CN115927758A - 快速检测腺病毒的实时荧光定量pcr引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR引物及方法，其中，上游引物序列如Seq_1所示，下游引物序列如Seq_2所示，探针序列如Seq_3所示，本发明利用上述引物、探针建立的快速检测腺病毒的方法具有很高的特异性、灵敏度和检测效率。本发明设计的引物将Tm值提高10度，大大提高了方法的灵敏度。本发明的方法根据引物，设置新的变性温度和退火温度，并配合使用快速实时荧光定量PCR仪，提高扩增反应中升温降温效率，大大降低了反应时间，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及人呼吸道病原体检测技术领域，更具体地，涉及快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR引物及方法。
背景技术
腺病毒为无包膜的双链DNA病毒，病毒颗粒呈二十面体对称结构，直径90～100nm，可划分为A～G共7个亚属。其中与呼吸道疾病相关的腺病毒主要有B亚属(ADV-3、7、11、14、16、21、55)，C亚属(ADV-1、2、5、6)和E亚属(ADV-4)。腺病毒常与其他呼吸道病毒共同感染，也有不同型别腺病毒共同感染的报道。
腺病毒具有以下特点：第一腺病毒流行广，传播迅速，给社会公共卫生安全带来极大风险；第二，人腺病毒(Human mastadenoviruses，HAdV)可以感染多种粘膜组织，甚至严重的致死性感染；第三，各个年龄段人群均能被腺病毒感染，其中易感人群多为婴幼儿和免疫功能受损的患者(如骨髓移植、人类免疫缺陷病毒感染和先天性免疫缺陷综合症)，常可引起严重甚至致死性感染；第四，大规模流行致死率高，未经治疗的重症HAdV肺炎或弥散性疾病的死亡率可能超过50％。
近年来随着PCR检测技术的推广应用，腺病毒的检出率提高，使早期诊断成为可能。专利申请号：202110397591.0专利名称：一种人腺病毒四重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法的专利文献，公开了使用六对特异性引物和4条特异性探针对人腺病毒B3型、B7型、B55型和E4型四个型别进行检测，并公开了全部检测过程时长1.5～2小时。该专利文献公开的检测检测方法为多重PCR，检测时需要加入多组引物和探针才能实现单次检测多种型别的腺病毒，存在病毒毒株检测范围小、灵敏度低、检测时间长、检测效率低的问题。因此，需要研发快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR引物及方法，采用一对引物和探针，通过单次检测就能实现对腺病毒准确检出，并缩短检测时间，提高检测效率，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR引物及方法。
根据本发明的一个方面，提供了快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR引物，包括上游引物ADV-F和下游引物ADV-R，
上游引物ADV-F的序列为：5’-CCGCCVGCSCCCACMAT-3’；
下游引物ADV-R的序列为：5’-GGYAGSGTCCCGTGATCTGTGAGA-3’；其中，V表示碱基A或G或C，S表示碱基G或C，M表示碱基A或C，Y表示碱基C或T。
根据本发明的另一个方面，提供了快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR探针，探针序列为：5’-ACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTG-3’，探针序列的5’端标记有荧光素基团FAM，探针序列的3’端标记有荧光淬灭基团MGB。本发明的探针采用荧光素FAM、荧光淬灭剂MGB对5’端、3’端分别进行标记，以便满足扩增反应中高Tm的需求，同时缩短探针长度，降低设计难度。
根据本发明的再一个方面，提供了权利要求1中的引物以及权利要求2中的探针在制备快速检测腺病毒的试剂盒中的应用。
根据本发明的第四个方面，提供了权利要求1中的引物或权利要求2中的探针或权利要求3中的试剂盒在检测腺病毒方法中的用途。
根据本发明的第五个方面，提供了一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的方法，包括以下步骤：
S1.核酸提取：取待测样本，提取其中的病毒DNA，保存备用；
