CN115919803A - 一种水果多酚纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种水果多酚纳米粒及其制备方法和应用。本发明提供了一种水果多酚纳米粒，按照质量份数计，包括以下制备原料：水果多酚5～8份、羧甲基壳聚糖40～45份和壳聚糖盐酸盐45～50份；所述水果多酚、羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐构成三维交联结构；所述水果多酚纳米粒的粒径为200～350nm。本发明提供的水果多酚纳米粒能够改善多酚的稳定性，延长水果多酚在人体中的保留时间，减少其在肠道环境中的降解，并持续释放。同时，本发明所述水果多酚纳米粒粒径小，有助于在人体内递送多酚，利于多酚的吸收，进一步地提高其生物利用度。

Description

一种水果多酚纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种水果多酚纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

水果多酚是一种天然的抗氧化剂，具有抗氧化、降血脂血糖、抗肿瘤和防辐射等功效。但是，由于多酚分子结构中存在多个酚羟基，化学性质很活泼，在加工和贮藏过程中容易产生化学变化，失去其原有功能或产生人工副产物。并且，由于其性质活泼，多酚在口服过程中易被降解，生物利用度较差，限制了其在功能食品或药物中的应用。目前已探索研究多种方法提高多酚的药理活性表达和稳定性，诸如基团修饰、胶囊化、与其它成分协同使用等，其中纳米包埋技术发展前景最为广阔。食品级高分子纳米颗粒通过增强多酚的溶解度，减少其在肠道环境中的降解，发挥改善多酚生物利用度的作用。

然而，由于纳米粒子的比表面积比较大和粒径较小，容易引起团聚，导致性能降低。传递体系若采用单一生物大分子制备，也存在理化稳定性差、包埋物质生物利用率低等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水果多酚纳米粒及其制备方法和应用，本发明提供的水果多酚纳米粒具有良好的稳定性和生物利用度。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种水果多酚纳米粒，按照质量份数计，包括以下制备原料：水果多酚5～8份、羧甲基壳聚糖40～45份和壳聚糖盐酸盐45～50份；

所述水果多酚、羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐构成三维交联结构；

所述水果多酚纳米粒的粒径为200～350nm。

优选地，所述水果多酚于所述三维交联结构中的包封率为75％以上。

优选地，所述水果多酚包括山楂多酚、蓝莓多酚、草莓多酚和桑葚多酚中的一种或多种。

本发明还提供了上述技术方案所述水果多酚纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

将水果多酚与羧甲基壳聚糖溶液进行第一混合，得到第一混合液；

将所述第一混合液与壳聚糖盐酸盐溶液进行第二混合，得到第二混合液；

将所述第二混合液进行高压微射流均质处理，得到第三混合液；

将所述第三混合液进行冷冻干燥，得到所述水果多酚纳米粒。

优选地，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为3～3.6mg/mL；

所述水果多酚与所述羧甲基壳聚糖溶液中羧甲基壳聚糖的质量比为5～8：40～45；

所述第一混合前还包括将羧甲基壳聚糖溶液进行过滤；所述过滤采用微孔滤膜；所述微孔滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm。

优选地，所述壳聚糖盐酸盐溶液的浓度为1.4～1.8mg/mL；

所述水果多酚与所述壳聚糖盐酸盐溶液中壳聚糖盐酸盐的质量比为5～8：45～50；

所述第二混合前还包括将壳聚糖盐酸盐溶液进行过滤；所述过滤采用微孔滤膜；所述微孔滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm。

优选地，所述第一混合的方式为搅拌；所述搅拌的时间为1～1.5h。

优选地，所述第二混合包括将所述第一混合液滴入所述壳聚糖盐酸盐溶液中后，搅拌；

所述搅拌的时间为20～30min。

优选地，所述高压微射流均质处理包括：在压强为10000～15000psi条件下处理1次后，在压强为25000～30000psi条件下处理2～3次。

本发明还提供了上述技术方案所述的水果多酚纳米粒或上述技术方案所述制备方法得到的水果多酚纳米粒在制备改善肠道菌群、细胞抗氧化和抑菌药物或食品中的应用。

本发明提供了一种水果多酚纳米粒，按照质量份数计，包括以下制备原料：水果多酚5～8份、羧甲基壳聚糖40～45份和壳聚糖盐酸盐45～50份；所述水果多酚、羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐构成三维交联结构；所述水果多酚纳米粒的粒径为200～350nm。在本发明中，羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐具有良好的生物相容性、微生物降解性，安全无毒，其中羧甲基壳聚糖水溶性良好，壳聚糖盐酸盐在中性pH下溶解度更优，本发明提供的水果多酚纳米粒中水果多酚、羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐构成三维交联结构，能够增强水果多酚纳米粒的溶解度，改善水果多酚的稳定性，延长水果多酚在人体肠道中的保留时间，减少其在肠道环境中的降解，并持续释放，提高水果多酚的生物利用度。同时，本发明所述水果多酚纳米粒粒径小，有助于在人体内递送水果多酚，利于水果多酚的吸收，进一步地提高其生物利用度。

