CN115916259A - 包含肿瘤选择性配体和能够释放一氧化碳(co)的基团的缀合物在癌症治疗中发挥免疫调节作用的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明在多个方面和实施方案中涉及CO释放分子用于在癌症治疗中发挥免疫调节作用的用途，所述CO释放分子诸如包含肿瘤选择性配体和能够释放一氧化碳(CO)的基团的缀合物，所述免疫调节作用诸如减少免疫检查点分子的表达和抑制性巨噬细胞的水平。这可以减少肿瘤组织中的免疫抑制，并且可以用于例如治疗免疫抑制性癌症或者与癌症免疫疗法组合治疗癌症。

Description

包含肿瘤选择性配体和能够释放一氧化碳(CO)的基团的缀合物在癌症治疗中发挥免疫调节作用的用途
技术领域
本发明涉及免疫抑制性癌症的治疗。
背景技术
癌症是全球死亡的主要原因之一，并且发病率随时间推移而系统性地增加[1]。癌症研究的进展扩大了我们对免疫系统在保护宿主免受肿瘤发展的影响方面所发挥的作用的理解。免疫系统不仅能够识别来源于外源生物体或组分的大量抗原，而且还能够靶向肿瘤细胞[2]。然而，癌细胞具有许多免疫逃避机制，它们通过这些机制破坏和逃避免疫细胞介导的识别和破坏。针对肿瘤免疫机制已经开发出新型治疗方法，所述方法在临床试验中产生了有希望的结果。免疫疗法是一种有前景的癌症治疗方法，所述方法利用免疫系统来特异性靶向肿瘤细胞[2-4]。然而，免疫疗法并非对所有癌症患者都有效，并且通常不会产生完全的或持久的临床反应[5、6]。所以，促进抗肿瘤免疫反应的新策略是所期望的。
一氧化碳(CO)是具有若干多效性效果的气体介质，已经观察到CO在一些癌症模型中具有有益的性质[7-10]。然而，并非一直都能观察到这些观察结果，在一些模型中，CO也与肿瘤生长或进展相关[65]。此外，CO的毒性性质意味着，它必须以精确和受控的方式以生物学上适当的剂量递送至靶组织。然而，由于绝大多数这些研究都集中于CO在癌细胞中的直接作用，因此CO在癌症免疫中的作用实际上是未知的。
必须严格控制外源性CO递送并且以非常低的剂量给予，因为高浓度CO的暴露是剧毒的。CO释放分子或CORM已经被开发用于更高治疗剂量的全身施用。CORM已经在不同的疾病模型中进行了测试[7-10]。CO对免疫系统和肿瘤生长的影响背后的分子机制尚不完全清楚。CORM没有组织或细胞选择性，并且可能会在循环中释放CO，并且与蛋白质或抗体运载体的缀合可以在特定组织中实现更可控的递送。例如，此前将光CORM与可商购获得的小鼠抗体缀合[11]。然而，它们潜在的抗癌作用仅直接在癌细胞中进行研究，而不是在与免疫细胞的共培养物中或在体内进行研究。
需要针对免疫抑制性癌症的新型、改善的和特异性的治疗，并且需要提供CO的有效递送以治疗肿瘤的组合物。
发明内容
本发明人出乎意料地发现，CO释放分子，诸如包含肿瘤选择性配体和能够释放一氧化碳(CO)的基团的缀合物，发挥了免疫调节作用，诸如减少免疫检查点分子的表达和抑制性巨噬细胞的水平。这可以减少肿瘤组织中的免疫抑制，并且可以用于例如治疗免疫抑制性癌症或者与癌症免疫疗法组合治疗癌症。
本发明的第一方面提供了一种治疗免疫抑制性癌症或减少肿瘤免疫抑制的方法，所述方法包括向有需要的个体施用包含连接至肿瘤选择性配体的一氧化碳(CO)释放基团的缀合物。
本发明的第二方面提供了一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用包含一氧化碳释放基团和肿瘤选择性配体的缀合物，以及施用癌症免疫疗法。
本发明的第三方面提供了一种包含共价连接至肿瘤选择性配体的一氧化碳释放基团的缀合物，所述缀合物用于治疗免疫抑制性癌症或减少肿瘤免疫抑制的方法或者治疗癌症的方法，例如第一方面或第二方面的方法。
本发明的第四方面提供了包含共价连接至肿瘤选择性配体的一氧化碳释放基团的缀合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗免疫抑制性癌症或减少肿瘤免疫抑制的方法或者与癌症免疫疗法组合治疗癌症的方法，例如第一方面或第二方面的方法。
所述一氧化碳释放基团可以是羰基金属络合物，例如单羰基金属络合物、二羰基金属络合物、三羰基金属络合物、四羰基金属络合物或五羰基金属络合物，诸如单羰基钌络合物、二羰基钌络合物、三羰基钌络合物、四羰基钌络合物或五羰基钌络合物。例如，所述一氧化碳释放基团可以是式M(CO)2的络合物，其中M是金属原子，诸如Ru、Mo或Fe。在一些实施方案中，M是Ru。
在第一方面至第四方面的一些实施方案中，所述肿瘤选择性配体是血清白蛋白，优选地人血清白蛋白。
在第一方面至第四方面的一些实施方案中，所述缀合物可以具有式配体-[金属(CO)n1]n2，其中n1在1和5之间，并且n2在1和30之间。
例如，所述缀合物可以具有式HSA-[Ru(CO)2]n，其中HSA是人血清白蛋白，并且n在1和16之间。
在第一方面至第四方面的一些实施方案中，所述缀合物是包封所述一氧化碳释放基团的纳米颗粒或微粒，其中所述肿瘤选择性配体缀合至所述纳米颗粒的表面。
在第一方面至第四方面的一些实施方案中，所述缀合物可以与癌症免疫疗法组合施用于所述个体，所述癌症免疫疗法诸如免疫检查点抑制剂，诸如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，所述缀合物可以与细胞疗法组合施用于所述个体，所述细胞疗法诸如过继性T细胞疗法或CAR-T疗法。在另外其他实施方案中，所述缀合物与细胞毒性化学疗法组合施用于所述个体。
下文将更详细地描述本发明的其他方面和实施方案。
附图说明
图1a和1b显示了缀合策略的示意图(a)，以及(b)天然rHSA(Recombumin)和rHSA-CORM(Recombumin-Ru(CO)2)的质谱图。
图2a和2b显示了骨髓源性巨噬细胞(BMDM)和结肠直肠癌细胞(CT26)中的CO释放。(a)在BMDM细胞中添加COP-1后0、30和60分钟的COP-1的显微图像和平均荧光强度(MFI)。(b)与(a)相同，但是在CT26细胞中。细胞此前在30分钟内用1μM rHSA-CORM或rHSA-DMSO培养。垂直虚线表示将COP-1添加至细胞中的时间。
图3显示了静脉内注射rHSA-CORM后30分钟小鼠体内的CO生物分布和循环中的碳氧血红蛋白(CO-Hb)水平。
图4(a-d)显示，在CT26和MC38肿瘤中，CO延长存活率并且抑制肿瘤生长。(a)实验的示意图。(b)rHSA-CORM治疗(rHSA-CORM，n＝8)或对照治疗(rHSA-DMSO，n＝8)后CT26(结肠癌)肿瘤的肿瘤生长和存活率曲线。(c)第13天的肿瘤和腹股沟淋巴结(iLN)。(d)用rHSA-CORM或对照治疗后具有MC38细胞的结肠癌模型中的肿瘤重量。使用Prism 8进行统计学分析。对于统计检验，除非另外说明，否则小于0.05的P值被认为是显著的。如果具有显著性(95％置信区间)，则通过单因素方差分析(one-wayANOVA)来分析肿瘤生长结果。使用对数秩Mantel-Cox检验(95％置信区间)对荷瘤小鼠的存活率进行比较。
图5显示，CO既不会影响免疫缺陷小鼠(不具有适当的且功能正常的免疫系统)的肿瘤生长，也不会影响这些小鼠的存活率。图中显示了每日rHSA-CORM治疗后NSG小鼠的CT26肿瘤体积和总体存活率(rHSA-CORM，n＝6；rHSA-DMSO，n＝6)。
图6(a、b)显示，CO治疗的小鼠表现出肿瘤浸润性T细胞中的免疫检查点标志物CTLA-4和PD-1的表达减少(a)，以及表达TNF-α和IFNγ的细胞的丰度增加(b)。CORM，n＝4；rHSA-DMSO，n＝4。
图7a显示，CO影响肿瘤中不同细胞因子和趋化因子的产生。IL-20的产生似乎通过CO治疗而完全消除。在rHSA-CORM治疗后肿瘤中的细胞因子(左)和趋化因子(右)的蛋白质定量(rHSA-CORM，n＝3；rHSA-DMSO，n＝3)。图7b显示了荷瘤BALB/c小鼠中CD4和CD8耗竭后的肿瘤大小。图7c显示了使用组合疗法在αPD-1、αCTLA-4和rHSA-CORM(n＝8)中的存活率。图7d是在来自c的存活小鼠中CT26再攻击(rechallenge)(原初，n＝8；ICB，n＝1；COMBO，n＝4)的示意图和肿瘤生长曲线。
图8显示，CO治疗减少了肿瘤中的单核细胞和TAM的丰度(rHSA-CORM，n＝4；rHSA-DMSO，n＝4)。
图9(a-e)显示，巨噬细胞的耗竭模拟了CO治疗在CT26肿瘤中的效果。(rHSA-CORM，n＝4；rHSA-DMSO，n＝4；rHSA-CORM+氯膦酸盐脂质体，n＝4；rHSA-DMSO+氯膦酸盐脂质体，n＝4)。图中提供了示意图(9a)、肿瘤体积(9b)、流式细胞术图(显示巨噬细胞耗竭)(9c)、以及DC和TAM水平(9d)，(9e)显示了巨噬细胞中的Ki-67表达和IL-20的产生。
图10(a-h)显示，rHSA-CORM治疗影响骨髓源性巨噬细胞活力和极化。(a)实验的示意图。(b)在单核细胞至巨噬细胞分化的第2天和第6天BMDM的FACS图(rHSA-CORM，n＝3；rHSA-DMSO，n＝3)。(c)巨噬细胞分化后的绝对细胞数(第6天)。(d)从(b)获得的单核细胞(Mono)、过渡单核细胞
Figure BDA0003961542250000051
和巨噬细胞
Figure BDA0003961542250000052
的相对丰度。(e)在分化的第2天和第6天巨噬细胞的Ki-67染色。(f)在分化的第2天和第6天巨噬细胞中的膜联蛋白V和活力染色。(g)在rHSA-CORM或rHSA-DMSO(CTRL)条件下极化后BMDM的细胞活力。(h)每个极化条件的FACS图及其各自的鉴定标志物。
图11(a、b)显示，细胞活力在单核细胞至巨噬细胞的转变期间受到影响，而在巨噬细胞分化后不受到影响，因为细胞仅在转变期间而不是在转变后在存在缀合物的情况下死亡。
图12(a-c)显示了rHSA-CORM和rHSA-DMSO治疗的小鼠的各种组织的毒理学结果。图12d显示，rHSA-CORM不刺激转移。
具体实施方式
本发明部分基于以下发现：CO释放缀合物通过下调CTLA-4和PD-1表达以及降低肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的水平来减少肿瘤中的免疫抑制。所以，肿瘤选择性CORM(诸如CORM缀合物)可以用于治疗癌症，包括免疫抑制性癌症，任选地与其他癌症免疫疗法联合使用。
如本文所述的CO释放缀合物包含与肿瘤选择性配体缀合的一氧化碳释放基团。
一氧化碳释放基团是在体内施用后能够释放一氧化碳(CO)的化学部分。
在一些实施方案中，一氧化碳释放基团可以包含例如通过共价键或其他键配位或化学连接至另一个原子(诸如金属原子)的一个或多个CO基团。在施用后，CO基团与另一个原子的键联被破坏，并且CO基团被释放。例如，当将包含一氧化碳释放基团的缀合物放置于水溶液中时，CO可以自发地释放。如本文所述，缀合物的CO释放增加了个体的肿瘤部位处的CO水平，并且发挥了免疫调节作用。
合适的CO释放基团包括金属羰基络合物，其中一个或多个CO部分与金属原子配位。合适的金属羰基络合物包括单羰基金属络合物、二羰基金属络合物、三羰基金属络合物、四羰基金属络合物或五羰基金属络合物。例如式M(CO)n1的络合物，其中M是金属原子，并且n1是1、2、3、4或5，优选地2或3。
合适的金属可以包括铁、钼、钴、铼和钌。
在一些实施方案中，金属是钌。例如，CO释放基团可以是式RuII(CO)2的钌二羰基基团。
示例性CO释放基团和分子在美国专利7,964,220、美国专利9,023,402、美国专利9,062,089和美国专利9,163,044中有公开，这些专利据此以引用的方式整体并入。
在其他优选的实施方案中，CO释放基团包含钼金属原子，例如，如US 9,163,044中所述。在这些实施方案中，CO释放基团包含三个可从Mo金属原子释放的CO部分。
