CN115919841B

CN115919841B - 一种用于预防或治疗阿尔茨海默病的中药单体组合物及应用

Info

Publication number: CN115919841B
Application number: CN202211729340.9A
Authority: CN
Inventors: 贾建平; 李芳玉; 聂淑雅; 全美娜
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Xuanwu Hospital
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2024-02-13
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115919841A

Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗阿尔茨海默病的中药单体组合物及应用，涉及医药领域，中药单体组合物的有效成分包括和厚朴酚和丁苯酞，和厚朴酚和丁苯酞的重量比为3：1～0.1：3，可选地为2.5：1～0.5：2.5，可选地为2：1～1：2。本发明的中药单体组合物—和厚朴酚+丁苯酞，可在AD细胞模型上起到协同增强的保护作用，联合指数小于1，显示具有协同增强作用，尤其是和厚朴酚和丁苯酞在1：2的配比时协同增效作用显著。和厚朴酚联合丁苯酞可以用于预防或治疗AD，且具有协同增强作用。

Description

一种用于预防或治疗阿尔茨海默病的中药单体组合物及应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种用于预防或治疗阿尔茨海默病的中药单体组合物及应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以记忆障碍和功能损害为主要表现，最终导致患者自主生活能力完全丧失的神经系统退行性疾病。因此，对AD的预防和治疗关乎人类未来命运，对AD的研究已经迫在眉睫。

目前仅有五种作用于神经递质的药物被美国食品药品管理局(Food and DrugAdministration,FDA)批准用于AD的治疗，包括胆碱酯酶抑制剂和NMDA(n-methyl-d-aspartate)受体拮抗剂(Memantine)。已有的临床证据显示，胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂对于AD患者的认知水平和日常功能均有稳定或改善的效果，但这些药物仅能改善患者症状，无法阻止或逆转AD的疾病进展。自2003年Memantine上市至今，已有18年没有新的药物被批准用于AD的治疗。近年来，围绕AD的治疗所展开的III期临床研究陆续以失败告终。目前仍在进行的III期临床实验中，包括人参提取物Ginkgo biloba这样天然药物提取物和二甲双胍这样的扩展适应症用药研究。不难看出，这些多靶点、多通路的药物正逐渐取代过去单一靶点的药物，成为AD药物研发中不容忽视的一个领域。既往的大量研究已经证实，天然药物提取物能够通过多种途径对AD的体内和体外模型起到神经保护作用。

越来越多的研究开始关注多靶点干预策略和联合用药。但仍缺乏有效的AD治疗措施。

发明内容

技术问题

有鉴于此，本发明要解决的技术问题是，如何提供一种用于预防或治疗AD的中药单体组合物及应用。

本发明采用和厚朴酚和丁苯酞联合应用，可安全有效的减少AD细胞模型的细胞毒性，两个中药单体的组合用药优于单个中药单体的效果，且联合指数小于1，显示具有协同增强作用。

解决方案

为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种用于预防或治疗AD的中药单体组合物，有效成分包括和厚朴酚和丁苯酞，和厚朴酚和丁苯酞的重量比为3：1～0.1：3。

中药单体因其多靶点作用机制，在AD的药物研发中具备一定优势。研究发现，和厚朴酚(3'，5-二-2-丙烯基-1,1'-联苯-2,4'-二醇)(C₁₈H₁₈O₂)(Honokiol,HKL)(结构式如式(I))是从厚朴的树皮中分离出来，衍生自木兰树皮的小分子量天然双酚化合物，其用于传统亚洲药用系统。具有多种药理活性，它具有止痛，抗炎，抗氧化，抗肿瘤和神经保护作用。它也具有跨越血脑屏障的能力，表现出抗焦虑和抑郁和改善脑缺血/再灌注诱导的记忆缺陷的作用。

丁苯酞，化学名为消旋3-正丁基-1(3H)-异苯并呋喃酮(dl-3-n-butylphthalide，NBP)(结构式如式(II))，是由天然食用植物芹菜籽中提取的脂溶性物质。丁苯酞是我国自主研发的一种多靶点药物，临床上主要用于治疗急性缺血性脑卒中，对脑血管和神经系统有重要的保护作用，可改善缺血性脑组织微循环，抑制炎症反应和氧化应激反应，维持线粒体正常膜电位和线粒体功能，减少神经细胞凋亡。

