、大豆14-大豆18、大豆15-大豆19)。
实施例3
样品制备
有机未加糖大豆乳(NATURLI’Foods A/S，丹麦)用作起始材料。如表4所示添加5％的葡萄糖(Cargill)、蔗糖(Nordic sugar)、果糖(Hamburg Frutose GmbH International)或乳糖(Infantose Sachsenmilch Lepperdorf GmbH)。添加糖类后，对豆乳进行巴氏杀菌(90℃，持续20分钟)以避免污染。将基质冷却至发酵温度30℃，并接种0.02％的乳酸菌(FDVS-YF-L01，含有嗜热链球菌；Chr.Hansen丹麦)。在发酵开始时以1×106cfu/g的量接种克鲁维毕赤酵母菌株1。在本实施例中，发酵以5L规模进行。当pH达到4.55时，用有孔圆盘破坏凝结物，冷却步骤至12℃，然后进行机械后处理(2巴背压；FH Scandinox A/S，Tarm，丹麦)以允许平滑加工。将样品收集在120ml塑料杯中，并储存在6℃下以供进一步分析。
表4：实施例3的实验设计
感官评价：描述性分析
九名评委参与测试，对储存7天后获得的4个样品进行评价。举行一次培训课程以使专门小组成员熟悉样品并定义属性列表。为了进行评价，按照拉丁方设计以随机顺序以两个重复向评委展示样品。属性强度在结构化的线尺度上进行评级，所述线尺度有五个区间，左端标记为“无”，右端标记为“很多”。
强度评价结果的统计学评价包括三因素MANOVA(多变量方差分析)和Wilks检验以检查总体样品差异和ANOVA(方差分析)以找出哪个属性存在显著差异，两者均考虑产品因素，判断和重复以及它们的双因素交互作用。当属性具有显著的产品效应时，最小显著差异(LSD)检验用于检测产品样品之间的显著差异。本研究选择显著性水平α＝0.05。计算每个属性的ANOVA。通过最小显著差异检验(LSD)检验计算样品之间的差异。
使用Simca 15(Umetric，瑞典)，进行所有测试样品中挥发性成分和感官属性之间的多变量数据分析和Pearson相关性。
挥发性有机化合物(VOC)分析
储存7天后，根据实施例1中描述的方法分析VOC。给出信噪比(SNR)。
糖定量
储存7天后，使用AOAC 982.14,mod./HPAEC-PAD方法(Eurofins)对蔗糖、葡萄糖和果糖进行定量。
结果
感官评价：描述性分析
表5报告了感官评价的结果，显示基于针对被发现在产品之间显著差异的属性的最小显著差异检验(LSD)的样品的平均值和分组，不同字母表示p<0.05的显著差异。图5中的蜘蛛图描绘了相同数据。
如图5所示，含有果糖的样品(大豆24)具有最高的果味、香蕉味、甜味和整体风味强度属性，其次是含有蔗糖的样品(大豆23)。此外，这些样品也是异味最低的样品，例如醋味、纸板味和涩味属性。
表5：不同属性的评价
VOC分析及与感官评价的相关性
图6显示了所有四个样品中乙酸丙酯(S/N)的量。发明人出乎意料地观察到乙酸丙酯大量存在于用乳酸菌和果糖(大豆24)和葡萄糖(大豆25)发酵的样品中。在乙酸丙酯和感官属性之间获得的Person相关值显示水果味和香蕉味之间呈正相关(表6)。这与含有果糖的样品中香蕉风味属性评分显著更高的发现相符。
表6：感官属性和乙酸丙酯化合物之间的Pearson相关值。
糖定量
表7显示了在发酵后样品大豆23、大豆24和大豆25中测量的葡萄糖、果糖、半乳糖和蔗糖的量(g/100g)。这些样品在发酵开始时分别含有5％的蔗糖、果糖和葡萄糖，相当于每100g含有5g(表4)。
对于大豆23，消耗约0.32g/100g的蔗糖，并且对于大豆24，消耗约0.33g/100g的葡萄糖。这表明微生物不需要大量的糖。对大豆25进行类似观察，其中消耗约0.93g/100g的葡萄糖。
表7
| 样品 | 葡萄糖 | 果糖 | 半乳糖 | 蔗糖 |
| 大豆23(蔗糖) | 0.04 | 4.64 | ||
| 大豆24(果糖) | 4.67 | |||
| 大豆25(葡萄糖) | 3.93 | 0.07 | 0.07 |
实施例4
样品制备
提供以下三种植物乳基以提供酸奶类似物：
-大豆基(有机不加糖大豆乳(NATURLI’Foods A/S，丹麦)添加5％蔗糖(Nordicsugar))
椰子基(由57％的椰乳(Aroy-D)、31.5％的天然椰子水(myCoco)、6.5％水、4％淀粉(Clearam CH2020，Roquette)和1％蔗糖(Nordicsugar)组成)