在本文所述的CO释放缀合物中，肿瘤选择性配体直接或间接缀合至CO释放基团或包含CO释放基团的颗粒。肿瘤选择性配体是当体内施用时在肿瘤中选择性地积聚或导致一种或多种CO释放基团积聚的分子，即在施用于患有癌症的个体后，肿瘤组织中的肿瘤选择性配体的浓度大于个体的非肿瘤组织中的浓度。
在一些实施方案中，缀合物具有式配体-[金属(CO)n1]n2，其中n1在1和5之间，并且n2在1和30之间。
肿瘤选择性配体允许CO释放缀合物在个体的肿瘤组织中选择性地靶向或积聚。肿瘤选择性配体在循环中是稳定的。此外，缀合物的肿瘤选择性配体选择性地积聚在肿瘤组织中，即它在肿瘤组织中显示出相对于非肿瘤组织而言浓度增加。肿瘤组织中肿瘤选择性配体的积聚允许CORM在肿瘤组织中相对于非肿瘤组织(即其中肿瘤选择性配体不积聚的非癌性组织)而言选择性地发挥作用，例如在肿瘤组织中释放CO并且发挥免疫调节作用，例如抗免疫抑制作用。因此，CO释放靶向肿瘤组织，并且不会显著改变CO-Hb的基础水平。
肿瘤选择性配体使CO释放基团靶向肿瘤。相对于未缀合的CO释放分子而言，缀合至肿瘤选择性配体的CO释放基团可以显示出在个体的肿瘤组织中的积聚增加，即相对于未缀合的CO释放分子而言，缀合至肿瘤选择性配体的CO释放基团在肿瘤组织中的浓度可以增加。这允许由肿瘤组织中的CO释放缀合物来选择性释放CO，以使得所释放的CO在肿瘤组织中积聚。
合适的肿瘤选择性配体包括纳米颗粒、肽、蛋白质、聚合物(生物聚合物，诸如多糖或合成聚合物(诸如聚乙二醇))、适体或小分子。
在一些优选的实施方案中，肿瘤选择性配体是优选地血浆蛋白，优选地人血浆蛋白。血浆蛋白是存在于血清中的蛋白质。合适的血浆蛋白可以包括抗体、白蛋白、球蛋白(诸如γ球蛋白和α-2巨球蛋白)、纤维蛋白原、脂蛋白、转铁蛋白、调节因子(诸如激素和凝血因子(诸如凝血酶原))。其他肿瘤选择性配体包括提供大流体动力学半径以增加复合物的循环半衰期并且避免肾过滤的氨基酸序列，诸如弹性蛋白样肽(ELP)(参见美国专利8,334,257，该专利据此以引用的方式并入)和非结构化的聚合物(诸如US 7,855,279中描述的那些，该专利据此以引用的方式整体并入)。
优选地，肿瘤选择性配体可以是血清白蛋白。血清白蛋白(ALB；Gene ID:213)是人体血液中最丰富的蛋白质。血清白蛋白调节血浆的胶体渗透压，并且作为血清中的多种内源性分子的运载体蛋白。由于新生儿Fc受体(FCRN)的外渗和靶向和/或由于增强的渗透性和保留(EPR)效应，血清白蛋白在肿瘤组织中积聚。此前已经表明，在24小时后，20％注射剂量的放射性标记的白蛋白衍生物在大鼠皮下肿瘤中积聚[64]。因此，在一些实施方案中，肿瘤选择性配体是人血清白蛋白。人血清白蛋白可以具有NCBI数据库条目NP_000468.1或SEQID NO:1的参考氨基酸序列，或者可以是这些氨基酸序列中的任一者的变体，并且可以被NM_000477.7的参考核苷酸序列或其变体编码。人血清白蛋白可以具有对肿瘤微环境的趋向性，并且可以增加药物的血清半衰期[12]。
在一些实施方案中，白蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO:1定义的参考白蛋白序列具有至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。在多个实施方案中，白蛋白氨基酸序列结合至新生儿Fc受体(FcRn)，例如人FcRn。白蛋白氨基酸序列可以是野生型HSA(例如，如SEQ ID NO:1所示)的变体。在多个实施方案中，变体可以具有相对于SEQ ID NO:1的一至二十个、或一至十个氨基酸缺失、取代或插入。在一些实施方案中，白蛋白氨基酸序列是任何哺乳动物白蛋白氨基酸序列。
在一些实施方案中，白蛋白氨基酸序列或结构域是全长白蛋白的片段，如SEQ IDNO:1所示。术语“片段”在用于白蛋白的上下文中时，是指全长白蛋白或其变体的任何片段，相对于相应的未缀合的CO释放基团或络合物而言，所述片段延长了与其缀合的CO释放基团或包含CO释放基团的络合物的半衰期。增强白蛋白序列作为运载体的能力的白蛋白序列的各种修饰是已知的，并且这些修饰可以用于本发明。白蛋白氨基酸序列的示例性修饰在US8,748,380、US10,233,228和US 10,501,524中有所描述，这些专利各自据此以引用的方式整体并入。
参考白蛋白序列的变体可以与参考氨基酸序列共有至少50％序列同一性、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少约80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。例如，本文所述蛋白质的变体可以包含与参考氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列，与参考氨基酸序列具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少约80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
序列同一性通常参考算法GAP(Wisconsin GCG软件包,Accelerys Inc,San DiegoUSA)来定义。GAP使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法来比对两个完整的序列，该算法使匹配的数量最大化并且使空位的数量最小化。通常，使用默认参数，空位产生罚分＝12，空位延伸罚分＝4。GAP的使用可以是优选的，但是也可以使用其他算法，例如BLAST或BLAST2.0(使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:405-410的方法)、FASTA(使用Pearson和Lipman(1988)PNAS USA 85:2444-2448的相似性方法)或局部同源性史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法(Smith和Waterman(1981)J.MolBiol.147:195-197)或TBLASTN程序(Altschul等人(1990)出处同上，一般采用默认参数)。具体而言，可以使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res.(1997)253389-3402)。这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、PASTA和FASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)是可用的，并且可以使用可公开获得的计算机软件，诸如ClustalOmega(
Figure BDA0003961542250000101
J.2005,Bioinformatics 21,951-960)、T-coffee(Notredame等人2000,J.Mol.Biol.(2000)302,205-217)、Kalign(Lassmann和Sonnhammer 2005,BMC Bioinformatics,6(298))、GenomequestTM软件(Gene-IT,WorcesterMA USA)和MAFFT(Katoh和Standley 2013,Molecular Biology andEvolution,30(4)772–780)软件。当使用这种软件时，优选地使用默认参数，例如空位罚分和延伸罚分。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中有所描述。
序列比较优选地针对本文所述的相关序列的全长而进行。
可以使用标准重组技术来产生合适的肿瘤选择性配体蛋白，诸如人血清白蛋白。
在一些实施方案中，肿瘤选择性配体是抗体或其抗原结合部分。抗体分子是包含抗体抗原结合位点的多肽或蛋白质。该术语涵盖任何天然的或者部分或完全合成产生的免疫球蛋白。抗体分子可以通过纯化从天然来源分离或获得，或者通过遗传重组或通过化学合成获得，并且它们可以含有非天然氨基酸。
适合用作肿瘤选择性配体的抗体可以包括完全抗体以及它们的片段。完全抗体的片段可以发挥结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)单结构域抗体(sdAb)(也称为纳米抗体(Nb))(Ward等人(1989)Nature 341,544-546；McCafferty等人,(1990)Nature,348,552-554；Holt等人(2003)Trends inBiotechnology 21,484-490)，它由单体VH结构域或单体VL结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，这允许两个结构域缔合形成抗原结合位点(Bird等人(1988)Science,242,423-426；Huston等人(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)以及(ix)“双抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger等人(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448)。
Fv、scFv、双抗体、sdAb和其他抗体分子可以通过掺入例如连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定(Reiter等人(1996),Nature Biotech,14,1239-1245)。还可以制备包含连接至CH3结构域的scFv的微型抗体(Hu等人(1996),CancerRes.,56(13):3055-61)。结合片段的其他实例是Fab'，它与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸；以及Fab'-SH，它是其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离的硫醇基团的Fab'片段。
适合如本文所述使用的抗体可以特异性结合至肿瘤抗原。
其他靶标结合配体和抗体模拟物可以被用作肿瘤选择性配体，并且它们是本领域已知的。这些包括单结构域抗体、重组仅重链抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、鲨鱼仅重链抗体(VNAR)、微生物蛋白(例如，半胱氨酸结蛋白、结肽(knottin))、DARPin、四连接素(Tetranectin)、亲和抗体(Affibody)；跨膜抗体(Transbody)、Anticalin、AdNectin、Affilin、微体(Microbody)、phylomer、stradobody、大抗体(maxibody)、evibody、fynomer、犰狳重复蛋白(armadillo repeatprotein)、Kunitz结构域、高亲和性多聚体(avimer)、atrimer、probody、immunobody、triomab、特洛伊抗体(troybody)、pepbody、疫苗抗体(vaccibody)、UniBody和DuoBody。此类配体在以下参考文献中有所描述：美国专利号或专利公开号US 7,417,130、US 2004/132094、US 5,831,012、US 2004/023334、US 7,250,297、US 6,818,418、US 2004/209243、US 7,838,629、US 7,186,524、US 6,004,746、US 5,475,096、US 2004/146938、US 2004/157209、US 6,994,982、US 6,794,144、US 2010/239633、US7,803,907、US 2010/119446和/或US 7,166,697，这些专利的内容据此以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，肿瘤选择性配体可以缀合至纳米颗粒的表面。纳米颗粒可以进一步包封CO释放基团，或者在它们的表面上提供CO释放基团。在一些实施方案中，CO释放基团可以缀合至可生物降解的纳米材料。示例性纳米颗粒包括聚合物纳米颗粒，它可以包括与PEG的嵌段共聚物。例如，PEG链的末端可以具有缀合至肿瘤选择性配体和/或CO释放基团的官能团。示例性聚合物纳米颗粒形式包括在WO 2017/100597和US 2018/0339024中描述的那些，这两个专利据此以引用的方式整体并入。示例性纳米颗粒可以包括聚合物，诸如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(β-氨基酯)(PBAE)、聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(丙烯酸酸)(PAA)、聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)和聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)，包括它们的的组合，并且包括前述任一者与PEG的嵌段共聚物。在其他实施方案中，一种或多种一氧化碳释放基团缀合至无机材料，或者用无机材料包封。针对CORMS的纳米材料递送策略已有所描述[66]。