进一步地，所述和厚朴酚和丁苯酞的重量比为2.5：1～0.5：2.5，可选地为2：1～1：2。

进一步地，所述和厚朴酚和丁苯酞的重量比为1：2。

进一步地，所述和厚朴酚和丁苯酞的重量比为1：1。

进一步地，所述和厚朴酚和丁苯酞的重量比为2：1。

进一步地，所述和厚朴酚的浓度大于等于1μM，可选地为大于等于1.25μM，可选地为1.25～5μM。

进一步地，所述丁苯酞的浓度大于等于2μM，可选地为大于等于2.5μM，可选地为2.5～10μM。

进一步地，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂或胃肠外制剂的形式。

进一步地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。

进一步地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂。

进一步地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。

另一方面，提供一种所述的中药单体组合物在制备预防和/或治疗AD的药物中的应用。

进一步地，所述中药单体组合物作为乳酸脱氢酶(LDH)释放的抑制剂。

有益效果

本发明的中药单体组合物—和厚朴酚和丁苯酞中药单体组合，可安全有效的减少AD细胞模型的细胞毒性，两个中药单体的组合用药优于单个中药单体的效果，且联合指数小于1，显示具有协同增强作用，尤其是和厚朴酚和丁苯酞在1：2的配比时协同增效作用显著。和厚朴酚联合丁苯酞可以用于预防或治疗AD，且具有协同增强作用。

上述说明仅为本发明技术方案的概述，为了能够更清楚地了解本发明的技术手段并可依据说明书的内容予以实施，同时为了使本发明的上述和其他目的、技术特征以及优点更加易懂，以下列举一个或多个优选实施例，并配合附图详细说明如下。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1为本发明的实施例2的不同Aβ42寡聚体浓度处理SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)；con:阴性对照组；###:与阴性对照组相比P<0.001。

图2为本发明的实施例3的不同浓度HKL对5μM Aβ₄₂寡聚体作用SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)，其中，##:与Aβ₄₂组相比P<0.01,###:与Aβ₄₂组相比P<0.001，HKL指和厚朴酚。

图3为本发明的实施例4不同浓度NBP对5μM Aβ₄₂寡聚体作用SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)，其中，##:与Aβ₄₂组相比P<0.01，NBP指丁苯酞。

图4为本发明的实施例5的不同浓度HKL联合NBP对5μM Aβ₄₂寡聚体作用SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)；#:与Aβ₄₂组相比P<0.05；##:与Aβ₄₂组相比P<0.01；###:与Aβ₄₂组相比P<0.001。

图5为本发明的实施例5的不同浓度HKL、NBP以及HKL联合NBP对5μM Aβ₄₂寡聚体作用SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)。

图6为本发明的实施例5HKL联合NBP对AD细胞模型的药物联合指数。其中，HN1：0.3125μM HKL和0.625μM NBP；HN2:0.625μM HKL和1.25μM NBP；HN3:1.25μM HKL和2.5μMNBP；HN4:2.5μM HKL和5μM NBP；HN5:5μM HKL和10μMNBP。

图7为本发明的实施例6的6.1中的不同浓度HKL联合NBP对5μM Aβ₄₂寡聚体作用SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)；#:与Aβ₄₂组相比P<0.05；##:与Aβ₄₂组相比P<0.01；###:与Aβ₄₂组相比P<0.001。

图8为本发明的实施例6的6.1中的不同浓度HKL、NBP以及HKL联合NBP对5μMAβ₄₂寡聚体作用SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)。

图9为本发明的实施例6的6.1中HKL联合NBP对AD细胞模型的药物联合指数。其中，HN1:1.25μM HKL和1.25μM NBP；HN2:2.5μM HKL和2.5μM NBP；HN3:5μMHKL和5μM NBP。

图10为本发明的实施例6的6.2中的不同浓度HKL联合NBP对5μM Aβ₄₂寡聚体作用SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)；#:与Aβ₄₂组相比P<0.05；##:与Aβ₄₂组相比P<0.01；###:与Aβ₄₂组相比P<0.001。

图11为本发明的实施例6的6.2中的不同浓度HKL、NBP以及HKL联合NBP对5μM Aβ₄₂寡聚体作用SH-SY5Y细胞活力比较(X±SD，n＝3)。

图12为本发明的实施例6的6.2中HKL联合NBP对AD细胞模型的药物联合指数。其中，HN1:1.25μM HKL和0.625μM NBP；HN2:2.5μM HKL和1.25μM NBP；HN3:5μM HKL和2.5μMNBP。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

上述中药单体组合物为AD的预防和/或治疗提供了新的选择。下面通过实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不因此而受到任何限制。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