-燕麦基(从30％(wt)燕麦麸水提取物获得，并进行淀粉部分水解和糖化的酶处理，然后进行热处理(Oatvita，Frulact，葡萄牙)；基质含有2.2％脂肪和约4％蛋白质以及10％葡萄糖)。
搅拌具有成分的基质，然后进行巴氏杀菌步骤(90℃，持续20分钟)以避免污染。然后，将每个基质分成3部分，并且每份基料接种乳酸菌(FDVS-YF-L01；Chr.Hansen Denmark，含有嗜热链球菌)和分别三种不同的酵母，克鲁维毕赤酵母菌株1、克鲁维毕赤酵母菌株2和汉逊德巴利酵母(克菲尔酵母)，如表8所示。乳酸菌的接种水平等于0.02％(wt)，而酵母的接种水平为1×106cfu/g。在本实施例中，发酵在30℃下以5L规模进行。在pH达到4.55后，用有孔圆盘破碎凝结物。然后，冷却步骤至12℃，然后进行机械后处理(2巴背压；FHScandinox A/S，Tarm，丹麦)以允许平滑加工。将样品收集在120ml塑料杯中，并储存在6℃下以供进一步分析。
表8：用于大豆、椰子和燕麦乳基发酵的微生物
发酵特征
使用Axone系统(
Sensors，Mettler Toledo)记录发酵特征。
非正式感官评价
生产7天后，对所有样品进行感官评价。评估员被要求描述样品。
挥发性有机化合物(VOC)分析
根据实施例1中描述的方法分析VOC。
结果
发酵特征
图7显示了所有样品的pH达到4.55所需的时间。在测试的酵母之间未观察到差异。在椰子基中可以快速达到pH，然后是大豆基和燕麦基。
感官评价
大豆27(含有克鲁维毕赤酵母菌株1)被描述为非常令人愉悦且有果味，具有类似香蕉和梨的味道。大豆28(含有克鲁维毕赤酵母菌株2)也被描述为令人愉悦且有果味，与大豆27相似但更淡。在发酵椰子(椰子1和2)中，克鲁维毕赤酵母对风味的贡献被认为具有香味，并且比发酵燕麦样品(燕麦1和燕麦2)更浓郁。在使用汉逊德巴利酵母的样品(大豆3、椰子3和燕麦3)中未发现上述任何属性。这些含有克菲尔酵母的样品的味道类似于啤酒或面包。
挥发性有机化合物(VOC)分析
图8-10分别显示了由大豆、椰子和燕麦制备的乳基中乙醇的水平。此处，所有样品中仅检测到非常少量的乙醇。在第1天对于椰子1可以看到最高的量(约1200ppm)，但在第14天不再可检测到，可能是由于酵母的同化作用。
实施例5
样品制备
来自法国供应商(Grignon farm)的新鲜乳用自来水标准化至含有3.0％蛋白质，并在92℃下巴氏杀菌5分钟。
热处理后，将选择的3％碳水化合物添加到乳中，如表9中所示，混合并在使用前在6℃下储存24小时。
将乳基温热至25℃持续20分钟，并以约104CFU/g的水平接种乳酸菌和酵母(克鲁维毕赤酵母或汉逊德巴利酵母)(参见表9)。作为乳酸菌，使用F-DVS XPL-1培养物(Chr.Hansen A/S，丹麦)用于嗜温乳制品，其含有嗜热链球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰变种、乳酸乳球菌乳酸亚种和明串珠菌属)。
乳基的发酵在25℃下进行，直至pH达到4.50。之后，将样品储存在冷却室中以供进一步分析。
表9
酵母计数
每周检查在6℃下储存的样品的酵母细胞计数(D+1；D+7；D+15；D+28)。通过对5克样品进行取样以制备稀释液来进行酵母细胞计数。在连续稀释至相关稀释度后，将样品倒在YGC板上并在25℃有氧条件下孵育5天。孵育后，对菌落(呈白色奶油状、小且圆)进行计数。
结果
样品的酵母细胞计数如图11所示。与商业克菲尔酵母汉逊德巴利酵母相比，克鲁维毕赤酵母的细胞计数在4周的时期内普遍较高。含有葡萄糖的样品(克菲尔2)的细胞计数最高，其次是果糖(克菲尔4)和蔗糖(克菲尔6)。
非正式感官评价
用汉逊德巴利酵母制备的样品在保质期结束时显示出典型的克菲尔味，具有酵母味。在保质期开始时无法检测到特定味道或气味。
一名参与者描述用克鲁维毕赤酵母制备的样品具有水果气味和类似樱桃、桃或李子的味道。另一名参与者将这种味道描述为水果味或成熟味。有意思的是，在保质期开始时就已经可以检测到这些味道，并且朝着保质期结束而变得更加浓郁。
实施例6
样品的制备
两个样品的制备方法与实施例5中描述的克菲尔2(含3％葡萄糖)和克菲尔4(含4％果糖)相同。另外两个样品也以相同的方式制备，但在一定温度(30℃)下发酵。