一种或多种抗原(即肿瘤抗原)的表达可以将癌细胞与个体中的正常体细胞区分开来。个体中的正常体细胞可以不表达所述一种或多种抗原或者可以以不同的方式表达它们，例如以较低的水平、在不同的组织中和/或在不同的发育阶段表达它们。所以，肿瘤抗原可以用于使嵌合肽交换蛋白特异性靶向于癌细胞。癌细胞表达的合适的肿瘤抗原可以包括，例如，由癌症种系基因编码的癌症-睾丸(CT)抗原，诸如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、GAGE-I、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-I、RAGE-1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1/CT7、MAGE-C2、NY-ESO-I、LAGE-I、SSX-I、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-I和XAGE以及它们的免疫原性片段(Simpson等人Nature Rev(2005)5,615-625；Gure等人,Clin Cancer Res(2005)11,8055-8062；Velazquez等人,Cancer Immun(2007)7,11；Andrade等人,Cancer Immun(2008)8,2；Tinguely等人,Cancer Science(2008)；Napoletano等人,Am J ofObstet Gyn(2008)198,99e91-97)。
在一些优选的实施方案中，适合如本文所述使用的抗体可以特异性结合至免疫检查点蛋白，诸如PD-1或CTLA4。
适合用作肿瘤选择性配体的小分子包括小化学分子，例如分子量为900道尔顿或更小的非聚合物有机化合物。在优选的实施方案中，适合用作肿瘤选择性配体的小分子可以具有900道尔顿或更小的分子量，并且选择性地积聚于肿瘤组织中。合适的小分子配体包括乙酰唑胺。乙酰唑胺选择性地结合至碳酸酐酶IX(CAIX)，所述碳酸酐酶IX优先地在肿瘤组织中表达。
在一些实施方案中，CO释放基团缀合至肿瘤选择性配体。缀合可以是共价的，即CO释放基团和肿瘤选择性配体可以通过共价键(例如配位共价键或配位键)直接连接。
任何合适的化学物质都可以用于缀合。
在一些实施方案中，存在于肿瘤选择性配体上的基团能够直接键合至CO释放基团，例如当肿瘤选择性配体是肽或蛋白质时，肿瘤选择性配体上的氨基酸残基能够直接键合至CO释放基团，以形成CO释放缀合物。在其他实施方案中，接头可以用于将CO释放基团缀合至肿瘤选择性配体，据此接头与CO释放基团和肿瘤选择性配体二者形成共价键，以形成CO释放缀合物。
在一些实施方案中，可以通过使CO释放分子(CORM)与肿瘤选择性配体反应来将CO释放基团缀合至肿瘤选择性配体。CORM可以包含CO释放基团，例如金属羰基络合物。CO释放分子(CORM)的金属原子可以与肿瘤选择性配体反应，从而使CORM的CO释放基团缀合至配体。例如，金属原子可以与肿瘤选择性配体的氨基酸残基(诸如肿瘤选择性配体蛋白中的组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸或甲硫氨酸残基)形成共价键。
在一些实施方案中，可以采用金属化反应。肿瘤选择性配体可以被CO释放分子(CORM)的金属原子金属化，从而使CORM的CO释放基团缀合至配体。金属化反应可以在金属原子和肿瘤选择性配体上的组氨酸残基之间进行。例如，金属原子可以与组氨酸残基的咪唑基团形成共价键，从而使CO释放基团缀合至配体。
金属原子可以是过渡金属。在一些实施方案中，金属化反应在包含CORM的钌羰基络合物(诸如Ru(CO)2络合物)的钌原子和存在于肿瘤选择性配体蛋白上的组氨酸之间进行。合适的CORM包括CORM-3。例如，包含CORM的钌羰基络合物的钌原子可以与人血清白蛋白中的一个或多个组氨酸残基共价键合。优选地，金属化反应在[RuCl(κ2-H2NCH2CO2)(CO)3]络合物(即CORM-3)和存在于人血清白蛋白上的组氨酸之间进行。
在其他实施方案中，使用接头来使CO释放基团缀合至肿瘤选择性配体。
例如，CO释放分子可以包含作为金属羰基络合物的CO释放基团，并且接头可以包含第一反应性部分和第二反应性部分，所述第一反应性部分适用于使金属羰基络合物配位，所述第二反应性部分适用于与肿瘤选择性配体形成共价键。在一些实施方案中，接头是PEG接头。
第一反应性部分可以例如是金属配体，诸如单齿金属配体、双齿金属配体、三齿金属配体或四齿金属配体。
在一些实施方案中，第二反应性部分可以是例如硫醇反应性部分，所述硫醇反应性部分适用于与肿瘤选择性配体上的硫醇基团进行缀合(即硫醇缀合)。硫醇反应性部分可以是适合与硫醇基团形成共价键的任何基团，此类基团包括卤代乙酰基基团、马来酰亚胺、氮丙啶、羰基丙烯酸基团、卤代哒嗪二酮、乙烯基砜、二硫化物和硫醇。在这些实施方案中的一些中，肿瘤选择性配体是蛋白质，并且硫醇基团是氨基酸残基，诸如半胱氨酸。
在其他实施方案中，第二反应性部分可以是点击反应性部分，所述点击反应性部分适合于与肿瘤选择性配体上的点击柄进行点击反应。点击反应性部分可以是适合于与肿瘤选择性配体上的对应的点击柄进行点击反应的任何基团。合适的点击反应组合包括铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)；应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)；应变促进的炔烃-硝酮环加成(SPANC)；烯烃和叠氮化物[3+2]环加成；以及烯烃四嗪逆需求狄尔斯-阿尔德(diels-alder)反应。在这些实施方案中的一些中，肿瘤选择性配体是蛋白质，在这些实施方案中，合适的点击柄包括叠氮化物和炔烃，包括应变和直链炔烃。可以通过诱变，例如通过引入包含点击柄的非天然氨基酸残基来将这种合适的点击柄引入肿瘤选择性配体蛋白。含有示例性点击柄的氨基酸包括叠氮基丙氨酸、叠氮基苯丙氨酸、炔丙基甘氨酸、炔丙基丙氨酸、丙炔基脯氨酸。或者，含有点击柄的基团可以缀合至肿瘤选择性配体蛋白上的氨基酸。
在一些实施方案中，接头首先与CORM配位，然后配位的CORM缀合至肿瘤选择性配体，例如通过硫醇缀合或通过点击反应。在其他实施方案中，接头首先缀合至肿瘤选择性配体，例如通过硫醇缀合或通过点击反应，然后CORM通过接头-肿瘤选择性配体缀合物进行配位。
在一些实施方案中，CO释放缀合物可以包含多个CO释放基团。例如，CO释放缀合物可以包含2至约20个CO释放基团，诸如约5至约20、或约10至约20、或约2至约10、或约2至约5个CO释放基团。CO释放缀合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个CO释放基团。
CO释放基团可以缀合至相同的肿瘤选择性配体。例如，两个或更多个CO释放基团可以缀合至肿瘤选择性配体。
在一些实施方案中，CO释放缀合物可以包含人血清白蛋白以及缀合至其一个或多个组氨酸残基的CO释放基团。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或更多个CO释放基团可以例如通过配位共价键缀合至人血清白蛋白的组氨酸残基。在一些实施方案中，8至约16个CO释放基团缀合至人血清白蛋白。
如本文所述的CO释放缀合物可以通过任何方便的方法产生。合适的方法在本领域中是可用的(参见例如[11])。例如，CO释放缀合物可以通过使人血清白蛋白与二氧化碳释放分子(CORM)反应来产生。CORM的实例包括过渡金属CORM、光CORM、酶触发(ET)-CORM和有机CORM。过渡金属CORM是主要基于铁、钼、钌、钴和铼的过渡金属络合物。Ru(甘氨酸)Cl(CO)3(CORM3)是过渡金属CORM的实例。
例如，CO释放缀合物可以通过使人血清白蛋白与CORM反应来产生。在优选的实施方案中，CO释放缀合物可以通过使人血清白蛋白与Ru(甘氨酸)Cl(CO)3(CORM3)反应来产生，以使得人血清白蛋白的一个或多个组氨酸残基被钌二羰基基团金属化。
合适的反应条件是本领域熟知的，并且包括在生理pH(例如，pH7.4)的PBS中在室温下用约50当量的CORM-3处理人血清白蛋白约1小时。
虽然将如本文所述的CO释放缀合物单独施用于个体是可能的，但是在药物组合物或制剂中提供化合物是优选的。除了如本文所述的CO释放缀合物之外，药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域的技术人员熟知的其他材料。这种材料应该是无毒的并且不应干扰活性化合物的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是推注、输注、注射或任何其他合适的途径，如下文所讨论。合适的材料将是无菌的和无热原的，具有合适的等渗性和稳定性。实例包括无菌盐水(例如0.9％NaCl)、水、葡萄糖、甘油、乙醇等等或它们的组合。组合物还可以含有辅助物质，诸如润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂等等。
合适的载体、赋形剂等可存在于标准药物读本中，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990。
如本文所使用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理医学判断范围内适用于与受试者(例如人)的组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比是相称。每种载体、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须为“可接受的”。
制剂可方便地以单位剂型存在并且可通过药学领域中熟知的任何方法来制备。所述方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，通过使活性化合物与液体载体或细碎固体载体或两者均匀并紧密地缔合，然后根据需要将产物成形来制备制剂。
制剂可呈以下形式：液体、溶液、混悬液、乳液、酏剂、糖浆、片剂、锭剂、颗粒、粉末、胶囊、扁囊剂、丸剂、安瓿、栓剂、阴道栓、软膏、凝胶、糊剂、霜剂、喷雾剂、烟雾剂、泡沫、洗剂、油剂、大丸剂、干药糖剂或气雾剂。
