CN115926790B - 一种荧光碳点及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光探针领域，涉及一种荧光碳点及其制备方法和应用。荧光碳点的制备方法为：将盐酸多巴胺和氨基萘类衍生物溶解在无水乙醇中，微波反应，反应完成后经后处理制得荧光碳点。本发明荧光碳点的制备方法简单易分离，且将该荧光碳点应用于非疾病诊断为目的的活性氧检测中时，可同时实现对活性氧中OBr‑和过氧亚硝酸盐的快速、灵敏测试，在PBS缓冲溶液中当荧光碳点加入量为20μg，ONOO‑浓度为10μM时，OBr‑的线性检测范围为0‑360μM，检测限为50nM，具有检测范围宽、检测限低的优点。同时由于采用荧光turn‑on的方式对目标物进行检测，因此能够降低背景信号的干扰，减少误判。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针领域，涉及一种荧光碳点及其制备方法和应用。
背景技术
活性氧物质(ROS)在一些生理功能中起着重要的作用。过量的ROS会引起氧化应激反应，造成组织的损伤甚至引起疾病的产生。其中，次溴酸根离子(OBr-)在免疫系统中扮演着重要角色。体内OBr-的异常表达会产生严重副作用，甚至引起重症肺炎、心血管疾病、癌症等。过氧亚硝酸盐(ONOO-)具有很强的氧化性，且易分解产生高活性的二级自由基，直接和间接氧化不同生物大分子。其含量的波动也被认为与多种疾病相关，因此定量测定细胞内的OBr-和过氧亚硝酸盐对解释与其相关的病理生理过程极其重要。
目前，对OBr-和过氧亚硝酸盐的检测方法主要有：分光光度法、电化学分析法、发光分析法等。其中，基于荧光探针的检测方法在近年来发展迅速。但由于过氧亚硝酸盐自身具有极高的反应活性和极短的半衰期，导致对其的测定具有很高的难度，要求检测方法快速、灵敏。如专利CN11647401A公开了一种橙色荧光碳点及其在检测过氧亚硝酸根离子中的应用，以罗丹明B和对氨基酚为原料，通过一步水热合成法制备了碳点，该碳点能发出橙色荧光。当过氧亚硝酸根离子存在时，该碳点的荧光被过氧亚硝酸根离子有效猝灭，同时碳点溶液颜色由粉色变为蓝黑色。然而，已报道的这些探针只是针对OBr-或过氧亚硝酸盐的单一识别，忽略了肿瘤等疾病的发生、发展是细胞内多种超氧化物交互作用的结果，不能反映出细胞内OBr-或过氧亚硝酸盐的真实与联动水平。因此，实现对两种活性氧的同时检测具有重要的现实意义。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提出一种荧光碳点及其制备方法和应用。所制备的碳点在呼吸道感染中非疾病诊断为目的的活性氧检测时，可以实现对OBr-和过氧亚硝酸盐的同时、快速、灵敏测试，同时采用荧光turn-on的方式对目标物进行检测，能够降低背景信号的干扰，减少误判。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种荧光碳点的制备方法，将盐酸多巴胺和氨基萘类衍生物溶解在无水乙醇中，进行微波反应，反应完成后经后处理制得荧光碳点。
进一步，所述氨基萘类衍生物为1,8-二氨基萘、1,2-二氨基萘、1,3-二氨基萘、1,5-二氨基萘、1,6-二氨基萘或2,3-二氨基萘中的任意一种。
优选地，所述氨基萘类衍生物为1,8-二氨基萘。
进一步，所述盐酸多巴胺和氨基萘类衍生物的摩尔比为(1-1000):(1-1000)。
优选地，所述盐酸多巴胺和氨基萘类衍生物的摩尔比为(1-100):(1-100)。
优选地，所述盐酸多巴胺和氨基萘类衍生物的摩尔比为(1-50):(1-50)。
优选地，所述盐酸多巴胺和氨基萘类衍生物的摩尔比为(1-10):(1-10)。
优选地，所述盐酸多巴胺和氨基萘类衍生物的摩尔比为5.3:6.3。
进一步，所述微波反应的温度为135-160℃。
进一步，所述微波反应的时间为5-120min。
优选地，所述微波反应的时间为60min。
进一步，所述的方法制备的荧光碳点。