同时，本发明提供的水果多酚纳米粒中多酚类物质能够在结肠得到有效释放，在肠道发酵阶段，能够较好地被肠液消化，产生乙酸、丙酸、丁酸等对人体健康有益的游离脂肪酸。另外，水果多酚纳米粒有良好的抑菌性，对革兰氏阴性菌的抑菌效果高于对革兰氏阳性菌的抑菌效果。水果多酚纳米粒在0～75μg/mL的细胞浓度下毒性较低，使用安全，并能有效改善H₂O₂诱导的肝脏细胞(LO2)和脐静脉内皮细胞(ECV304)氧化应激，减少细胞氧化损伤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1所述山楂多酚纳米粒的分子分布模拟图；

图2为实施例1所述山楂多酚纳米粒以及不经高压微射流均质处理的负载山楂多酚的羧甲基壳聚糖-壳聚糖盐酸盐颗粒粒径分布图；

图3为山楂多酚、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐及实施例1所得山楂多酚纳米粒的热失重量曲线图；

图4为实施例1所述山楂多酚纳米粒以及山楂多酚在模拟胃肠道环境下的释放曲线图；

图5为实施例1所述山楂多酚纳米粒对结肠发酵液的DPPH自由基清除率数据图；

图6为实施例1所述山楂多酚纳米粒对大肠杆菌和李斯特氏菌的抑菌圈图片；

图7为实施例1所述山楂多酚纳米粒对细胞氧化应激的抑制效果数据图。

具体实施方式

本发明提供了一种水果多酚纳米粒，按照质量份数计，包括以下制备原料：水果多酚5～8份、羧甲基壳聚糖40～45份和壳聚糖盐酸盐45～50份；

所述水果多酚、羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐构成三维交联结构；

所述水果多酚纳米粒的粒径为200～350nm。

在本发明中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。

在本发明中，所述水果多酚于所述三维交联结构中的包封率优选为75％以上，更优选为78～99％，最优选为80～88％。

按照质量份数计，本发明提供的水果多酚纳米粒的制备原料包括水果多酚5～8份，优选为6～7份，更优选为6份。在本发明中，所述所述水果多酚优选包括山楂多酚、蓝莓多酚、草莓多酚和桑葚多酚中的一种或多种，更优选包括山楂多酚、蓝莓多酚和桑葚多酚中的一种或多种，最优选包括山楂多酚和/或蓝莓多酚；所述山楂多酚优选包括原花青素B2、表儿茶素和绿原酸；当所述水果多酚为上述具体选择中的两种以上时，本发明对所述水果多酚的配比没有任何特殊的限定。

在本发明中，所述水果多酚优选采用市售产品或制备得到；所述水果多酚的制备方法优选包括以下步骤：

将水果与水进行打浆，得到第一水果浆；

将所述第一水果浆与酸化乙醇混合，得到第二水果浆；

将所述第二水果浆依次进行搅拌、过滤和浓缩，得到水果多酚粗提液；

将所述水果多酚粗提液依次进行纯化和干燥，得到所述水果多酚。

本发明将水果与水进行打浆，得到第一水果浆。

在本发明中，所述水果的质量与水的体积比优选为100～150g：100～200mL，更优选为110～140g：120～180mL，最优选为120～130g：140～160mL；本发明对所述打浆的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。

得到所述第一水果浆后，本发明将所述第一水果浆与酸化乙醇混合，得到第二水果浆。

在本发明中，所述酸化乙醇的质量与第一水果浆的体积比为优选为1g：6～10mL，更优选为1g：7～9mL，最优选为1g：8～9mL；所述酸化乙醇中乙醇的体积分数优选为65～85％，更优选为70～80％，最优选为72～75％；所述酸化乙醇中优选包括盐酸；所述酸化乙醇中盐酸的质量百分含量优选为0.08～0.12％，更优选为0.09～0.11％，最优选为0.1％；本发明对所述混合的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式使所述第二水果浆混合均匀即可。