如本文所述的CO释放缀合物或包含CO释放缀合物的药物组合物可以通过任何方便的施用途径施用于受试者，无论是全身/外周还是在所期望的作用部位施用，包括肠胃外施用，例如通过注射施用，包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、瘤内、心内、鞘内、脊髓内、囊内、囊下、眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内施用；通过储库移植施用，例如皮下或肌肉内施用。施用优选地是静脉内或在所期望的作用部位施用(例如，瘤内注射)。对于很多适应症(诸如结肠直肠癌)而言，静脉内施用是优选的，但是对于一些适应症(诸如胶质母细胞瘤或膀胱癌)，在所期望的作用部位施用可以是优选的。
包含本文所述的化合物的药物组合物可以被配制为适合预期施用途径的剂量单位制剂。
适于肠胃外施用(例如通过注射，包括皮肤、皮下、肌肉内、静脉内和皮内)的制剂包括水性和非水性等渗、无热原、无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂，以及使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包括悬浮剂和增稠剂，以及脂质体或被设计来将化合物靶向血液组分或一个或多个器官的其他微粒系统。用于在所述制剂中使用的合适的等渗媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸化林格氏注射液。典型地，溶液中活性化合物的浓度为约1ng/mL至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如，安瓿和小瓶，并且可存储于冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在使用前即时添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和混悬液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。制剂可以是脂质体或其他微粒系统的形式，它们被设计为使活性化合物靶向巨噬细胞或脂肪组织。
任选地，其他治疗剂或预防剂可以被包括在药物组合物或制剂中。
如本文所述的CO释放缀合物可以用于减少肿瘤组织中的免疫抑制，例如通过减少肿瘤组织中的免疫检查点蛋白的表达和/或肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的量。例如，CO释放缀合物可以用于治疗免疫抑制性癌症和/或增强癌症免疫疗法。
癌症的特征在于恶性癌细胞的异常增殖。免疫抑制性癌症是其中个体的免疫系统在肿瘤组织中，即在肿瘤及其微环境(例如血液和淋巴管、胞外基质、宿主细胞，诸如成纤维细胞、神经内分泌(NE)细胞、脂肪细胞和免疫炎性细胞和围绕肿瘤的分泌因子)内受到抑制的癌症。这种免疫抑制会减少或防止宿主对癌细胞的免疫反应。
免疫抑制性癌症的特征可以在于抑制、减少或防止肿瘤中的针对癌细胞的免疫反应的肿瘤。例如，肿瘤的微环境可以是免疫抑制性和T细胞抑制性蛋白，以及/或者抑制免疫反应的T细胞抑制性细胞可以存在于肿瘤微环境中。
在一些实施方案中，肿瘤对免疫反应的抑制可以是由于T细胞的抑制，即肿瘤和/或其微环境中的T细胞可以显示出降低的活性。
T细胞的抑制可以由一种或多种免疫检查点蛋白(诸如PD-1和CTLA-4)介导。免疫检查点蛋白是免疫系统的调节剂，对自身耐受性至关重要，可防止免疫系统无差别地攻击细胞。然而，恶性细胞的免疫检查点蛋白的表达使抗肿瘤免疫失调，并且促进癌细胞的生长和扩增[13]。
与非癌细胞相比，免疫抑制性癌症的特征可以在于免疫检查点蛋白的表达或者免疫检查点蛋白的表达或活性水平的增加。检查点蛋白的表达水平或活性可以通过本领域已知的常见方法(诸如质谱、流式细胞术、qPCR和RNA测序)来确定。
免疫检查点蛋白可以包括PD-1。程序性细胞死亡蛋白1(Gene ID5133；也称为PD-1或CD279(分化簇279))是T细胞表面上存在的T细胞抑制性蛋白。PD-1通过使免疫系统下调来发挥调节免疫系统的反应的作用，并且通过抑制T细胞活性来促进自身耐受性。然而，这可以阻止免疫系统杀死癌细胞。PD-1可以具有NCBI数据库条目NP_005009.2的参考氨基酸序列，并且可以由NCBI数据库条目NM_005018.3的参考核苷酸序列编码。
T细胞上的PD-1与其在免疫抑制性肿瘤的癌细胞(以及树突细胞和巨噬细胞)上的配体PD-L1或PD-L2的相互作用可以抑制T细胞的活性并且允许癌细胞逃避宿主免疫反应。使用如本文所述的CO释放缀合物减少T细胞上的PD-1表达可以减少或抑制PD-1/PD-L1和/或PD-1/PD-L2相互作用，从而防止或减少癌细胞逃逸宿主免疫系统。
如果需要，可以通过任何方便的方法进行PD-1定量，例如使用ARIOL系统[61]、通过流式细胞术或通过蛋白质印迹对每个分离的T细胞或肿瘤细胞进行的每个像素的平均荧光强度的免疫荧光检测。
免疫检查点蛋白可以包括CTLA-4。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Gene ID No:1493；也称为CTLA4、CTLA-4或CD152(分化簇152))是作为免疫检查点以及使免疫反应下调的T细胞抑制性蛋白。CTLA-4在调节T细胞中组成型表达，并且在活化后在常规T细胞中上调。癌症(例如，免疫抑制性癌症)中的CTLA-4的上调可以阻止免疫系统杀死癌细胞。CTLA-4可以具有NCBI数据库条目NP_005205.2的参考氨基酸序列，并且可以由NCBI数据库条目NM_005214.5的参考核苷酸序列编码。
T细胞上的CTLA-4与其在癌细胞上的配体CD80和CD86的相互作用可以导致T细胞活性的抑制并且导致癌细胞逃避宿主免疫反应。使用如本文所述的CO释放缀合物减少T细胞上的CTLA-4表达可以减少或防止CTLA-4/配体相互作用，从而防止或减少癌细胞对T细胞的抑制和对宿主免疫系统的逃逸。
如果需要，可以通过任何方便的方法进行CTLA-4定量，例如使用ARIOL系统[61]、通过流式细胞术或通过蛋白质印迹对每个分离的T细胞或肿瘤细胞进行的每个像素的平均荧光强度的免疫荧光检测。
在其他实施方案中，与非癌细胞相比，免疫抑制性癌症的特征可以在于T细胞抑制性细胞(诸如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和/或TAM祖细胞或者数量增加的TAM和/或TAM祖细胞)的存在。
T细胞抑制性细胞(诸如调节T细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)及其祖细胞)在肿瘤微环境中的存在可以导致或有助于T细胞抑制和免疫抑制。例如，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)填充肿瘤微环境并且通常显示出M2巨噬细胞样表型。TAM抑制抗肿瘤免疫反应，并且促进肿瘤发展，涉及多种功能，诸如Treg细胞的持续积聚以及由于趋化因子和氨基酸降解酶(诸如精氨酸酶1和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO))的表达而引起的脉管系统失调[13]。TAM在个体肿瘤微环境中的积聚与对癌症疗法的抗性和较差的临床预后相关。
TAM在个体肿瘤微环境中的积聚可以导致T细胞活性的抑制以及针对肿瘤的免疫反应的抑制。使用如本文所述的CO释放缀合物减少肿瘤微环境中的TAMS的量可以防止或减少T细胞的抑制和癌细胞对宿主免疫系统的逃逸。
免疫抑制性癌症可以是任何癌症类型，包括实体癌，诸如肉瘤、癌和淋巴瘤，包括皮肤癌、黑素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌和骨癌。
免疫抑制性癌症可以包括以下中的任何一者或多者：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑肿瘤、乳腺癌、女性生殖系统癌、男性生殖系统癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童肉瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、结肠和直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜肉瘤、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、下咽癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、白血球过多症、肝癌、肺癌、恶性纤维组织细胞瘤、恶性胸腺瘤、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经系统癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、呼吸系统、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、胃部癌症、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿系统癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管系统、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)巨球蛋白血症和维尔姆斯(Wilms)瘤。
癌症可以属于特定类型。癌症的类型的实例包括星形细胞瘤、癌(例如腺癌、肝细胞癌、髓样癌、乳头状癌、鳞状细胞癌)、胶质瘤、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤)。
在一些实施方案中，癌症是原发性肿瘤，或者是转移性癌症。“转移”是指癌症从其原始位点扩散至身体的其他地方。癌细胞可脱离原发性肿瘤，渗透到淋巴管和血管中，循环通过血流，并且在身体其他部位的正常组织的远距离病灶(转移)处生长。转移可以是局部或远距离的。在多个实施方案中，原发性或转移性癌症是黑素瘤、肺癌、肾癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、泌尿道上皮癌、胃癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌和前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)。在一些实施方案中，癌症是进行性、局部晚期或转移性癌。在一些实施方案中，癌症是转移性黑素瘤，并且可以是复发性的。在一些实施方案中，转移性黑素瘤是III期或IV期的。转移可以是局部的或远处的。
在一些实施方案中，免疫抑制性癌症可以是已获准用免疫检查点抑制剂治疗的癌症类型，例如已获准用CTLA-4抑制剂和/或PD-1抑制剂治疗的癌症类型(参见例如[20]至[60])。在一些优选的实施方案中，免疫抑制性癌症可以包括黑素瘤、鳞状细胞癌、结肠直肠癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、肾癌和泌尿道上皮癌。
相对于其他癌症而言，免疫抑制性肿瘤的特征可以在于肿瘤突变负荷(TMB)增加([52-55])和/或肿瘤浸润性淋巴细胞数量增加([56、57])。
可以使用标准诊断标准来鉴定个体中的免疫抑制性癌症。此类临床标准的实例可见于医学教科书中，诸如Harrison’s Principles of Internal Medicine,第15版,FauciAS等人编,McGraw-Hill,New York,2001。