S2.使用如权利要求1的引物以及权利要求2的探针以步骤S1获得的核酸作为模板，在PCR仪上进行实时荧光定量PCR分析；
S3.获得并分析结果。
在一些实施方式中，步骤S2中实时荧光定量PCR反应体系为：Premix Ex Taq 12.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，探针1μl，核酸模板5μl，余量蒸馏水，总体积为25μl。
在一些实施方式中，上游引物的浓度为7-15pmol/μl，所述下游引物的浓度为7-15pmol/μl，所述探针的浓度为0.5-5pmol/μl。
在一些实施方式中，步骤S2中实时荧光定量PCR反应程序为：预变性：88℃2min，1个循环；变性：88℃，1s，退火与延伸：68℃，14s，40个循环。
在一些实施方式中，步骤S2中PCR仪为便携式快速实时荧光定量PCR仪。
在一些实施方式中，样本为呼吸道感染患者的临床样本，样本包括痰液、鼻咽拭子或肺泡灌洗液。
本发明的有益效果：
1、本发明设计的引物、探针，满足扩增反应中高Tm的需求，将Tm值提高10度，大大提高了方法的灵敏度，同时缩短探针长度，降低设计难度，本发明方法对腺病毒的检出限为10拷贝/ul；
2、本发明的方法设置变性温度为88℃，退火温度为68℃，并减少预变性、变性、退火与延伸各阶段所用时间，降低循环数，大大降低了扩增反应时间，使扩增反应时间由1小时降低至30分钟；
3、本方法中使用快速实时荧光定量PCR仪，提高扩增反应中升温降温效率，进一步降低了反应时间，提高了检测效率。
因此本发明利用上述引物、探针建立的快速检测腺病毒的方法对腺病毒进行精准检测，且不会受到其他呼吸道病原体的序列影响，具有很高的特异性和灵敏度，在实际检测应用中，实现了单管单重PCR即可覆盖检测腺病毒，提高了检测效率和检测准确度，缩短了反应时间，实现对腺病毒的快速检测，解决了现有腺病毒检测耗时长、效率低、准确率低的问题。
附图说明
图1为本发明的引物设计原理示意图。
图2为本发明的一种非诊断目的快速检测腺病毒的方法的标准曲线。
图3为本发明的一种非诊断目的快速检测腺病毒的方法对腺病毒的灵敏度的试验结果图，其中，各曲线代表的质粒浓度：1:1×108拷贝/ul；2：1×107拷贝/ul；3：1×106拷贝/ul；4：1×105拷贝/ul；5：1×103拷贝/ul；6：1×102拷贝/ul；7:10拷贝/ul。
图4为本发明的一种非诊断目的快速检测腺病毒的方法与现有技术方法对不同病原体的检测扩增谱图对照，其中，A1：ADV-5W(ADVresp)；A2：ADV-5W(ADVu)；B1：ADV-7(ADVresp)；B2：ADV-7(ADVu)；C1：ADV-14(ADVresp)；C2：ADV-14(ADVu)；D1：ADV-35(ADVresp)；D2：ADV-35(ADVu)；E1：ADV-55-Y16(ADVresp)；E2：ADV-55-Y16(ADVu)；F1：ADV-55-267(ADVresp)；F2：ADV-55-267(ADVu)；G1：ADV-55-TY12-A549(ADVresp)；G2：ADV-55-TY12-A549J(ADVu)；H1：ADV-55-TY26-A549(ADVresp)；H2：ADV-55-TY26-A549(ADVu)。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
实施例1相关试验病原
试验用病原如腺病毒(ADV-5W、ADV-7、ADV-14、ADV-35、ADV-55-Y16、ADV-55-267、ADV-55-TY12-A549、ADV-55-TY26-A549)、呼吸道合胞病毒(RSV)、偏肺病毒(HMPV)、鼻病毒(HRV)、肠道病毒(EV71)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒3型、肺炎支原体、大肠杆菌、肺炎链球菌均来源于呼吸疾病国家重点实验室。
实施例2实时荧光定量PCR的引物设计
2.1引物设计
现有技术方案中采用一个型别使用一对引物及一条探针进行检测，意味着检测腺病毒，则需要在单管中使用多对引物以及多条探针的实时荧光PCR，会造成对单一型别毒株检测的灵敏度下降。
根据GeneBank数据库中检索下载不同型别的腺病毒的全长序列，以此作为参照基因序列。根据上述不同型别的腺病毒的保守区序列，进行引物设计，见图1，经过筛选得到上游引物和下游引物。
上游引物ADV-F的序列为：5’-CCGCCVGCSCCCACMAT-3’(Seq_1)；
下游引物ADV-R的序列为5’-GGYAGSGTCCCGTGATCTGTGAGA-3’(Seq_2)；