得到所述第二水果浆后，本发明将所述第二水果浆依次进行搅拌、过滤和浓缩，得到水果多酚粗提液。

在本发明中，所述搅拌的温度优选为40～45℃；更优选为41～44℃，最优选为42～43℃；时间优选为1～2h，更优选为1.2～1.8h，最优选为1.4～1.6h；所述搅拌优选在避光条件下进行。

本发明对所述过滤的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可；在本发明中，所述浓缩优选采用真空蒸发浓缩；本发明对所述真空蒸发浓缩的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式得到所述水果多酚粗提液即可。

得到所述水果多酚粗提液后，本发明将所述水果多酚粗提液依次进行纯化和干燥，得到所述水果多酚。

所述纯化优选为过滤；所述过滤优选依次采用滤纸和树脂进行，所述树脂优选为AB-8大孔树脂或D101大孔树脂；所述纯化优选在避光条件下进行；本发明对所述纯化和冷冻干燥的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式进行即可。

以所述水果多酚的质量份数为基准，本发明提供的水果多酚纳米粒的制备原料包括羧甲基壳聚糖40～45份，优选为41～43份，更优选为42份。

以所述水果多酚的质量份数为基准，本发明提供的水果多酚纳米粒的制备原料包括壳聚糖盐酸盐45～50份，优选为47～49份，更优选为48份。

在本发明中，所述羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐两种壳聚糖的作用是具有良好的生物相容性、微生物降解性、安全无毒等优良性能，延长被包封活性物质在人体肠道中的保留时间，持续释放，提高被包封物质的生物利用度。其中，羧甲基壳聚糖(CMCS)是一种含有正负电荷的聚电解质，其具有的羧甲基可以与胺基或羟基发生化学选择性具有良好的水溶性。壳聚糖盐酸盐(CHC)是一种带正电荷的聚电解质模型，在中性pH下的溶解度比CMCS更高。两者可作为理想的口服递送载体。

本发明提供的水果多酚纳米粒中水果多酚、羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐构成三维交联结构，能够增强水果多酚纳米粒的溶解度，改善水果多酚的稳定性，延长水果多酚在人体肠道中的保留时间，减少其在肠道环境中的降解，并持续释放，提高水果多酚的生物利用度。同时，本发明所述水果多酚纳米粒粒径小，有助于在人体内递送水果多酚，利于水果多酚的吸收，进一步地提高其生物利用度。

同时，本发明提供的水果多酚纳米粒中多酚类物质能够在结肠得到有效释放，在肠道发酵阶段，能够较好地被肠液消化，产生乙酸、丙酸、丁酸等对人体健康有益的游离脂肪酸。另外，水果多酚纳米粒有良好的抑菌性，对革兰氏阴性菌的抑菌效果高于对革兰氏阳性菌的抑菌效果。水果多酚纳米粒在0～75μg/mL的细胞浓度下毒性较低，使用安全，并能有效改善H₂O₂诱导的肝脏细胞(LO2)和脐静脉内皮细胞(ECV304)氧化应激，减少细胞氧化损伤。

本发明还提供了上述技术方案所述水果多酚纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

将水果多酚与羧甲基壳聚糖溶液进行第一混合，得到第一混合液；

将所述第一混合液与壳聚糖盐酸盐溶液进行第二混合，得到第二混合液；

将所述第二混合液进行高压微射流均质处理，得到第三混合液；

将所述第三混合液进行冷冻干燥，得到所述水果多酚纳米粒。

本发明将水果多酚与羧甲基壳聚糖溶液进行第一混合，得到第一混合液。

在本发明中，所述第一混合前还优选包括将羧甲基壳聚糖溶液进行过滤；所述过滤优选采用微孔滤膜；所述微孔滤膜的孔径优选为0.22μm或0.45μm，更优选为0.45μm。

在本发明中，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度优选为3～3.6mg/mL，更优选为3.2～3.5mg/mL，最优选为3.5mg/mL；所述羧甲基壳聚糖溶液的溶剂优选为水；所述水果多酚与所述羧甲基壳聚糖溶液中羧甲基壳聚糖的质量比优选为5～8：40～45，更优选为6～7：41～43，最优选为6：42。

在本发明中，所述第一混合的方式优选为搅拌；所述搅拌优选为磁力搅拌；所述搅拌的时间优选为1～1.5h，更优选为1.1～1.4h，最优选为1.2～1.3h；本发明对所述搅拌的过程没有其他任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式使所述第一混合液分散均匀即可即可。

得到所述第一混合液后，本发明将所述第一混合液与壳聚糖盐酸盐溶液进行第二混合，得到第二混合液。

在本发明中，所述第二混合前还优选包括将壳聚糖盐酸盐溶液进行过滤；所述过滤优选采用微孔滤膜；所述微孔滤膜的孔径优选为0.22μm或0.45μm，更优选为0.45μm。