如本文在治疗病症的上下文中所用，术语“治疗”通常涉及其中实现一些期望的治疗效果的治疗和疗法，所述期望的治疗效果例如，抑制病症的进展，并且包括降低进展速率、停止进展速率和改善病症以及治愈病症。在多个实施方案中，治疗可导致总体存活率增加、无进展生存期增加，或导致稳定疾病或肿瘤消退，或导致定名为无癌症。
个体可以此前已经被鉴定为患有免疫抑制性癌症或具有患上免疫抑制性癌症的风险。在其他实施方案中，方法可以包括在施用前将患者鉴定为患有免疫抑制性癌症或具有患上免疫抑制性癌症的风险。
适合如上文所述的治疗的个体可以是哺乳动物，诸如啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、灵长类动物、猿猴(例如猴或猿)、猴(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、红毛猩猩、长臂猿)或人。在一些优选的实施方案中，个体是人。在其他优选的实施方案中，可以采用非人哺乳动物，尤其是通常用作展示对人的治疗功效的模型的哺乳动物(例如鼠科动物、灵长类动物、猪、犬科动物或兔科动物)。
治疗可以是任何治疗和疗法，无论是对人还是动物(例如在兽医应用中)，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制或延迟病症的进展，并且包括降低进展速率、停止进展速率、改善病症、治愈或缓解(无论是部分还是全部)病症、预防、延迟、减轻或阻止病症的一种或多种症状和/或征象，或者延长受试者或患者的存活期超出在未进行治疗的情况下的预期存活期。
还包括作为预防性措施的治疗(即预防)。例如，对免疫抑制性癌症的发生或再次发生敏感或者具有免疫抑制性癌症的发生或再次发生的风险的个体可以如本文所述进行治疗。这种治疗可以预防或延缓个体癌症的发生或再次发生。具体而言，治疗可以包括抑制癌症生长，包括癌症完全缓解，和/或抑制癌症转移。癌症生长通常是指指示癌症内部变化为更为进展形式的多种指标中的任一种。因此，用于测量癌症生长抑制的指标包括癌细胞存活率的降低、肿瘤体积或形态的减少(例如，如使用计算机断层扫描(CT)、超声检查或其他成像方法所确定)、肿瘤生长的延迟、肿瘤脉管系统的破坏、延迟过敏性皮肤测试的性能改善、癌细胞的细胞裂解活性的增加、肿瘤特异性抗原水平的降低。
在一些实施方案中，适合如本文所述的治疗的个体在初始癌症治疗后可以具有微小残留病(MRD)。
如本文所述的CO释放缀合物可以如本文所述以治疗有效量施用。如本文使用的术语“治疗有效量”涉及有效产生与合理的受益/风险比相称的一些所需治疗效果的活性化合物，或包含活性化合物的组合、材料、组合物或剂型的量。
如本文所述的CO释放缀合物的适当剂量可以因个体而异。确定最佳剂量通常涉及治疗有益水平与施用的任何风险或有害副作用的平衡。选定剂量水平将取决于多个因素，包括但不限于施用途径、施用时间、组合使用的活性化合物、其他药物、化合物和/或材料的排泄率以及个体的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史。活性化合物的量和施用途径最终将由医生判断，但是通常剂量将实现活性化合物的治疗血浆浓度，而不会导致基本上有害的或不利的副作用。
通常，活性化合物的合适剂量在每天每千克受试者体重约100μg至约400mg的范围内，优选地每天每千克受试者体重200μg至约200mg。当活性化合物为盐、酯、前药等时，施用量基于母体化合物来计算，因此待使用的实际重量成比例增加。
体内施用可以一次剂量、连续或间歇地(例如以适当的时间间隔，以分剂量)实现。
确定最有效施用方式和剂量的方法为本领域所熟知并且将随着用于疗法的制剂、疗法目的、所治疗的靶细胞和所治疗的受试者而变化。单次或多次施用可根据由医师选择的剂量水平和模式来执行。
可以施用多剂量的包含如本文所述的CO释放缀合物的化合物，例如可以施用2、3、4、5或多于5个剂量。包含如本文所述的CO释放缀合物的化合物的施用可以持续一段时间期。例如，使用包含如本文所述的CO释放缀合物的化合物进行治疗可以持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月或至少2个月、或至少3个月。可以持续使用包含如本文所述的CO释放缀合物的化合物进行治疗以达到减少免疫抑制所需的时间。在一些实施方案中，CO释放缀合物每周施用一次或两次，或者每月施用一次或两次(例如，持续二至十二个月，或二至八个月)。在一些实施方案中，CO释放缀合物是静脉内施用的。
包含如本文所述的CO释放缀合物的化合物可以单独施用或与其他治疗组合施用，根据个体情况同时或按顺序施用。例如，包含如本文所述的CO释放缀合物的化合物如本文所述可以与一种或多种另外的活性化合物组合施用。
包含如本文所述的CO释放缀合物的化合物可以与一种或多种其他癌症疗法(诸如免疫疗法(例如检查点抑制剂疗法、T细胞共刺激剂疗法或细胞因子疗法)、细胞疗法、细胞毒性化学疗法或放射疗法)组合施用。
例如，CORM-缀合物可以与细胞因子疗法、T细胞共刺激剂疗法或免疫检查点抑制剂组合施用。细胞因子疗法活化癌症患者的免疫系统。干扰素α(IFNα)已被批准用于完全切除的高风险黑素瘤患者和若干难治性恶性肿瘤的辅助治疗。高剂量白介素-2(IL-2)已被批准用于转移性肾细胞癌和黑素瘤的治疗。免疫检查点抑制剂是抑制免疫检查点蛋白(诸如CTLA-4和PD-1)的配体结合或活性的分子或化合物。合适的免疫检查点抑制剂包括抗CTLA-4抗体，诸如伊匹单抗(ipilimumab)(BMS)和曲美木单抗(tremelimumab)(AZ)；抗PD-1抗体，诸如纳武单抗(nivolumab)(BMS)和帕博利珠单抗(pembrolizumab)(Merck)；和抗PD-L1抗体，诸如德瓦鲁单抗(durvalumab)(AZ)、阿特珠单抗(atezolizumab)(Genentech/Roche)和阿维鲁单抗(avelumab)(Merck Kga/Pfizer)。例如，T细胞共刺激疗法可以包括针对CD28或OX40激动剂的激动剂。
当治疗剂与另外的治疗剂组合使用时，化合物可以通过任何方便的途径按顺序或同时施用。当治疗剂与对相同的疾病有活性的另外的治疗剂组合使用时，组合中的每种剂的剂量可以不同于治疗剂单独使用时的剂量。本领域的技术人员将容易理解适当的剂量。
如本文所述，治疗剂的施用可以在整个治疗过程中以一个剂量、连续地或间歇地(例如，以适当的时间间隔，以分剂量)实现。确定最有效施用方式和剂量的方法为本领域技术人员熟知并且将随着用于疗法的制剂、治疗目的、所治疗的靶细胞和所治疗的受试者而变化。单次或多次施用可根据由治疗医师选择的剂量水平和模式来执行。
在多个实施方案中，缀合物作为与癌症免疫疗法一起的方案施用。在多个实施方案中，缀合物在癌症免疫疗法方案之前、期间和/或之后施用于患者。例如，癌症免疫疗法可以是阻断免疫检查点分子的抗体或其抗原结合部分，例如选自以下的分子：B7-H3、B7-H4、BTLA、CD160、CTLA4、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、LAG3和TIGIT。在一些实施方案中，癌症免疫疗法包括免疫共刺激分子的激动剂，例如选自以下的分子：4-1BB、CD27、CD28、CD40、CD137、GITR、ICOS、OX40、TMIGD2和TNFRSF25。在一些实施方案中，癌症免疫疗法是TLR9激动剂。在实施方案中，激动剂是抗体或其抗原结合部分(包括双特异性抗体)或小分子。示例性剂包括伊匹单抗、帕博利珠单抗、曲美木单抗、纳武单抗和匹地利珠单抗(pidilizumab)。
在一些实施方案中，癌症免疫疗法是过继性细胞疗法，它可以包括T细胞过继性细胞疗法，包括表达嵌合抗原受体(CAR)的重组T细胞，所述嵌合抗原受体识别和结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，CAR-T靶向CD19。
在其他实施方案中，免疫疗法包括骨髓移植或造血干细胞的施用。
在多个实施方案中，缀合物与抗PD1、抗PDL1和/或抗CTLA4抗体的方案联合施用于癌症患者。
在多个实施方案中，治疗方案包括在开始免疫疗法方案(例如，免疫检查点抑制剂疗法或过继性细胞疗法)之前施用缀合物一至四周，以使患者适应癌症免疫疗法。在另外其他实施方案中，治疗方案包括在癌症免疫疗法方案完成之后施用缀合物一周或多周或数月，以改善疗效和/或效果的持续时间。在一些实施方案中，缀合物和免疫疗法在包括伴随疗法的方案中施用。
在多个实施方案中，患者此前对检查点抑制剂疗法(诸如抗CTLA-4、抗PD-1或抗PD-L1和/或抗PD-L2剂)无反应，仅有部分反应，或对检查点抑制剂疗法产生抗性。例如，患者可以已经接受这些免疫检查点抑制剂疗法或本文所述的其他免疫疗法的先前方案，但是对所述疗法无反应或仅有部分反应。这些难治性患者可以受益于CO释放基团缀合物，所述缀合物任选地与如本文所述的另一种免疫疗法联合。
本发明的其他方面和实施方案提供：上文所述的方面和实施方案所用的术语“包含”被术语“由……组成”替代，并且上文所述的方面和实施方案所用的术语“包含”被术语“基本上由……组成”替代。
应当理解，除非上下文另外要求，否则本申请公开了上文所述的上述方面和实施方案中的任一者彼此的所有组合。类似地，除非上下文另外要求，否则本申请公开了优选的和/或任选的特征的所有组合，所述特征是单独的或与其他方面中的任一个组合。
在阅读本公开后，上述实施方案的修改、另外的实施方案以及它们的修改对于技术人员将是显而易见的，因此，这些都在本发明的范围内。
本说明书中提及的所有文档和序列数据库条目均以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
当在本文使用时，“和/或”应当视为具有或不具有另一者的两种特定特征或组分的每一者的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为对(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每者的具体公开，就像每者在本文中单独列出一样。
如本文所用，除非上下文另外要求，否则术语“约”意指相关数字的±10％。
实验
气体介质是具有多种生理作用，并且能够向免疫细胞传递指导性信号的小分子。在这项实验研究中，我们展示了，人工白蛋白金属蛋白(rHSA-CORM)能够将大量CO特异性地递送至肿瘤，在该处抑制肿瘤的进展。在原位，CO减少免疫检查点分子的表达以及促进免疫逃逸的肿瘤相关巨噬细胞的数量，从而释放抗肿瘤免疫反应的产生。值得注意的是，rHSA-CORM和免疫检查点阻断(ICB)协同作用以消除肿瘤，从而引起免疫记忆。这些结果突出显示了CORM及其蛋白质缀合物作为癌症治疗中的治疗方案的潜力。
免疫疗法是利用免疫系统来特异性靶向肿瘤细胞的治疗策略，通过成为各种类型癌症的护理标准，已经彻底改变了癌症患者的前景。然而，虽然在过去几十年中取得了巨大成就，但是免疫疗法并非对所有患者都有效，因为癌细胞的免疫识别和破坏能力超过了免疫疗法[5]。因此，需要促进抗肿瘤免疫反应的新策略。CO是低分子量气体，具有从免疫调节到细胞保护的生物学功能。它天然存在于环境中，与某些蛋白质中存在的过渡金属选择性发生反应，从而转换其生理活性。此前对CO生物学的研究主要集中于其在体外的直接影响。CO在癌症免疫中的作用实际上是未知的。由于暴露于高浓度的CO是剧毒的，因此去老化系统(诸如CO释放分子(CORM))可以安全地提供更高的治疗剂量。然而，CORM没有组织或细胞选择性，因此需要能够在特定组织中更可控地递送的运载体。在本文中，我们描述了将CORM(例如，CORM-3)的抗肿瘤潜力与重组人血清白蛋白(rHSA)的肿瘤靶向能力[14]结合到单一剂中的治疗策略。使用体内癌症模型，我们观察到，rHSA-CORM治疗可有效抑制肿瘤生长并且以免疫依赖性方式延长小鼠的总体存活率，这显示了其作为抗癌免疫治疗剂的前景。重要的是，CO处理的小鼠表现出免疫检查点标志物CTLA-4和PD-1的表达降低，以及促进免疫抑制的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的频率降低。与ICB的组合疗法使肿瘤完全消退和免疫记忆成为可能。值得注意的是，这些结果表明，通过施用CORM来加强目前实施的疗法的功效，可以逆转癌症中的免疫逃逸。