其中，V表示碱基A或G或C，S表示碱基G或C，M表示碱基A或C，Y表示碱基C或T。
以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例3一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR方法的构建
3.1腺病毒阳性标准品的构建
使用腺病毒ADV-7的qPCR阳性扩增产物，回收得到目标片段，将目标片段连接于pMD18-T vector，构建pT-ADV，转化培养后提取质粒，作为实时荧光定量PCR的阳性标准品，使用nanodrop2000测得pT-ADV的质粒原始质量浓度为22ng/ul，根据质粒分子量、浓度、摩尔分子数换算获得质粒浓度为7.38×109拷贝/ul。
3.2实时荧光定量PCR方法的建立
选择以上游引物序列：5’-CCGCCGGCGCCCACAAT-3’，下游引物序列：5’-GGCAGGGTCCCGTGATCTGTGAGA-3’，探针序列：FAM-ACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTG-MGB(Seq_3)，以腺病毒阳性标准品为模板，在不同变性温度(94℃～84℃)、退火温度(71℃～65℃)下进行实时荧光定量PCR反应，筛选出最优的PCR反应条件，并建立实时荧光定量PCR扩增反应体系。
得到实时荧光定量PCR扩增反应体系共25μl，见下表1，优化后的实时荧光定量PCR扩增反应条件为：预变性：88℃2min，1个循环；变性：88℃，1s，退火与延伸：68℃，14s，40个循环。
表1实时荧光定量PCR扩增反应体系表
实施例4一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR方法
本发明的一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
S1.核酸提取：取待测样本，使用全自动核酸提取仪提取其中的核酸，
-20℃保存备用；
S2.PCR扩增反应体系配制：
参照实施例3中表1，以本实施例步骤S1中提取的待测样本的核酸作为模板，配制得到PCR扩增反应体系；
PCR反应条件设置：使用FQ-8A型号的便携式快速实时荧光定量PCR仪，程序设置：预变性：88℃2min，1个循环；变性：88℃，1s，退火与延伸：68℃，14s，40个循环。
S3.分析及结果判断：步骤S2中使用的FQ-8A型号的便携式快速实时荧光定量PCR仪在40个循环过程中检测到荧光，判断待测样本为腺病毒检测阳性，即待测样本中含有腺病毒中的一种或多种；步骤S2中使用的FQ-8A型号的便携式快速实时荧光定量PCR仪在40个循环过程中没有检测到荧光，判断待测样本为腺病毒阴性，即待测样本中不含有腺病毒中的任何一种。
实施例5一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR方法的标准曲线建立
以实施例3中的腺病毒阳性标准品(质粒浓度为7.38×109～7.38×103拷贝/ul)为模板，参照实施例4的实时荧光定量PCR方法，对上述浓度梯度模板分别进行检测，并以各腺病毒阳性标准品中质粒浓度的常用对数(logCO)为横坐标，以循环数阈值(Ct值)为纵坐标，获得实时荧光定量PCR标准曲线，见图2。所获得标准曲线斜率为-3.2196，y轴截距为43.078，相关系数为0.9998，说明本方法的腺病毒阳性标准品在质粒浓度为7.38×109～7.38×103拷贝/ul的范围内，具有很好的线性。
实施例6一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的方法对腺病毒的灵敏度试验
对实施例3中的腺病毒阳性标准品进行进一步稀释，以腺病毒阳性标准品(质粒浓度为10～1×103拷贝/ul、1×105～×108拷贝/ul)为模板，参照实施例4的实时荧光定量PCR方法，每个浓度设置2个平行重复，对上述浓度梯度的模板进行检测，得到对应的扩增曲线，见图3。并计算得到，各浓度梯度的腺病毒阳性标准品的扩增平均CT值，见下表2。由上述表2可知，本方法可以对浓度为10拷贝/ul的模板进行很好的扩增，因此，本方法对腺病毒的最低检测限为10拷贝/ul。
表2梯度浓度的腺病毒阳性标准品的扩增平均CT值表
实施例6一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR方法与现有技术对腺病毒的检测方法的比较试验