在本发明中，所述壳聚糖盐酸盐溶液的浓度优选为1.4～1.8mg/mL，更优选为1.5～1.7mg/mL，最优选为1.6mg/mL；所述壳聚糖盐酸盐溶液的溶剂优选为水；所述水果多酚与所述壳聚糖盐酸盐溶液中壳聚糖盐酸盐的质量比优选为5～8：45～50，更优选为6～7：47～49，最优选为6：48。

在本发明中，所述第二混合优选包括将所述第一混合液滴入所述壳聚糖盐酸盐溶液中；所述第一混合液滴入的速度优选为1～5drop/s，更优选为1～3drop/s，最优选为1～2drop/s；所述第一混合液滴入所述壳聚糖盐酸盐溶液中后，还优选包括搅拌；所述搅拌优选为磁力搅拌；所述搅拌的时间优选为20～30min，更优选为22～28min，最优选为24～26min；本发明对所述搅拌的过程没有其他任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式使所述第二混合液分散均匀即可即可。

在本发明中，所述第一混合和第二混合中发生了离子交联反应，即壳聚糖在酸性条件下带正电的氨基与带负电的聚阴离子之间发生离子交联反应而得到的一定大小的纳米粒子的分散体系。该方法制备过程简单，条件可控。

得到所述第二混合液后，本发明将所述第二混合液进行高压微射流均质处理，得到第三混合液。

在本发明中，所述高压微射流均质处理优选包括：在压强为10000～15000psi条件下处理1次后，在压强为25000～30000psi条件下处理2～3次。

得到所述第三混合液后，本发明将所述第三混合液进行冷冻干燥，得到所述水果多酚纳米粒。

在本发明中，所述真空冷冻干燥的温度优选为-60～-20℃，更优选为-50～-30℃，最优选为-40℃。

在本发明中，所述动态高压微流态化技术可使物料达到分散、均质、乳化、颗粒粒度纳米等作用，并能改变物料的结构和特性。得到结构更致密、颗粒分布更均匀的纳米球。并且，技术不需要复杂的设备，且省时省力、绿色环保。

本发明提供的制备方法通过超高压微射流技术和离子交联化技术制备，实现水果多酚物质的高效利用和高质量发展，该制备方法具有原料来源丰富、工艺方法操作简便、成本低、易于产业化、无毒副作用等优点。

本发明还提供了上述技术方案所述的水果多酚纳米粒或上述技术方案所述制备方法得到的水果多酚纳米粒在制备改善肠道菌群、细胞抗氧化和抑菌药物或食品中的应用。

本发明对所述应用的过程没有任何特殊的要求，采用本领域技术人员熟知的应用方式即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的水果多酚纳米粒及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

山楂多酚(HP)的制备：称取100g山楂果实与100mL蒸馏水打浆，按照1g：6mL的比例加入乙醇体积分数为70％的酸化乙醇(含质量百分含量为0.1％的盐酸)，于45℃避光搅拌提取1.5h，过滤收集滤液进行真空蒸发浓缩，得到山楂多酚粗提液。滤纸过滤，收集滤液，用AB-8大孔树脂在避光条件下纯化，真空冷冻干燥，得到山楂多酚粉末，-20℃避光贮藏；

采用离子凝胶化的方法制备山楂多酚纳米粒：取6mg HP粉末加入12mL3.5mg/mL的用0.45μm微孔滤膜过滤的羧甲基壳聚糖(CMCS)水溶液中，磁力搅拌1h充分混合，得到均匀的第一混合液；

用注射器将第一混合液以2drop/s的速度缓慢滴入30mL 1.6mg/mL的用0.45μm微孔滤膜过滤的壳聚糖盐酸盐(CHC)水溶液中，磁力搅拌30min充分混合，得到均匀的第二混合液；

将第二混合液进行高压微射流均质(DHPM)处理，处理条件为10000psi 1次、25000psi 3次，得到稳定的第三混合液。-40℃真空冷冻干燥得到山楂多酚纳米粒(HPN)，-20℃避光贮藏。

所得山楂多酚纳米粒的分子分布模拟图见图1。由图1可见，红，绿和黄色是多酚分子，粉色是CMCS，蓝色是CHC。原花青素B2、表儿茶素、绿原酸是HP的主要多酚组分，模拟图上看5种分子的分子数量比例为：原花青素B2：表儿茶素：绿原酸：CMCS：CHC＝2：4：3：77：29。多酚被包裹在两种壳聚糖中间，形成纳米粒，包封率为80％。CMCS会填充纳米颗粒上的孔洞，使纳米颗粒保持稳定。