进一步，所述的荧光碳点在非疾病诊断为目的的活性氧检测中的应用。
进一步，所述的活性氧为次溴酸根(OBr-)和过氧亚硝酸盐(ONOO-)。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的荧光碳点的制备方法简单且易分离。所制备的荧光碳点能够同时识别OBr-和过氧亚硝酸盐。
2、本发明制备的荧光碳点对OBr-和过氧亚硝酸盐具有高度的专一性，能够排除各种干扰物如氨基酸、活性硫、各种金属离子、活性氧的干扰，对OBr-和ONOO-具有高度专一的选择性和抗干扰性。
3、将本发明制备的荧光碳点进行荧光滴定实验，测试加入不同浓度过氧亚硝酸盐后加OBr-的荧光强度变化。研究发现，只有在反应体系中同时加入两种活性氧(OBr-和ONOO-)后，体系中会快速生成黄色荧光产物，荧光发射位于565nm处，且溶液的荧光强度随着过氧亚硝酸盐浓度和OBr-浓度的增加而增强，具有很好的线性关系，检测范围宽，检测限低，在加入10μM ONOO-后，对OBr-的检测范围是0-360μM，检出限为50nM，检出限较低，由于识别模式为turn-on，故具有较高的灵敏度，不易受到干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备的荧光碳点在不同激发波长下的发射图谱。
图2为本发明实施例1制备的荧光碳点与过氧亚硝酸盐反应1min后，再加入OBr-的反应时间(0-60s)的考察结果(a)以及制备的荧光碳点与100μM OBr-反应10min后的荧光光谱图(b)。
图3为本发明实施例1制备的荧光碳点对各种干扰物的荧光光谱图。
图4为在本发明实施例1制备的荧光碳点溶液中加入10uM ONOO-反应1min后加入不同浓度OBr-后的荧光光谱记录。
图5为使用本发明实施例1制备的荧光碳点对重症肺炎模型小鼠肺泡灌洗液中免疫细胞内过氧亚硝酸盐和BrO-分布的共聚焦成像结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为荧光碳点的制备方法，步骤如下：
(1)将盐酸多巴胺(10mg，0.053mmol)和1,8-二氨基萘(10mg，0.063mmol)溶解在无水乙醇中，混合液于微波合成仪中135℃反应60min；
(2)反应后，采用超滤法纯化产品，后旋蒸去除有机溶剂，取出粉末产品，干燥保存。
实施例2
本实施例为荧光碳点的制备方法，步骤如下：
(1)将盐酸多巴胺(18.9mg，0.1mmol)和1,2-二氨基萘(15.8mg，0.1mmol)溶解在无水乙醇中，混合液于微波合成仪中160℃反应5min；
(2)反应后，采用超滤法纯化产品，后旋蒸去除有机溶剂，取出粉末产品，干燥保存。
实施例3
本实施例为荧光碳点的制备方法，步骤如下：
(1)将盐酸多巴胺(10mg，0.053mmol)和1,8-二氨基萘(419mg，2.65mmol)溶解在无水乙醇中，混合液于微波合成仪中155℃反应30min；
(2)反应后，采用超滤法纯化产品，后旋蒸去除有机溶剂，取出粉末产品，干燥保存。
实施例4
本实施例为荧光碳点的制备方法，步骤如下：
(1)将盐酸多巴胺(1mg，0.0053mmol)和1,5-二氨基萘(838mg，5.3mmol)溶解在无水乙醇中，混合液于微波合成仪中150℃反应45min；
(2)反应后，采用超滤法纯化产品，后旋蒸去除有机溶剂，取出粉末产品，干燥保存。
实施例5
本实施例为荧光碳点的制备方法，步骤如下：
(1)将盐酸多巴胺(0.95g，5mmol)和1,6-二氨基萘(15.8mg，0.1mmol)溶解在无水乙醇中，混合液于微波合成仪中145℃反应80min；
(2)反应后，采用超滤法纯化产品，后旋蒸去除有机溶剂，取出粉末产品，干燥保存。
实施例6
本实施例为荧光碳点的制备方法，步骤如下：
(1)将盐酸多巴胺(1.9g，10mmol)和2,3-二氨基萘(15.8mg，0.1mmol)溶解在无水乙醇中，混合液于微波合成仪中135℃反应120min；
(2)反应后，采用超滤法纯化产品，后旋蒸去除有机溶剂，取出粉末产品，干燥保存。