本实施例以多种不同的病原体为检测样本，以本申请的检测方法和现有技术的检测方法进行检测，以ABC法提取上述多种不同病原体的核酸并以其为模板，使用FQ-8A型号的便携式快速实时荧光定量PCR仪作为扩增仪器。其中以第三方公司供应的腺病毒核酸检测试剂盒(即广东和信健康科技有限公司供应的腺病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，货号为HS001，注册证号：国械注准20183400426)，作为对照的现有技术方法。
6.1待测病原体样本：多种不同的已知型别的ADV阳性毒株(ADV-5W、ADV-7、ADV-14、ADV-35、ADV-55-Y16、ADV-55-267、ADV-55-TY12-A549、ADV-55-TY26-A549)、常见呼吸道病原体(呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、鼻病毒、肠道病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒3型、肺炎支原体、大肠杆菌、肺炎链球菌)。
本实施例中本申请的检测方法的反应液(ADVresp)以及上游引物、下游引物和探针采用实施例3的3.2中的实时荧光定量PCR扩增反应体系。对照方法的反应液(ADVu)采用广东和信健康科技有限公司供应的腺病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)中的反应液。
6.2扩增反应体系配制
| 成分 | 体积(μl) |
| 反应液 | 20 |
| <![CDATA[<u>Taq</u>酶]]> | 0.2 |
| 模板 | 5 |
6.3扩增反应条件设置
本实施例分别采用本发明的检测方法以及对照方法，对上述不同待测样本进行检测，得到检测结果，见下表3与表4。
表3本发明的实时荧光定量PCR方法的特异性结果表
| 病原体种类 | 待测样本例数 | 阳性检出例数 | 准确率 |
| ADV-14 | 2 | 2 | 100 |
| ADV-35 | 1 | 1 | 100 |
| ADV-55-Y16 | 4 | 4 | 100 |
| ADV-55-267 | 3 | 3 | 100 |
| ADV-55-TY12-A549 | 3 | 3 | 100 |
| ADV-55-TY26-A549 | 4 | 4 | 100 |
| ADV-7 | 3 | 3 | 100 |
| ADV-5W | 1 | 1 | 100 |
| 呼吸道合胞病毒RSV | 2 | 0 | 100 |
| 偏肺病毒HMPV | 2 | 0 | 100 |
| 鼻病毒HRV | 2 | 0 | 100 |
| 肠道病毒EV71 | 2 | 0 | 100 |
| 甲型流感病毒 | 2 | 0 | 100 |
| 乙型流感病毒 | 2 | 0 | 100 |
| 副流感病毒3型 | 2 | 0 | 100 |
| 肺炎支原体 | 2 | 0 | 100 |
| 大肠杆菌 | 2 | 0 | 100 |
| 肺炎链球菌 | 2 | 0 | 100 |
表4本发明的实时荧光定量PCR方法与现有技术方法的CT值表
由表3可知，本实施例中，本发明的引物以及探针对上述不同型别的腺病毒的毒株进行特异性的扩增，本方法仅对腺病毒的毒株出现阳性扩增信号，对其他病原(如呼吸道合胞病毒RSV、偏肺病毒HMPV、鼻病毒HRV、肠道病毒EV71、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒3型、肺炎支原体、大肠杆菌、肺炎链球菌)均未见阳性扩增信号。因此，本方法对腺病毒具有很好的特异性。
由表4的CT值以及图4中的扩增曲线比较可知，本实施例中本发明的检测方法的CT值均小于现有技术对照方法的CT值，说明本发明对呼吸道腺病毒具有较高的扩增效率，扩增特异性更强，达到对腺病毒检测灵敏、快速、准确、节约的目的；本发明设计的引物、探针，满足扩增反应中高Tm的需求，将Tm值提高10度，大大提高了方法的灵敏度；
由本发明的检测方法与对照方法的反应条件设置可以直接比较得出，本发明的方法设置变性温度为88℃，退火温度为68℃，并减少预变性、变性、退火与延伸各阶段所用时间，降低循环数，大大降低了扩增反应时间，使扩增反应时间由现有技术的1小时降低至30分钟，将单次检测所用时间缩短50％，将检测效率提高1倍，极大地减少了检测用时，提高了检测效率，实现简便、快速检测腺病毒的目的。
实施例7一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR方法对临床样本的检测