实施例2

按照实施例1所述技术方案制备草莓多酚纳米粒，区别仅在于，在提取草莓多酚时，草莓浆液与酸化乙醇的混合比为1g：7mL。

实施例3

按照实施例1所述技术方案制备蓝莓多酚纳米粒，区别仅在于，在提取蓝莓多酚时，蓝莓浆液与酸化乙醇的混合比为1g：7mL。

实施例4

按照实施例1所述技术方案制备桑葚多酚纳米粒，区别仅在于，在提取桑葚多酚时，桑葚浆液与酸化乙醇的混合比为1g：7mL。

对比例

按照实施例1所述技术方案制备负载山楂多酚的CMCS-CHC颗粒，区别仅在于，不包括DHPM处理步骤。

测试例1

粒径分析：使用激光粒度仪测定实施例1所得HPN以及对比例所得负载山楂多酚的CMCS-CHC颗粒的粒径，测试温度为25℃、散射光角度90°、折射率1.333，实施例1所述山楂多酚纳米粒以及不经高压微射流均质处理的负载山楂多酚的CMCS-CHC颗粒粒径分布图如图2所示。由图2可见，对比例所得负载山楂多酚的CMCS-CHC颗粒平均粒径为16457nm，粒径较大。实施例1所得HPN粒径分布均匀、平均粒径为301.12nm。即DHPM处理极大地减小了粒径，降低了纳米颗粒的分布指数并使颗粒更均匀。

测试例2

热重分析：分别精确称取HP、CMCS、CHC及实施例1所得HPN各5mg，以氮气作保护气，扫描温度范围20～600℃，升温速率10℃/min，流量10mL/min，对以上样品进行热重分析。热失重量曲线图如图3所示。

由图3可见，HP在88℃左右开始分解，后持续分解，未表现出明显失重现象，说明HP的存在形式是一种无定形态。有趣的是，CHC和HPN只有一个失重峰，分别出现在195.5℃和205.5℃左右，失重率分别为54.27％和47.31％，结果表明HPN和CHC具有较相似的热稳定性。CHC、CMCS和HPN在200.5～355.5℃范围内快速失重。当温度达到600℃时，HP、CHC、CMCS和HPN的保留率分别为51.52％、34.60％、43.32％和41.58％。HPN失重主要因为CMCS和CHC存在。以上结果表明，山楂多酚被壳聚糖纳米粒成功包载，因此具有更高的热稳定性。

测试例3

测试HPN的胃肠道消化缓释作用：精确称取250mg实施例1所得HPN于50mL模拟胃液中，37℃、180r/min摇床震荡释放2h，相同时间间隔下吸取2mL消化液，采用福林酚法测定样品中游离多酚的含量。待模拟胃消化结束后，调节pH至6.8终止胃消化，加入50mL模拟肠液，37℃、180r/min摇床震荡释放4h，相同时间间隔下吸取2mL消化液，采用福林酚法测定样品中游离多酚的含量。以相同多酚含量为对照组，方法同上测定山楂多酚的模拟胃肠道消化。山楂多酚的累计释放率公式如下：

E：药物累计释放量；V_p：PBS的置换体积；V₀：释放介质总体积；C_i：第i次置换取样时释放液的浓度；m：纳米粒子所载药物的总质量；n：置换PBS的次数。

测试结果如图4所示。由图4可见，HP在模拟胃液中前0.5h处于突释期，胃消化结束后释放率达到43.6％，而HP在肠消化阶段前1h也处于突释期，肠消化1h后释放率高达70.6％，肠消化4h后释放率高达73.2％，说明HP在胃肠液环境中极不稳定。HPN在模拟胃液中后1.5h处于缓释期，模拟胃消化结束后释放率达到了47.4％。而HPN肠消化4h后释放率达到了50.22％，说明HPN在模拟肠液中逐渐缓慢降解，多糖壁材在碱性条件下展开后沉淀，从而使HP释放出来。此结果表明，HPN可有效保护其中的山楂多酚的生物活性，使其不被胃液消化，同时能够在肠液中达到缓慢释放的目的。

测试例4

测试HPN在人体肠道微生物群发酵中的作用：取模上述拟胃肠道消化后样本进行体外人体肠道微生物群发酵。

(1)培养基及改性生理盐水的制备

结肠培养基的制备：取蛋白胨2.0g，酵母膏2.0g，氯化钠0.1g，K₂HPO₄0.04g，KH₂PO₄0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.01g，CaCl₂5.07mg，NaHCO₃2g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，胆盐0.5g，雷公藤红素5mg，吐温-80 2.0mL，葡萄糖5g，加入1L蒸馏水加热至溶解，将pH值调节至7.0，置于121℃高压灭菌锅中灭菌20min。