以下实施例中，各原料均为商购，其中，和厚朴酚购自上海源叶生物科技有限公司，丁酚酞购自石药集团恩必普药业有限公司。

以下实施例中，人源β-淀粉样蛋白1-42(β-amyloid1-42，Aβ1-42)寡聚体(以下简称“Aβ42寡聚体”)购自上海强耀生物科技有限公司。

实施例1材料

1.1实验细胞

SH-SY5Y细胞是一种人类神经母细胞瘤细胞，其分化后可形成类似于人类神经元细胞的细胞系。体外培养SH-SY5Y细胞可用于构建神经元细胞模型，进行神经系统疾病致病机制和治疗的相关研究。SH-SY5Y细胞系来源于国家实验细胞资源共享平台(北京总部)。

1.2主要试剂的配制

(1)DMEM完全培养基：将5mL胎牛血清与500μL青霉素-链霉素(双抗)加入到45mL的DMEM培养基中，配制成50.5mL的DMEM完全培养基。此时血清浓度为10％，双抗浓度为1％，封口膜密封，放置于4℃保存，有效期30天。

(2)Aβ₄₂寡聚体：粉末状的Aβ₄₂多肽以固体形式存储在-80℃待用。配制寡聚体时，将1mg Aβ₄₂多肽取出放置于冰上，用1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(phosphoric acid,Tri(1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropyl)ester,HFIP)溶解使最终肽浓度为1mM，超声10分钟，室温下孵育60分钟。将溶液分装到未硅化的1.5mL离心管中，敞开管盖放回冰上5-10分钟，并在柜式排风罩中常温避光挥发6小时以获得Aβ肽膜。最后，将离心管转移到高速冷冻离心机干燥10分钟，清除所有的HFIP。产生的Aβ₄₂寡聚体在管的底部形成薄而透明的膜，储存于负80℃。当使用Aβ₄₂寡聚体时，将细胞级二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)加入膜状Aβ₄₂寡聚体中，常温超声震荡10s，配制成1mM浓度的Aβ42寡聚体，在4℃下孵育过夜；然后在4℃下，以14,000×g离心10分钟，以去除任何不溶性聚集体。

Aβ₄₂寡聚体工作液：在使用前，用DMEM培养基将1mM浓度的Aβ42寡聚体稀释至所需浓度，以供使用。

(3)HKL药品溶液：将18.78mL DMSO加入到50mg HKL粉末中，微量移液枪吹打数次并放入超声震荡机中常温超声10分钟，使粉末充分溶解。用0.22μm的一次性针头式滤器过滤HKL溶液至50mL离心管中，分装成1mL 10mM的HKL储藏液于1.5mL离心管中，外包裹铝箔纸避光，放置在负80℃保存，避免反复冻融。

(4)NBP药品溶液：将10.5mL DMSO加入到20mg NBP粉末中，微量移液枪吹打数次并放入超声震荡机中常温超声10分钟，使粉末充分溶解。用0.22μm的一次性针头式滤器过滤NBP溶液至50mL离心管中，分装成1mL 10mM的NBP储藏液于1.5mL离心管中，外包裹铝箔纸避光，放置在负80℃保存，避免反复冻融。

(5)MTT溶液：将10mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)加入至50mg MTT粉末中，微量移液枪吹打若干次，置于超声震荡机中震荡5分钟，配制成5mg/mLMTT工作液。用0.22μm的一次性针头式滤器过滤MTT溶液至50mL离心管中，分装成1mL于1.5mL离心管中，外包裹铝箔纸避光，放置在-20℃保存，避免反复冻融。

实施例2：AD细胞模型的构建方法

所采用的AD细胞模型的构建方法已在多篇已发表文章中公开(例如，Liu et al.,Neuroscience Letters,2020；Ikram et al,Molecular Neurobiology,2019)，是一种广泛接受的阿尔茨海默病细胞模型构建方法。

具体程序为：

当细胞处于对数生长期时，将其以1×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔含细胞悬液100μL，使用完全培养基培养24小时，在细胞周围的孔中加入PBS。弃去旧培养基，将孔板分为7个组：第1组为空白对照组，只含有100μL DMEM培养基(含2％血清)而无细胞；第2组为阴性对照组，含有100μL DMEM培养基(含2％血清)；第3-7组为寡聚体组，分别加入含有不同浓度Aβ₄₂寡聚体工作液(0.625μM、1.25μM、5μM、10μM或20μM)的DMEM培养基(含2％血清)100μL，分组情况如表1。每组3个复孔，进行如上操作。置于37℃，5％ CO₂恒温细胞培养箱中24小时，进行后续Aβ₄₂寡聚体浓度的筛选。