采用实施例4的方法，对2019年1月-6月采集的615份咽拭子临床样本(样本来源于广州医科大学附属第一医院)进行检测，同时使用第三方公司供应的腺病毒核酸检测试剂盒进行对比检测，该第三方公司供应的腺病毒核酸检测试剂盒为：由广东和信健康科技有限公司供应的腺病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，货号为HS001，注册证号：国械注准20183400426，包装规格为48人份/盒。检测结果见下表5。
表5临床样本咽拭子的快速检测结果表
| 结果类型 | 本方法 | 第三方试剂盒 |
| 阳性数 | 51 | 51 |
| 阴性数 | 564 | 564 |
| 总计 | 615 | 615 |
由上述表5可知，本发明的方法对615份咽拭子临床样本检出51份阳性样本，使用第三方公司的腺病毒核酸检测试剂盒也检出51份阳性样本，检测出的51份阳性样本与本发明方法检出的阳性样本一致，说明本发明的方法可以有效检测腺病毒，检测准确度高。第三方试剂盒的检测用时为1小时，而本发明的检测方法的检测用时为30分钟，将单次检测所用时间缩短50％，将检测效率提高1倍，极大地减少了检测用时，提高了检测效率，实现简便、快速检测腺病毒的目的。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，包括上游引物ADV-F和下游引物ADV-R，
所述上游引物ADV-F的序列为：
5’-CCGCCVGCSCCCACMAT-3’；
所述下游引物ADV-R的序列为：
5’-GGYAGSGTCCCGTGATCTGTGAGA-3’；
其中，V表示碱基A或G或C，S表示碱基G或C，M表示碱基A或C，Y表示碱基C或T。
2.快速检测腺病毒的实时荧光定量PCR探针，其特征在于，所述探针序列为：5’-ACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTG-3’，所述探针序列的5’端标记有荧光素基团FAM，所述探针序列的3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
3.权利要求1中所述的引物以及权利要求2中所述的探针在制备快速检测检测腺病毒的试剂盒中的应用。
4.权利要求1中所述的引物或权利要求2中所述的探针或权利要求3中所述的试剂盒在检测腺病毒方法中的用途。
5.一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.核酸提取：取待测样本，提取其中的病毒DNA，保存备用；
S2.使用如权利要求1所述的引物以及权利要求2所述的探针以步骤S1获得的核酸作为模板，在PCR仪上进行实时荧光定量PCR分析；
S3.获得并分析结果。
6.根据权利要求5所述的一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的方法，其特征在于，所述步骤S2中实时荧光定量PCR反应体系为：PremixExTaq12.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，探针1μl，核酸模板5μl，余量蒸馏水，总体积为25μl。
7.根据权利要求6所述的一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的方法，其特征在于，所述上游引物的浓度为7-15pmol/μl，所述下游引物的浓度为7-15pmol/μl，所述探针的浓度为0.5-5pmol/μl。
8.根据权利要求5所述的一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR仪为便携式快速实时荧光定量PCR仪，所述步骤S2中实时荧光定量PCR反应程序为：预变性：88℃2min，1个循环；变性：88℃，1s，退火与延伸：68℃，14s，40个循环。
9.根据权利要求5所述的一种非诊断目的快速检测腺病毒的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR仪为便携式快速实时荧光定量PCR仪。
10.根据权利要求5所述的一种体外非诊断目的快速检测腺病毒的方法，其特征在于，所述样本为呼吸道感染患者的临床样本，所述样本包括痰液、鼻咽拭子或肺泡灌洗液。
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2022
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