实施效果例
传感方法：将20μg荧光碳点分散于1mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，同时加入10μMONOO-和0-360μM OBr-后混匀，测试荧光光谱，激发波长488nm，发射收集500-650nm。
1.荧光选择性实验
首先将制备的荧光碳点使用荧光分光光度计测试在不同激发波长下的发射光谱，激发光波长范围：380-640nm，间隔为20nm。图1结果显示荧光碳点在380-640nm激发光下，无相应发射光。采用荧光分光光度计考察不同激发条件下，荧光碳点对OBr-和ONOO-的荧光选择性。如图2a所示，在488nm处的激发条件下，单独的荧光碳点(20μg)在1mL pH为7.4的PBS缓冲液中565nm处无荧光现象出现，当再次加入10μM ONOO-后反应1min后，无荧光现象出现(底部红线)。如图2b所示，在488nm处的激发条件下，单独的荧光碳点(20μg)在1mL pH为7.4的PBS缓冲液中565nm处无荧光现象出现，当再次加入100μM OBr-反应10min后，具有非常微弱的荧光现象。如图2a所示，而将20μg的荧光碳点分散于1mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，同时加入10μM ONOO-反应1min后，再加入200μM OBr-后混匀，收集反应10-60s后的荧光光谱，发现有强烈荧光出现，说明荧光碳点可对同时存在ONOO-和OBr-时产生强烈荧光信号。对双目标物同时存在时才能检测到，也说明选择性更好。
2.荧光干扰性实验
为了测试荧光碳点对OBr-和ONOO-检测的抗干扰能力，在荧光发射光谱中测试了荧光碳点抗常见活性物质干扰性。如图3所示，在480nm处激发条件下，将20μg荧光碳点加入到1mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，然后加入1mM各种常见的干扰物反应10min后，测试565nm下各种常见的干扰物对荧光碳点荧光强度的影响，研究发现荧光碳点对氨基酸Tyr、Trp、Phe、Arg、Ghy、Lys、Ser、Glu、IIe、Val、Leu、Asp、His、Ala、Thr、Met、Pro无荧光现象，对活性硫Hcy、GSH、Cys无荧光现象，对金属离子Ca2+、Mn3+、Mg2+、Na+、K+、Fe3+无荧光现象，对Cr3+、Zn2 +、Fe2+、Cu2+有微弱的荧光现象，对活性氧NO2、H2O2、OH、ONOO-、OBr-无荧光现象，对ClO-、O2有微弱的荧光现象，对同时存在ONOO-和OBr-时表现出强烈的荧光现象。该结果表明，荧光碳点对检测OBr-和ONOO-具有较强的抗常见干扰物的干扰性能力，具有高度的专一性。
3.荧光碳点对OBr-和ONOO-的响应速度实验
采用荧光光谱仪考察了荧光碳点对OBr-和ONOO-的响应速度。在1mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，控制荧光碳点的用量为20μg，加入10μM ONOO-反应1min后，再加入200μMOBr-，收集反应10-60s后的荧光光谱，结果如图2a所示。在1mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，控制荧光碳点的用量为20μg，加入200μM OBr-，收集反应10min后的荧光光谱，结果如图2b所示。结果表明，制备的荧光碳点在遇到单独的OBr-或单独的ONOO-时，无荧光现象出现，随后当同时加入10μM的ONOO-和200μM的OBr-后，反应10s后已有强烈荧光出现，并与反应60s后的荧光强度相当，因此该测试说明荧光碳点只对同时存在OBr-和ONOO-时产生强烈荧光信号。对双目标物同时存在时才能检测，也说明抗干扰性更强，灵敏度更高，响应速度快。
4.最低检出限实验