材料和方法
缀合和纯化
将重组人血清白蛋白(rHSA)与50当量的CORM-3(Sigma)在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在室温下反应1小时，产生对应于rHSA的成功金属化的单峰，如通过液相色谱质谱(LC-MS)所检测。
动物研究和肿瘤的细胞分离
在第0天，将5×105个CT26细胞(结肠癌)通过50μl Dulbecco改良的Eagle培养基与基质胶(Matrigel)(Corning)的1:1混合物皮下注射到BALB/c(或NSG)小鼠的腹部。在C57BL/c小鼠中施用相同的方案，不同的是使用1×106个MC38(结肠腺癌)细胞作为代替。在肿瘤体积达到约100mm3时，每日通过在50μl PBS中瘤内(i.t.)注射(30mg kg-1)来施用rHSA-CORM和rHSA-DMSO一次。当肿瘤体积达到1cm3时对小鼠实施安乐死。
在异位肿瘤诱导后，将BALB/c小鼠每日用CO缀合物治疗直到进行分析。在第13天，将肿瘤切除、切碎并使用胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶IV(Worthington)和DNA酶I(Roche)的混合物在振荡器中以250r.p.m.在37℃下消化20分钟。在消化后，使样品通过100-μm细胞滤网，并重悬于补充有10mM HEPES缓冲液、1mM丙酮酸钠、50μM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的冷的完全RPMI 1640培养基中，并补充1％非必需氨基酸(NEAA)、1％GlutaMAX补充剂和10％热灭活FBS(HI FBS)。将细胞重悬于具有2％FBS和1mM EDTA的PBS中，并在室温下针对CD45-APC染色15分钟，然后在室温下用MojoSortTM小鼠抗APC纳米珠粒(BioLegend)染色15分钟。将染色和样品维持在室温下以防止中性粒细胞破坏。使用磁力架进行3个循环的正向选择，并且对细胞进行染色，以评估用于流式细胞分析的不同标志物。
CO水平测定
使用Vreman及其同事描述的方法[18]来测定组织和血液中的CO水平。在骨髓源性巨噬细胞(BMDM)和结肠直肠癌细胞(CT26)中评估CO释放。在静脉内注射3mg kg-1单独的rHSA-CORM-3或rHSA后30分钟，评估小鼠体内的CO生物分布和循环中的碳氧血红蛋白(CO-Hb)水平。
CT26细胞和BMDM中的CO释放的实时成像
按照此前描述的方法使用共聚焦显微镜检测COP-1作为CO释放的读数[9]。简而言之，使用具有40X水物镜和1.3的数值孔径的Zeiss LSM 880共聚焦激光点扫描显微镜获得图像。使用488nm氩激光来激发COP-1，并在500-550nm的波长范围内检测荧光。在实验前两天，将1.5×104个CT26细胞或BMDM接种于200uL的8室#1.0硼硅酸盐盖玻片(Lab-Tek)板中。将细胞与1.5μM rHSA-CORM或rHSA-DMSO一起温育30分钟，并在采集前用PBS洗涤3次。在显微镜下添加1μM COP-1前后采集对照图像。在添加探针后最多60分钟内每5分钟采集一次图像。图像采集在Z堆栈中进行，以确保细胞沿Z轴完全成像。采集在37℃和5％CO2下进行。
肿瘤大小和存活率分析
每天使用数字卡尺测量，并使用以下公式计算肿瘤大小：体积＝长×宽×宽×0.5。在接种后监测小鼠并计算存活率。如果具有显著性(95％置信区间)，则通过单因素方差分析来分析肿瘤生长结果。使用对数秩Mantel-Cox检验(95％置信区间)对荷瘤小鼠的存活率进行比较。
质谱法
使用Micro Bio-Spin 6柱(Bio-Rad)将20μL BSA和BSA-RuII(C O)2样品用缓冲液交换为200mM乙酸铵缓冲液(pH 7)。在高质量Q-TOF型仪器Xevo G2-S(Waters,Manchester,UK)上获取质谱图。质谱实验在1500V的毛细管电压、200V的锥电压和150V的源偏移电压下进行。使用MassLynx V4.1(Waters)来处理光谱。
细胞培养
使CT26细胞(ATCC)通常在37℃和5％CO2的加湿培养箱中生长，在达到汇合前每周使用TrypLE Express裂解两次。使CT26细胞在补充有10％热灭活FBS、1％Glutamax、1％丙酮酸钠、10mM HEPES、10mM NEAA、200个单位/毫升青霉素和200μg/mL链霉素的DMEM培养基上生长。除非另外说明，否则所有试剂均购自Gibco,Life Technologies(USA)。
免疫反应的评估
从Charles River引进的8至14周龄BALB/c小鼠的肿瘤收获总细胞。将切除的肿瘤切碎并使用胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶IV(Worthington)和DNA酶I(Roche)的混合物在振荡器中以250r.p.m.在37℃下消化20分钟。在消化后，使样品通过100-μm细胞滤网，并重悬于补充有10mM HEPES缓冲液、1mM丙酮酸钠、50μM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，并且补充有1％非必需氨基酸(NEAA)、1％GlutaMAX补充剂和10％热灭活FBS(HI FBS)的冷的完全RPMI 1640培养基中。将细胞重悬于具有2％FBS和1mM EDTA的PBS中，并在4℃下针对细胞外标志物染色45分钟。然后使用来自ThermoFisher Scientific的eBioscienceFoxp3转录因子染色缓冲液组对细胞悬浮液进行固定、透化并针对细胞内标志物进行染色。在配备有BD FACSDiva软件的BD LSRFortessa流式细胞仪中分析样品，并在FlowJo v.10软件中分析数据。用于结肠癌实验的抗体(BioLegend)是：CD45-BV510(30-F11)、CD3-BV711(17A2)、CD49b-FITC(DX5)、CD4-BV605(RM4-5)、CD8-PECy7(53-6.7)、CD152-PECy7(CTLA-4、UC10-4B9)、CD279-PE(PD-1、29F.1A12)、TNFα-PE(MP6-XT22)、IFNγ-PerCP/Cy5.5(XMG1.2)、I-A/I-E-PE(MHC-II、M5/114.15.2)、F4/80-PECy7(BM8)、Ly6G-BV605(1A8)、Ly6C-FITC(HK1.4)、CD11c-BV711(N418)、TER119-APC、CD19-APC(6D5)、Ki-67-BV605(16A8)、CD274-BV421(B7-H1、PD-L1、10F.9G2)、CD206-PerCP/Cy5.5(C068C2)。所用的抗体(eBioscience)是：iNOS-PE(CXNFT)和ICAM-1-FITC(YN1/1.7.4)。使用可固定活力染料(Fixable ViabilityDye)eFluor 780(eBioscience)来排除死细胞。根据兽医总理事会(
Figure BDA0003961542250000331
Geral de Veterinária)和若昂·洛波·安图内斯分子医学研究所(Institutode MedicinaMolecular
Figure BDA0003961542250000332
Lobo Antunes)伦理委员会批准的方案饲养动物。
巨噬细胞耗竭分析
根据前述CT26肿瘤体内诱导方案，从CT26细胞皮下注射后第9天开始，通过每日静脉内注射600μg/kg抗CCR2抗体(MC-21)来进行巨噬细胞耗竭，并且通过每周两次静脉内注射氯膦酸盐脂质体来进行巨噬细胞耗竭。在第16天处死小鼠，分离细胞并通过流式细胞术进行评估。如上文所述进行流式细胞分析。
骨髓源性巨噬细胞(BMDM)培养系统
从8周龄C57BL/c小鼠的股骨分离BM细胞，并将BM细胞放置于含有800μL RPMI1640培养基(每孔)的6孔板中，所述培养基补充有10％热灭活FBS(HI FBS)、10mM HEPES缓冲液、1mM丙酮酸钠、20U/ml青霉素和20μg/ml链霉素，并且补充有1％GlutaMAX。我们向每个孔中进一步添加200μL产生M-CSF的L929成纤维细胞的上清液。将细胞维持在37℃和5％CO2的加湿培养箱中6天以进行准全巨噬细胞分化。在接种后24小时添加rHSA-CORM或rHSA-DMSO缀合物，并且在第3天与每孔250μL L929上清液一起重新添加。在第6天，将细胞与2mMEDTA一起在PBS中温育大约10分钟，并且细胞通过刮擦机械除去并且重新接种于12孔板中。通过在以下条件下培养BMDM 24小时来实现巨噬细胞极化：M0：20％L929(或10ng/mL M-CSF)；M1：10ng/mL LPS+10ng/mL IFNγ；M2a：10ng/mL IL-4+10ng/mL IL-13；M2c：10ng/mLIL-10+0.5ng/mL TGF-β。如上文所述从板上收获细胞，并在BD Fortessa仪器中通过流式细胞术分析细胞。
结果
质谱法
图1a和1b分别提供了缀合策略的示意图以及天然rHSA(Reco mbumin)和rHSA-CORM(Recombumin-Ru(CO)2)的质谱图。
CO释放和分布
为了确定CO是否从CT26细胞中的缀合物中有效释放，我们使用名称为COP-1的CO敏感染料通过实时成像来筛选CO水平。[67]正如预期的那样，CO能够随时间推移在肿瘤细胞中积聚(图2b)。此外，由于CO对血红蛋白的亲和力高于氧，并且可以防止组织氧合，我们估算了碳氧血红蛋白(CO-Hb)的血液含量，以评估小鼠的潜在CO中毒。我们未观察到静脉内施用rHSA-CORM后CO-Hb种类形成的任何增加，也未检测到在组织中的任何给定的毒性迹象(图3，左；图12a-c)。CO生物分布如图3所示。另外，我们观察到在治疗后腹股沟淋巴结(iLN)邻近的肿瘤有一些肿胀，这可能意味着该部位的免疫细胞募集增加(图4c)。不同组织中的组织学评分也排除了iLN肿胀根部发生转移的可能性，因为在rHSA-CORM治疗的小鼠的器官中未检测到肿瘤细胞(图12d)。BMDM中的CO释放也如图2a所示。
肿瘤大小和存活率
结果表明，CO治疗可有效抑制肿瘤生长和延长小鼠的总体存活率。图4a显示了实验的示意图。图4b清晰地表明，与rHSA-DMSO治疗相比，由于rHSA-CORM治疗显著改善了存活率(p＝0.0034)。图4b还显示，与rHSA-DMSO治疗相比，rHSA-CORM减缓了CT26肿瘤的生长，这在图4c中得到进一步展示，其中在第13天rHSA-CORM治疗的肿瘤明显小于rHSA-DMSO治疗的肿瘤。肿瘤重量在图4d以图表显示。图4c还显示，与rHSA-DMSO治疗相比，rHSA-CORM治疗后第13天的腹股沟淋巴结(iLN)较大。这可以表明，rHSA-CORM治疗的小鼠对肿瘤细胞产生了更强的免疫反应。
在MC38细胞用于C57BL/c小鼠的另一个小鼠结肠癌模型中，rHSA-CORM同样有效。
为了评估CO介导的效应是否实际上依赖于免疫系统，我们在免疫缺陷小鼠(NSG)中诱导了相同的肿瘤。由于我们既不能观察到治疗组之间的任何差异，也不能观察到CT26细胞中的直接细胞毒性(图5)，因此我们得出以下结论：CO介导的抗肿瘤作用是免疫依赖性的。如图5所示，在免疫缺陷NSG小鼠中，rHSA-CORM和rHSA-DMSO治疗在肿瘤大小、存活率或细胞活力方面无显著差异。这表明，CORM-缀合物治疗最适用于免疫抑制性癌症。