表1. 96孔板中各组分组情况

表1中，第3-7组为寡聚体组，每组分别加入含有不同浓度Aβ₄₂寡聚体工作液(0.625μM、1.25μM、5μM、10μM或20μM)。

表1中，培养基指DMEM培养基(含2％血清)。

用MTT试验检测Aβ42寡聚体对细胞活力的影响：各组加入10μl MTT(Sigma，美国)工作液，再次放入37℃、5％ CO₂恒温细胞培养箱中孵育4小时，终止培养，吸弃上清，加入150μL DMSO，在室温下放置15分钟并充分震荡，直至孔中的蓝紫色结晶全部溶解。用酶联免疫监测仪(Thermo)测定570nm和630nm处吸光值，记录结果，每孔最终的吸光值为570nm处吸光值减去630nm处吸光值(检测方法可参考Li et al.,Mol Neurobiol,2022和Subedi etal.,Oxid Med Cell Longev,2019)，以空白对照组为基准调零，计算不同浓度Aβ寡聚体对SH-SY5Y细胞的毒性作用，以明确AD细胞模型构建所需条件。

每组计算数值采用各组3个复孔的平均值，计算公式如下：

细胞活力＝(寡聚体组-空白对照组)÷(阴性对照组-空白对照组)×100％

结果如图1所示，结果表明5μM Aβ寡聚体处理SH-SY5Y细胞24小时可显著产生细胞毒性，神经细胞活力降低，提示AD细胞模型构建成功。本项目后续选择5μM的Aβ₄₂寡聚体进行AD细胞模型建模。

实施例3：和厚朴酚(HKL)对AD细胞的保护作用

当细胞处于对数生长期时，将其以1×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔含SH-SY5Y细胞悬浮液100μL，使用DMEM完全培养基培养24小时，在细胞周围的孔中加入PBS。弃去旧培养基，每板设置8个组：第1组为空白对照组，仅含100μLDMEM培养基(含2％血清)而无细胞；第2组为阴性对照组，含有100μL DMEM培养基(含2％血清)；第3-8组均含有5μM Aβ₄₂寡聚体的DMEM培养基(含2％血清)100μL，其中第3组为寡聚体组，第4-8组为治疗组，还分别有0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM的HKL。每组3个复孔，进行如上操作。置于37℃，5％ CO₂恒温细胞培养箱中24小时，进行后续HKL治疗浓度的筛选。用MTT试验检测Aβ₄₂寡聚体及HKL对细胞活力的影响，实验结果如图2。

图2结果表明：HKL在浓度为0.3125μM时就开始显效，到浓度为5μM时，细胞活力恢复到85.5％。

实施例4：丁苯酞(NBP)对AD细胞的保护作用

当细胞处于对数生长期时，将其以1×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔含SH-SY5Y细胞悬浮液100μL，使用DMEM完全培养基培养24小时，在细胞周围的孔中加入PBS。弃去旧培养基，每板设置8个组：第1组为空白对照组，仅含100μL DMEM培养基(含2％血清)而无细胞；第2组为阴性对照组，含有100μLDMEM培养基(含2％血清)；第3-8组均含有浓度为5μM Aβ₄₂寡聚体的DMEM培养基(含2％血清)100μL，其中，第3组为寡聚体组，第4-8组为治疗组，还分别加入0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM NBP。每组3个复孔，进行如上操作。置于37℃，5％ CO₂恒温细胞培养箱中24小时，进行后续NBP治疗浓度的筛选。用MTT试验检测Aβ₄₂寡聚体及NBP对细胞活力的影响，结果如图3：

图3的结果表明：NBP在浓度为2.5μM时开始显效，到浓度为10μM时，细胞活力恢复到81.3％。

实施例5：HKL和NBP联合对AD细胞的协同增强保护作用

当细胞处于对数生长期时，将其以1×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔含细胞悬液100μL，使用完全培养基培养24小时，在细胞周围的孔中加入PBS。弃去旧培养基，每板设置8个组：第1组为空白对照组，仅含100μL DMEM培养基(含2％血清)而无细胞；第2组为阴性对照组，含有100μL DMEM培养基(含2％血清)；第3-8组均含有浓度为5μM Aβ42寡聚体的DMEM培养基(含2％血清)100μL；其中，第3组为寡聚体组，第4-8组为治疗组，它们在寡聚体组基础上还分别加入HKL和NBP的组合。本项目首先选择HKL：NBP为1：2的比例，分别加入0.3125μM HKL和0.625μM NBP、0.625μM HKL和1.25μM NBP、1.25μM HKL和2.5μM NBP、2.5μM HKL和5μM NBP、5μM HKL和10μM NBP的组合。每组3个复孔，进行如上操作。置于37℃，5％CO₂恒温细胞培养箱中24小时，进行后续药物组合协同作用分析。用MTT试验检测Aβ₄₂寡聚体、HKL联合NBP对细胞活力的影响，结果如图4、5。