改性生理盐水的制备：称取半胱氨酸-盐酸0.5g和氯化钠9.0g混合，加入1L蒸馏水调节pH值至7.0，置于121℃高压灭菌锅中灭菌20min，制成改良生理盐水溶液。

(2)肠道微生物群发酵

将四名符合要求志愿者(无已知胃肠道疾病、BMI：20.3～21.8kg/m2)的粪便等量混合后悬浮在改良生理盐水中，通过涡流混合获得10％(g/mL)的粪便悬浮液。悬液在4℃下300g离心5min，取上清液作为粪浆。在厌氧条件下将粪浆与营养培养基以1：1的比例混合，得到人体肠道微生物菌液。将肠道微生物菌液与胃肠道消化后的样品按1：1比例混合，37℃厌氧培养24h，分别于0、6、12、24h采集样品，20000g离心15min后，收集上清液并保存在-80℃中进行进一步分析。

(3)结肠消化液中纳米粒的DPPH自由基清除率的测定

采用3.2.4中所述方法，对结肠消化后0、6、12、24h时间点的样本进行DPPH自由基清除率的测定。

(4)短链脂肪酸定量分析

用不同时间点采集的上清液进行短链脂肪酸定量分析，包括乙酸(Acetic acid)、丙酸(Propionic acid)、丁酸(Butyric acid)、异丁酸(Isobutyric acid)、戊酸(Valericacid)、异戊酸(Isovaleric acid)和己酸(Caproic acid)。

取样本于2mL离心管中，加纯水稀释10倍，取稀释样本于2mL离心管中，加50μL15％磷酸，再加75μg/mL的内标(异己酸)溶液10μL和乙醚140μL涡旋振荡1min，于4℃、12000rpm离心10min，取上清上机检测。色谱柱为Agilent HP-INNOWAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，采用分流进样方式，进样量1μL，分流比10：1。进样口温度250℃；离子源温度300℃；传输线温度250℃。程序起始温度90℃；以10℃/min升温至120℃；再以5℃/min升温至150℃；最后以25℃/min升温至250℃维持2min。载气为氦气，载气流速1.0mL/min。测试结果如表1和图5所示。

表1样本短链脂肪酸含量

由表1和图5可见，肠道发酵阶段不同时间点采集样本中的短链脂肪酸含量变化，包含了乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸。其中，乙酸、丙酸和丁酸为肠道中的主要游离脂肪酸。乙酸可作为大脑、心脏和外周组织的能量来源，也可通过中枢稳态机制抑制食欲。此外，丙酸和丁酸可帮助降低血清胆固醇，改善肥胖，提高胰岛素敏感性。除己酸外，其他几种游离脂肪酸随着发酵时间的增加均呈现增加趋势。发酵6h后丙酸由原来的62.150μg/mL显著增加到503.372μg/mL，而其在6～12h之间，呈现缓慢增加的趋势，当发酵时间达到12h后趋于稳定，此时含量几乎没有变化。除此之外乙酸和丁酸在0～24h间呈现出近似直线增长的趋势，乙酸发酵结束后含量达到了1446.803±12.458μg/mL，丁酸发酵结束后含量达到了98.633μg/mL。以上结果说明，山楂多酚纳米粒在肠道发酵阶段，能够较好地被肠液消化，从而释放出其中的多酚类物质，产生的乙酸、丙酸、丁酸等游离脂肪酸，能够对人体起到有效作用。

测试例5

测试HPN的抑菌作用：

(1)培养基的制备

LB(LuriaBertani)培养基：用LB固体培养基(干粉)40g和1000mL蒸馏水配制固体培养基。

脑心浸液培养基：肉汤蛋白胨10g、牛脑浸粉5g、氯化钠5g、葡萄糖2g、磷酸氢二钠2.5g、蒸馏水1000mL，用1M的NaOH调节pH至7.2～7.6。121℃灭菌20min，固体培养基则用脑心浸液琼脂52g和1000mL蒸馏水配制。

(2)抑菌圈测定

将200μL的无害李斯特增生菌和大肠杆菌菌液(10⁶CFU/mL)均匀的涂在琼脂平板上。将滤纸剪成6mm大小的圆形滤纸片，将滤纸片浸泡在不同浓度纳米粒子溶液中5min，用镊子取出放入已经涂好菌液的平板中。30min后，将制备好的所有平板倒置培养24h，测试抑菌圈的大小。后续抑菌实验中山楂多酚纳米粒子浓度均为纳米粒子质量/溶剂体积，纳米粒中山楂多酚质量可根据纳米粒子质量×包封率计算所得。