乙醇水平
在第14天，通过气相色谱测量各1g四个样品的乙醇含量。
表10显示了第14天用LAB起子培养物和克鲁维毕赤酵母发酵的4个不同克菲尔样品中的乙醇水平。
表10
这表明本发明可以实现200至300ppm范围内的低乙醇产生。
实施例7
样品制备
表11总结了整体实验设计。有机不加糖大豆乳(NATURLI’Foods A/S，丹麦)用作起始材料，并且在使用或未使用乳酸(80％，S.
/Jungbunzlauer)的情况下进一步与无糖或不同量的葡萄糖(Cargill)、蔗糖(Nordic sugar)和果糖(Hamburg Fructose GmbHInternational)混合。此外，一些样品接种不同的乳酸菌(FDVS-YF-L01，含有嗜热链球菌，Chr.Hansen A/S，丹麦；和副干酪乳杆菌，L.CASEI
Chr.Hansen A/S，丹麦)，如表11所示。在添加糖类和/或乳酸后对大豆乳进行巴氏杀菌(90℃，持续20分钟)以避免污染。克鲁维毕赤酵母菌株1以4U/1000L或1×105cfu/g的量接种，并且乳酸菌在发酵开始时以0.02％的量接种。在本实施例中，发酵在30℃下以200ml的规模进行。当pH达到4.55时或最多30小时后停止发酵。之后，用有孔圆盘破碎凝结物，并将样品储存在6℃下以供进一步分析。所有分析均在冷藏条件下储存10天后进行。
表11：实施例7的实验设计
克鲁维毕赤酵母计数
如实施例1中所述进行克鲁维毕赤酵母计数。
挥发性有机化合物(VOC)分析
通用筛选
对于筛选挥发性特征，根据实施例1中描述的方法测量VOC。
具体化合物定量
对于挥发性有机化合物(VOC)的定量，根据实施例1中描述的方法通过使用HS-GC-FID分析样品。样品的制备方法不同，将1-2g的NaCl和600μL的0.1M NaF(pH＝7)添加到1mL发酵样品中，并立即通过HSGC进行分析。这种样品制备允许定量乙酸异戊酯，其是提供水果味、香蕉味或豌豆样味的化合物。
结果
克鲁维毕赤酵母的生长
储存10天后，对样品中的克鲁维毕赤酵母生长情况进行评价，克鲁维毕赤酵母能够在所有大豆样品中生长(数据未显示)。
挥发性有机化合物(VOC)的通用筛选
每个样品中测得的酯总量(表示为信噪比)显示在表12中。发明人出乎意料地观察到，与单独的克鲁维毕赤酵母(大豆33)、单独的YF-L01(嗜热链球菌)(大豆34)或单独的副干酪乳杆菌L.CASEI
(大豆35)相比，在组合克鲁维毕赤酵母和LAB的样品(大豆32和大豆36)中测得的总酯量更高。在克鲁维毕赤酵母和嗜热链球菌(大豆32)的组合中发现尤其大量的酯类。
表12：酯类总量信噪比(S/N)
具有克鲁维毕赤酵母、YF-L01(嗜热链球菌)和添加的葡萄糖(大豆32)、添加的果糖(大豆31)和添加的蔗糖(大豆30)的样品中乙酸异戊酯的具体量如表13所示。
表13：具有添加的葡萄糖的样品中的乙酸异戊酯的量
| 样品 | 乙酸异戊酯(ppm) |
| 大豆32、克鲁维毕赤酵母、嗜热链球菌和葡萄糖 | 5.7 |
| 大豆31、克鲁维毕赤酵母、嗜热链球菌和果糖 | 3.1 |
| 大豆30、克鲁维毕赤酵母、嗜热链球菌和蔗糖 | 0.8 |
乙酸异戊酯存在于所有样品中，尤其是含葡萄糖的样品。
Claims (18)
1.一种用于生产发酵食品的方法，包括：
-提供基质，所述基质是乳基，
-向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)菌株和至少一种乳酸菌菌株，
-在存在选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物的情况下发酵所述基质，和
-获得发酵食品。
2.根据权利要求1所述的方法，用于生产发酵乳制品类似产品，包括：
-提供包含植物乳基的基质，
-向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，
-在存在选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物的情况下发酵所述基质，和
-获得发酵乳制品类似产品。
3.根据权利要求1所述的方法，用于生产发酵乳制品，包括：
-提供包含动物乳基的基质，