炎症反应和免疫反应的分析
图6a、6b表明，CO治疗的小鼠表现出在肿瘤浸润性T细胞中免疫检查点标志物CTLA-4和PD-1的表达减少(图6a)，并且还显示，CO治疗增加了表达TNF-α和IFNγ的细胞的丰度(图6b)。这表明，CO治疗可能对以T细胞反应减少为特征的免疫抑制性癌症有效，因为CTLA-4和PD-1二者均抑制T细胞作用。
图7a显示，CO影响肿瘤中不同细胞因子和趋化因子的产生。值得注意的是，CO治疗显示出IL-20水平显著降低。(A)在rHSA-CORM治疗后肿瘤中的细胞因子(左)和趋化因子(右)的蛋白质定量(rHSA-CORM，n＝3；rHSA-DMSO，n＝3)。
如图6a、6b所示，我们观察到，虽然肿瘤浸润性淋巴细胞丰度无差异，但是CTLA-4和PD-1(抑制和耗竭的标志物)的表达在T细胞中减少，而在治疗后观察到产生肿瘤抑制性TNF-α和IFNγ的CD8和NK细胞增加。这种结果揭示了CO如何能够减少防止免疫反应过强的表达检查点蛋白。为了确定这些效应所依赖的T细胞亚群类型，我们使用耗竭抗体消除了体内的CD4和CD8 T细胞。我们观察到，虽然CD4 T细胞对于CO治疗是多余的，但是CD8 T细胞的耗竭逆转了rHSA-CORM的作用，这表明CO介导的效应是CD8依赖性的(图7b)。此外，由于CO轻微影响ICM的表达，我们假设ICB可以与rHSA-CORM治疗协同作用，进一步增强抗肿瘤反应。实际上，与接受单独的ICB的小鼠相比，接受组合治疗(COMBO)的小鼠的肿瘤消退更多，因此改善了存活计数(图7c)。在小鼠完全清除肿瘤后，我们用相同的肿瘤细胞在相对侧腹对它们进行再攻击。引人注目的是，此前用ICB和rHSA-CORM治疗的小鼠均未出现肿瘤(图7d)。
巨噬细胞对CO的反应
我们评估了骨髓区室中的CO介导的效应，尤其是肿瘤相关巨噬细胞和单核细胞。MHC-II+细胞(诸如巨噬细胞)具有将抗原呈递给T细胞的作用。然而，在肿瘤的背景下，TAM倾向于抑制T细胞而不是活化它们，这使得这些巨噬细胞在癌症治疗中有害[2]。TAM抑制T细胞抗肿瘤免疫并促进肿瘤发展。
如图8所示，CO治疗减少了肿瘤中的单核细胞和TAM的丰度(rHSA-CORM，n＝4；rHSA-DMSO，n＝4)。有趣的是，我们还观察到，CO治疗增加了中性粒细胞的丰度，这可能表明免疫性能得以改善(图8)。此外，图9a-d显示，巨噬细胞的耗竭模拟了CT26肿瘤中的CO治疗效果。(rHSA-CORM，n＝4；rHSA-DMSO，n＝4；rHSA-CORM+氯膦酸盐脂质体，n＝4；rHSA-DMSO+氯膦酸盐脂质体，n＝4)。这些巨噬细胞的增殖性较低，表现为Ki-67表达减少(图9e)，并且使用氯膦酸盐脂质体的耗竭模拟了类似CO的阻碍肿瘤生长的物质(图9b)。这提供了另外的证据，所述证据表明，CO治疗有利于治疗以T细胞反应减少为特征的免疫抑制性癌症。
我们还观察到，在CO治疗后肿瘤中的IL-20产生完全消除(图7a和9e)。IL-20是来自IL-10家族的促炎细胞因子，与癌症进展相关，其中单核细胞和巨噬细胞是其主要产生者。所以，CO介导的抗癌作用可以依赖于巨噬细胞耗竭。
按照这个想法，我们试图确定CO是否参与巨噬细胞稳态。为了确定绝对细胞数减少的原因是否是由于巨噬细胞增殖或细胞凋亡的影响，分别对细胞进行针对Ki-67和膜联蛋白V的标记。与此前在体内所观察的相反，在巨噬细胞增殖中未观察到差异(图10e)。另外，用rHSA-CORM观察到细胞凋亡减少，如膜联蛋白V和活力染料的同时染色所观察(图10f)，这与CO介导的细胞数量减少不一致。所以，在该浓度下，CO可能会影响分化前的祖细胞而不是巨噬细胞的活力。
我们在体外将巨噬细胞与骨髓(骨髓源性巨噬细胞，“BMDM”)区分开来，并且将它们与rHSA-CORM或rHSA-DMSO一起温育(图10a)。当在添加rHSA-CORM之前允许单核细胞沉降并开始分化时，虽然总细胞数存在差异，但是在单核细胞至巨噬细胞分化方面未发生差异(图10b-d)。因此，我们推断，CO可能会影响分化前的祖细胞的活力，而不是在如此低的浓度(1μM)下影响巨噬细胞的活力。
分化的BMDM的细胞毒性测定表明，巨噬细胞具有比单核细胞更高的抗性阈值，其显示出GI50为80μM。相比之下，如果化合物与BM细胞同时添加，则使用低至5或10μM的浓度会导致培养物中的细胞几乎完全死亡(图11a)。因此，CO似乎不会削弱巨噬细胞分化，而是减弱BM祖细胞的活力，从而导致巨噬细胞数量减少。此外，CO通过减少M1、M2a和M2c谱系标志物的表达来影响巨噬细胞极化(图10h)。然而，这些效应可能继发于极化，并且是由于巨噬细胞的活力降低。
总体而言，这些结果表明，CO可有效减弱肿瘤生长并且以免疫依赖性方式延长小鼠的总体存活率，这显示出其作为免疫抑制性癌症治疗的前景。目前可用的免疫治疗策略并不总是对癌症有效，即使在治疗开始时也可以发生复发。CO本身就是新型多功能抗癌药物，它不仅可以重现免疫检查点抑制剂的效果，还可以耗竭促进肿瘤的免疫抑制环境的细胞。因此，CO可以作为常规治疗的优越治疗替代物。
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序列
SEQ ID NO:1(人血清白蛋白)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
序列表
<110> 乔奥洛博安图内斯分子医学研究所(Instituto de Medicina Molecular JoãoLobo Antunes)
里斯本大学医学院(Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa)
<120> 包含肿瘤选择性配体和能够释放一氧化碳(CO)的基团的缀合物在癌症治疗中发挥免疫调节作用的用途
<130> P222694CN1-P
<150> GB 2004514.2
<151> 2020-03-27
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1               5                   10                  15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
            20                  25                  30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
        35                  40                  45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
    50                  55                  60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65                  70                  75                  80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
                85                  90                  95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
            100                 105                 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
        115                 120                 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
    130                 135                 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
                165                 170                 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
            180                 185                 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
        195                 200                 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
    210                 215                 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
                245                 250                 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
            260                 265                 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
        275                 280                 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
    290                 295                 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
                325                 330                 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
            340                 345                 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
        355                 360                 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
    370                 375                 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
                405                 410                 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
            420                 425                 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
        435                 440                 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