采用荧光光谱仪来测定荧光碳点对OBr-和ONOO-的最低检出限。在1mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，控制荧光碳点为20μg，先加入10μM ONOO-反应1min后加入0-360μM不同浓度OBr-，在488nm处激发条件下，测定5min后荧光碳点对OBr-和ONOO-的响应强度。如图4所示，加入ONOO-后再加入不同浓度OBr-，随OBr-浓度的增加，565nm处的荧光强度随之增加，在ONOO-浓度为10μM时该荧光碳点在OBr-浓度为0-360μM间呈线性关系。经计算，该荧光碳点检出限为50nM。因此，该测试结果表明，本发明制备的荧光碳点对OBr-和ONOO-的检测具有较宽的检测范围和较低的检出限，具有较高的实用价值。
应用例
1.重症肺炎模型鼠的构建
1.1将购买的6-8周SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为4组：PBS组(对照组)、CP组(免疫抑制组)、SP组(肺炎组)、CPSP组(重症肺炎组)，每组6只小鼠。PBS组全程使用PBS溶液进行处理；CP组和CPSP组在实验第0天和第3天分别使用300μL(10mg/mL)和200μL(10mg/mL)环磷酰胺溶液对小鼠进行腹腔注射，构建免疫抑制模型；SP组和CPSP组在第4天使用50μL(1×108CFU/mL)金黄色葡萄球菌溶液对小鼠进行气管插管给药，构建重症肺炎模型；在实验第5天处理小鼠。下表为具体操作。
表1处理方法
1.2取材和标本收集：每天检测小鼠血压；取尾静脉血，检测外周血象；对颈总动脉进行插管，取0.2mL动脉血行血气分析检测；无菌开胸取左侧肺组织作HE染色；结扎左主支气管，对右肺进行灌洗。肺泡灌洗液(BALF)的制备：用留置针套管插入主支气管约1cm，1mL无菌PBS溶液经留置针套管注入肺腔，共灌洗3次，收集总肺泡灌洗液，对白细胞和中性粒细胞进行计数。
1.3检测指标：小鼠行为学表现、动态血压变化、血气分析变化，外周血象及BALF的白细胞和中性粒细胞计数，肺组织的病理改变。
2.重症肺炎模型鼠的肺泡灌洗液与肺部切片成像：将50μL含1mg/mL的荧光碳点的无菌水溶液滴鼻于重症肺炎小鼠鼻腔内，处理30-180min后，取肺泡灌洗液与肺部切片于共聚焦显微镜下观察与拍摄结果。
图5为使用本实施例制备的荧光碳点对重症肺炎模型小鼠肺泡灌洗液中免疫细胞内过氧亚硝酸盐和OBr-分布的共聚焦成像结果。如图所示，重症肺炎模型小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞内部有大量的过氧亚硝酸盐和OBr-产生，制备的荧光碳点可快速对其内部的两种活性氧成分做出影像。时间仅需10min。激光器波长为488nm，发射波长收集范围为：500-650nm。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种荧光碳点在非疾病诊断为目的的检测OBr-和过氧亚硝酸盐中的应用，其特征在于：所述荧光碳点的制备方法为将盐酸多巴胺和1,8-二氨基萘溶解在无水乙醇中，进行微波反应，反应完成后经后处理制得荧光碳点。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述盐酸多巴胺和1,8-二氨基萘的摩尔比为(1-1000):(1-1000)。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述盐酸多巴胺和1,8-二氨基萘的摩尔比为(1-100):(1-100)。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述微波反应的温度为135-160℃。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述微波反应的时间为5-120min。
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