-向所述基质添加至少一种克鲁维毕赤酵母菌株和至少一种乳酸菌菌株，
-在存在选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物的情况下发酵所述基质，和
-获得发酵乳制品。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵步骤在存在蔗糖和/或果糖的情况下进行。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳酸菌是同型发酵乳酸菌，优选嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述发酵步骤在存在葡萄糖的情况下进行。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中添加的乳酸菌菌株发酵蔗糖并释放果糖。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中发酵进行12小时，例如18小时，例如24小时，例如36小时，例如48小时。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行所述发酵直至pH低于4.6，例如4.55。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳基是植物乳基，所述植物乳基
a)由豆类制成，优选地由大豆、豌豆、菜豆、羽扇豆或小扁豆制成；
b)由坚果制成，优选地由椰子、扁桃仁、腰果或核桃制成，和/或；
c)由谷物制成，优选地由燕麦、小麦、黑麦或黍类制成。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳基是包含乳清蛋白、酪蛋白或其混合物的溶液或悬浮液。
12.根据权利要求3-9所述的方法，用于生产发酵乳制品，所述发酵乳制品是包含至少104cfu/g克鲁维毕赤酵母的克菲尔产品。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述克鲁维毕赤酵母选自由以下组成的组：
a)于2014年3月5日保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ),布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124并被给予保藏号：DSM 28484的克鲁维毕赤酵母，
b)于2006年8月24日由新西兰奥克兰1142奥克兰大学生物科学学院保藏于澳大利亚维多利亚州3205南墨尔本541-65Clarke街道国家计量研究所，并被给予保藏号V06/022711的克鲁维毕赤酵母，
c)于2006年8月24日由新西兰奥克兰1142奥克兰大学生物科学学院保藏于澳大利亚维多利亚州3205南墨尔本541-65Clarke街道国家计量研究所，并被给予保藏号V06/022712的克鲁维毕赤酵母，和
d)a)、b)或c)的突变体。
14.一种起子培养物组合物，包含克鲁维毕赤酵母和至少一种乳酸菌菌株，优选同型发酵乳酸菌菌株，任选地选自由链球菌属物种(Streptococcus spp.)、片球菌属物种(Pediococcus spp.)或乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)组成的组。
15.一种起子培养物组合物，包含克鲁维毕赤酵母、至少一种乳酸菌菌株以及选自由蔗糖、葡萄糖和果糖组成的组的一种或多种碳水化合物。
16.根据权利要求14或15所述的起子培养物组合物，其中所述乳酸菌是嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
17.克鲁维毕赤酵母、乳酸菌以及选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物用于发酵食品的用途。
18.克鲁维毕赤酵母、乳酸菌以及选自由蔗糖、果糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物用于发酵乳制品或乳制品类似产品的用途。
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