(3)最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

采用二倍梯度稀释法测定山楂多酚和实施例1所得山楂多酚纳米粒的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。

取8根试管编号为1～8，1号试管中加入1mL山楂多酚溶液或纳米粒子溶液和1mL培养基，2～8号试管中加入1mL培养基，吸取200μL大肠杆菌或李斯特菌菌液(10⁶CFU/mL)加入1号试管中混匀后吸取1mL溶液加入2号试管，2号试管混匀后吸取1mL加入3号试管，重复以上操作至8号试管，吸取8号试管中1mL液体弃去。以不加纳米粒子溶液的试管作阳性对照，以不加菌液的试管作阴性对照。将试管置于37℃、180rpm恒温摇床中培养24h观察试管中液体浑浊情况。若液体澄清的则为无菌生长，若浑浊则为有菌生长。以澄清试管对应的最小山楂多酚溶液浓度或纳米粒子溶液浓度为该山楂多酚或纳米粒子对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。续而从各试管分别取出200μL液体，接至已编号的LB培养基或脑心浸液培养基平板上，再放入37℃恒温培养箱中继续培养24h，观察是否有菌落长出。能够抑制99.9％的细菌生长的浓度定义为最小杀菌浓度(MBC)。山楂多酚纳米粒对大肠杆菌和李斯特氏菌的抑菌圈照片如图6所示。

由图6可见，相同山楂多酚纳米粒浓度下，大肠杆菌的抑菌圈直径要大于李斯特氏菌的抑菌圈直径，说明山楂多酚纳米粒对大肠杆菌的抑制效果要好于李斯特氏菌。山楂多酚纳米粒浓度为10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL时，大肠杆菌抑菌圈直径7.71±0.215mm、8.16±0.196mm和7.07±0.503mm，而李斯特氏菌直径为6.986±0.245mm、7.72±0.367mm和7.05±0.404mm，且山楂多酚纳米粒的抑菌效果随着溶液浓度的增加呈现出了先增大后降低的趋势。

采用二倍稀释法测定山楂多酚及纳米粒对大肠杆菌和李斯特氏菌的MIC和MBC，山楂多酚对大肠杆菌和李斯特氏菌的MIC均为0.625mg/mL、MBC均为1.25mg/mL。纳米粒对大肠杆菌和李斯特氏菌MIC分别为1.25mg/mL和0.9375mg/mL、MBC分别为2.5mg/mL和1.875mg/mL。结果说明了山楂多酚纳米粒具有杀灭大肠杆菌和李斯特氏菌的作用。

测试例6

测试HPN的细胞抗氧化作用：

ECV304细胞用含15％胎牛血清的M199培养基，LO2细胞用含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5％CO₂的培养箱(HF-90上海力申，中国)内培养。取处于对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔细胞量10⁴个。置于37℃培养ECV304细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后进行细胞处理。细胞分为对照组，模型组，用100μM过氧化氢处理；HPN组，用100μM过氧化氢处理和75μg/mL的纳米粒子处理，分别作用48h，置于37℃培养。将LO2细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后进行细胞处理。分为对照组，模型组，用300μM过氧化氢处理；HPN组，用300μM过氧化氢处理和100μg/mL的纳米粒子处理，分别作用48h，置于37℃培养。收集各组细胞，用PBS洗涤细胞2次。分别加入1mL的DCFH-DA稀释液(按照1：1000用培养基稀释)混匀，置于37℃，培养箱内孵育20min，每隔5min颠倒混匀一下。用PBS洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。500μL PBS重悬细胞后，进行流式检测ROS生成。ROS、MDA、SOD测定依据试剂盒说明书。测试结果如图7所示。

由图7可见，本发明利用H₂O₂成功构建了细胞氧化应激模型。过氧化氢诱导的LO2和ECV304细胞ROS产量增大，细胞内发生氧化应激反应。HPN可以显著改善这种情况，与模型组相比，HPN在LO2和ECV304细胞内减少ROS产生40.1％和38.3％(p<0.01)。HPN对过氧化氢诱导的细胞活性增殖和细胞内氧化应激改善结果表明HPN组LO2和ECV304细胞活性相较于模型组均有显著升高(p<0.01)。分别增殖45.7％和38.7％。模型组MDA含量相较于对照组大幅上升，而加入HPN的LO2和ECV304细胞细胞中MDA含量有了显著的降低(p<0.05)。分别降低48.4％和54.0％。HPN组的LO2和ECV304细胞SOD含量较模型组也得到了显著提升(p<0.05)，分别提升177.3％和209.3％。以上结果表明，HPN具有低细胞毒性，能有效改善H₂O₂诱导的细胞氧化应激，减少细胞氧化损伤。