图4的结果表明，HKL、NBP联合用药在一定的浓度范围内恢复效果较佳，浓度范围优选为HKL：NBP＝(1.25～5)：(2.5～10)。

由图5可知，除了组合H0.625+N1.25之外，其他药物联合后的细胞活力均显著高于单独用药的细胞活力，证明HKL和NBP联合用药高于单独用药。

化合物联合作用指数分析

进一步计算分析HKL联合NBP的药物联合作用指数(combination index，CI)，CI的计算分析采用中效原理计算，参考国际上公认的参考文献(Chou TC,TalalayP.Quantitative analysis of does-effect relationships:the combined effects ofmultiple drugs or enzyme inhibitors[J].Advances in enzyme regulation,1984,22:27-55.)，CI小于1表示协同作用，CI等于1表示相加作用，CI大于1表示拮抗作用。两化合物联合作用指数的公式为：

式中：

(D)₁——化合物1与别的化合物联合作用产生X效应时所需的浓度；

(D)₂——化合物2与别的化合物联合作用产生X效应时所需的浓度；

(Dx)₁——化合物1单用产生X效应时所需的浓度；

(Dx)₂——化合物2单用产生X效应时所需的浓度。

通过CI值可以定量判断不同化合物间相互作用的性质以及强度。

计算HKL联合NBP五个不同浓度组的联合指数，用CalcuSyn2.0软件计算CI具体如图6所示。

图6结果表明，HKL联合NBP五个不同浓度组的联合指数均小于1，表示HKL联合NBP对AD有协同增强作用。且浓度较大时，浓度范围HKL：NBP＝(1.25～5)：(2.5～10)时，CI＜1，协同作用较强。

实施例6：其他比例HKL和NBP联合对AD细胞的协同增强保护作用

本发明还对HKL和NBP的其它比例进行了研究，探讨HKL和NBP联合对AD细胞的协同增强保护作用，具体如下：

6.1HKL:NBP＝1:1

当细胞处于对数生长期时，将其以1×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔含细胞悬液100μL，使用完全培养基培养24小时，在细胞周围的孔中加入PBS。弃去旧培养基，每板设置6个组：第1组为空白对照组，仅含100μL DMEM培养基(含2％血清)而无细胞；第2组为阴性对照组，含有100μL DMEM培养基(含2％血清)；第3-6组均含有浓度为5μM Aβ42寡聚体的DMEM培养基(含2％血清)100μL；第4-6组为治疗组，它们在寡聚体组基础上分别加入HKL和NBP的组合。选择HKL：NBP为1：1的比例，分别加入含有1.25μM HKL和1.25μM NBP、2.5μM HKL和2.5μM NBP、5μM HKL和5μM NBP的组合。每组3个复孔，进行如上操作。置于37℃，5％CO₂恒温细胞培养箱中24小时，进行后续药物组合协同作用分析。用MTT试验检测Aβ₄₂寡聚体、HKL联合NBP对细胞活力的影响，结果如图7、8。

图7结果表明，HKL、NBP联合用药在一定的浓度范围内恢复效果较佳，浓度范围优选为HKL：NBP＝(1.25～5)：(1.25～5)。

由图8可知，药物联合后的细胞活力均显著高于单独用药的细胞活力，证明HKL和NBP为1：1联合用药时高于单独用药。

进一步计算HKL联合NBP为1：1时的三个不同浓度组的联合指数，用CalcuSyn2.0软件计算CI具体如图9所示。图9结果表明，HKL联合NBP三个不同浓度组的联合指数均小于1，表示HKL联合NBP对AD有协同增强作用。且浓度较大时，浓度范围HKL：NBP＝(1.25～5)：(1.25～5)时，CI＜1，协同作用较强。