正常生理情况下，机体内自由基的产生、清除、利用等活动在严格地调控下维持动态平衡，一旦平衡被打破，就会导致氧化应激，影响到基因的转录、细胞信号的传导、器官的功能以及细胞的增殖、分化、凋亡和坏死等许多生理和病理过程，导致疾病的发生和发展。研究发现，MDA是脂质过氧化物代谢产物，其含量反映机体内脂质过氧化程度，间接反映细胞的损伤程度。说明适宜浓度的HPN能有效缓解H₂O₂对细胞的氧化损伤，提高细胞的抗氧化能力。

由上述实施例可见，本发明提供的本发明提供的水果多酚纳米粒中水果多酚、羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐构成三维交联结构，能够增强水果多酚纳米粒的溶解度，改善水果多酚的稳定性，延长水果多酚在人体肠道中的保留时间，减少其在肠道环境中的降解，并持续释放，提高水果多酚的生物利用度。同时，本发明所述水果多酚纳米粒粒径小，有助于在人体内递送水果多酚，利于水果多酚的吸收，进一步地提高其生物利用度。

同时，本发明提供的水果多酚纳米粒中多酚类物质能够在结肠得到有效释放，在肠道发酵阶段，能够较好地被肠液消化，产生乙酸、丙酸、丁酸等对人体健康有益的游离脂肪酸。另外，水果多酚纳米粒有良好的抑菌性，对革兰氏阴性菌的抑菌效果高于对革兰氏阳性菌的抑菌效果。水果多酚纳米粒在0～75μg/mL的细胞浓度下毒性较低，使用安全，并能有效改善H₂O₂诱导的肝脏细胞(LO2)和脐静脉内皮细胞(ECV304)氧化应激，减少细胞氧化损伤。

本发明提供的制备方法通过超高压微射流技术和离子交联化技术制备，实现水果多酚物质的高效利用和高质量发展，该制备方法具有原料来源丰富、工艺方法操作简便、成本低、易于产业化、无毒副作用等优点。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种水果多酚纳米粒，其特征在于，按照质量份数计，包括以下制备原料：水果多酚5～8份、羧甲基壳聚糖40～45份和壳聚糖盐酸盐45～50份；

所述水果多酚、羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐构成三维交联结构；

所述水果多酚纳米粒的粒径为200～350nm。

2.根据权利要求1所述的水果多酚纳米粒，其特征在于，所述水果多酚于所述三维交联结构中的包封率为75％以上。

3.根据权利要求1所述的水果多酚纳米粒，其特征在于，所述水果多酚包括山楂多酚、蓝莓多酚、草莓多酚和桑葚多酚中的一种或多种。

4.权利要求1～3任一项所述水果多酚纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将水果多酚与羧甲基壳聚糖溶液进行第一混合，得到第一混合液；

将所述第一混合液与壳聚糖盐酸盐溶液进行第二混合，得到第二混合液；

将所述第二混合液进行高压微射流均质处理，得到第三混合液；

将所述第三混合液进行冷冻干燥，得到所述水果多酚纳米粒。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为3～3.6mg/mL；

所述水果多酚与所述羧甲基壳聚糖溶液中羧甲基壳聚糖的质量比为5～8：40～45；

所述第一混合前还包括将羧甲基壳聚糖溶液进行过滤；所述过滤采用微孔滤膜；所述微孔滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖盐酸盐溶液的浓度为1.4～1.8mg/mL；

所述水果多酚与所述壳聚糖盐酸盐溶液中壳聚糖盐酸盐的质量比为5～8：45～50；

所述第二混合前还包括将壳聚糖盐酸盐溶液进行过滤；所述过滤采用微孔滤膜；所述微孔滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一混合的方式为搅拌；所述搅拌的时间为1～1.5h。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第二混合包括将所述第一混合液滴入所述壳聚糖盐酸盐溶液中后，搅拌；

所述搅拌的时间为20～30min。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述高压微射流均质处理包括：在压强为10000～15000psi条件下处理1次后，在压强为25000～30000psi条件下处理2～3次。

10.权利要求1～3任一项所述的水果多酚纳米粒或权利要求4～9任一项所述制备方法得到的水果多酚纳米粒在制备改善肠道菌群、细胞抗氧化和抑菌药物或食品中的应用。

Images