6.2HKL:NBP＝2:1

当细胞处于对数生长期时，将其以1×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔含细胞悬液100μL，使用完全培养基培养24小时，在细胞周围的孔中加入PBS。弃去旧培养基，每板设置6个组：第1组为空白对照组，仅含100μL DMEM培养基(含2％血清)而无细胞；第2组为阴性对照组，含有100μL DMEM培养基(含2％血清)；第3-6组均含有浓度为5μM Aβ42寡聚体的DMEM培养基(含2％血清)100μL；其中，第3组为寡聚体组，第4-6组为治疗组，它们在寡聚体组基础上分别加入HKL和NBP的组合。选择HKL：NBP为2：1的比例，分别加入含有1.25μMHKL和0.625μMNBP、2.5μM HKL和1.25μM NBP、5μM HKL和2.5μM NBP的组合。每组3个复孔，进行如上操作。置于37℃，5％ CO₂恒温细胞培养箱中24小时，进行后续药物组合协同作用分析。用MTT试验检测Aβ₄₂寡聚体、HKL联合NBP对细胞活力的影响，结果如图10、11。

图10结果表明，HKL、NBP联合用药在一定的浓度范围内恢复效果较佳，浓度范围优选为HKL：NBP＝(1.25～5)：(0.625～2.5)。

由图11可知，药物联合后的细胞活力均显著高于单独用药的细胞活力，证明HKL和NBP联合用药高于单独用药。

进一步计算HKL联合NBP为2：1时三个不同浓度组的联合指数，用CalcuSyn2.0软件计算CI具体如图12所示。图12结果表明，HKL联合NBP三个不同浓度组的联合指数均小于1，表示HKL联合NBP对AD有协同增强作用。且浓度较大时，浓度范围HKL：NBP＝(1.25～5)：(1.25～5)时，CI＜1，协同作用较强。

所有数据均表示为3个独立实验的平均值±标准差(SD)。组间的差异通过单因素方差分析进行，然后进行Bonferroni校正。P值<0.05被认为具有统计学意义。统计分析由SPSS 24.0执行，并使用GraphPad Prism 8.0分析所有数据和图像。

本发明通过大量的细胞实验首次发现，和厚朴酚和丁苯酞中药单体组合在(1：2)～(2：1)时，尤其是在1：2时，可安全有效的减少AD细胞模型的细胞毒性，两个中药单体的组合用药优于单个中药单体的效果，且联合指数小于1，甚至小于0.3，显示具有协同增强作用，此外，和厚朴酚和丁苯酞在1：2的配比时协同作用更强一些。基于这些发现可知，和厚朴酚联合丁苯酞可以用于预防或治疗AD的防治，且具有协同增强作用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。针对上述示例性实施方案所做的任何简单修改、等同变化与修饰，都应落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于预防或治疗阿尔茨海默病的中药单体组合物，其特征在于，有效成分由和厚朴酚和丁苯酞组成，和厚朴酚和丁苯酞的浓度比为2：1~1：2。

2.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述和厚朴酚和丁苯酞的浓度比为1：2。

3.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述和厚朴酚和丁苯酞的浓度比为1：1。

4.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述和厚朴酚和丁苯酞的浓度比为2：1。

5.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述和厚朴酚的浓度大于等于1μM。

6.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述和厚朴酚的浓度大于等于1.25μM。

7.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述和厚朴酚的浓度为1.25~5μM。

8.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述丁苯酞的浓度大于等于2μM。

9.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述丁苯酞的浓度大于等于2.5μM。

10.根据权利要求1所述的中药单体组合物，其特征在于，所述丁苯酞的浓度为2.5~10μM。

11.根据权利要求1至10任一所述的中药单体组合物，其特征在于，所述组合物为鼻喷剂或口服制剂。

12.根据权利要求11所述的中药单体组合物，其特征在于，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。

13.根据权利要求11所述的中药单体组合物，其特征在于，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂和膏剂。

14.根据权利要求1至10任一所述的中药单体组合物，其特征在于，所述组合物为舌下片制剂。

15.根据权利要求1至10任一所述的中药单体组合物，其特征在于，所述组合物为胃肠外制剂。

16.根据权利要求15所述的中药单体组合物，其特征在于，所述胃肠外制剂为经皮剂或注射制剂。

17.根据权利要求15所述的中药单体组合物，其特征在于，所述胃肠外制剂为软膏剂、硬膏剂。

18.根据权利要求15所述的中药单体组合物，其特征在于，所述胃肠外制剂为外用液剂。

19.一种权利要求1至18任一所述的中药单体组合物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。