    450                 455                 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465                 470                 475                 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
                485                 490                 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
            500                 505                 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
        515                 520                 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
    530                 535                 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545                 550                 555                 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
                565                 570                 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
            580                 585

Claims (55)

1.一种减少肿瘤免疫抑制的方法，所述方法包括：
向有需要的个体施用包含一个或多个一氧化碳释放基团和肿瘤选择性配体的缀合物，以及任选地施用癌症免疫疗法。
2.如权利要求1所述的方法，其包括施用癌症免疫疗法。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是免疫抑制性癌症。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述免疫抑制性癌症的特征在于免疫检查点蛋白介导的T细胞功能抑制。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是CTLA-4。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述免疫抑制性癌症的特征在于T细胞抑制性细胞存在于所述个体的肿瘤组织中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述T细胞抑制性细胞是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述一氧化碳释放基团是金属羰基基团。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述金属羰基基团是单羰基金属基团、二羰基金属基团、三羰基金属基团、四羰基金属基团或五羰基金属基团。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述一氧化碳释放基团包含金属原子，所述金属原子选自钌、钼、钴、铼和铁。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述金属原子是钌或钼。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述缀合物具有式配体-[金属(CO)n1]n2，其中n1在1和5之间，并且n2在1和30之间。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述一氧化碳释放基团是钌羰基基团。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述缀合物具有式配体-[Ru(CO)2]n，其中n在1和16之间。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一氧化碳释放基团是RuII(CO)2。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述缀合物包含两个或更多个一氧化碳释放基团。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述缀合物是包封所述一氧化碳释放基团的纳米颗粒，其中所述肿瘤选择性配体缀合至所述纳米颗粒的表面。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述纳米颗粒包含聚合物或无机核或壳。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述纳米颗粒包含含有PEG的嵌段共聚物。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述纳米颗粒包含PEG嵌段共聚物，其中肿瘤选择性配体缀合至所述PEG末端。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选择性配体是生物聚合物、合成聚合物、肽、适体或小分子。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述肿瘤选择性配体是蛋白质。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤选择性配体是血浆蛋白。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述肿瘤选择性配体是抗体、白蛋白、球蛋白、脂蛋白或转铁蛋白。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤选择性配体是血清白蛋白或其片段。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述血浆蛋白是人血清白蛋白。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤选择性配体包括抗体或其抗原结合部分。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合肿瘤抗原。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-1或CTLA4。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述一氧化碳释放基团通过配位共价键连接至所述蛋白质中的组氨酸残基。
32.根据权利要求23至31中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过使所述蛋白质与CO释放分子反应来产生，所述CO释放分子包含一个或多个金属羰基基团，以使得所述蛋白质的一个或多个组氨酸残基被所述金属羰基基团金属化。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述缀合物通过使所述蛋白质与CORM-3反应来产生，以使得所述蛋白质的一个或多个组氨酸残基被钌二羰基基团金属化。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体癌，诸如肉瘤、癌或淋巴瘤。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症是皮肤癌、黑素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌和骨癌。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中所述癌症是原发性肿瘤。
37.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述缀合物每周施用一次或两次或者每月施用一次或两次。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述缀合物施用至少四周。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述CO释放缀合物是静脉内施用的。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中缀合物与癌症免疫疗法组合施用于所述个体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症免疫疗法选自免疫检查点抑制剂疗法、细胞因子疗法、免疫共刺激疗法和过继性细胞疗法。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述癌症免疫疗法是免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是伊匹单抗、曲美木单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、德瓦鲁单抗、阿特珠单抗和阿维鲁单抗。
45.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述癌症免疫疗法是免疫共刺激疗法，所述免疫共刺激疗法任选地是CD28激动剂或OX40激动剂。
46.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述癌症免疫疗法是过继性细胞疗法。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症免疫疗法是T细胞过继性细胞疗法。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述癌症免疫疗法是嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述治疗方案包括在开始免疫疗法方案之前施用所述缀合物一至四周。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述治疗方案包括在所述癌症免疫疗法方案完成之后施用所述缀合物一周或多周或数月。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述缀合物和免疫疗法在包括伴随疗法的方案中施用。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述患者此前对免疫疗法无反应、仅有部分反应、或已经对免疫疗法产生抗性，所述免疫疗法任选地是检查点抑制剂疗法。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述患者是CTLA-4或PD-1阻断疗法难治的。
54.一种缀合物，其包含一个或多个一氧化碳释放基团和肿瘤选择性配体，用于根据权利要求1至53中任一项所述的治疗免疫抑制性癌症的方法、治疗癌症的方法或治疗减少肿瘤免疫抑制的方法。
55.包含连接至肿瘤选择性配体的一个或多个一氧化碳释放基团的缀合物用于制造药物的用途，所述药物用于根据权利要求1至53中任一项所述的治疗免疫抑制性癌症的方法、治疗癌症的方法或治疗减少肿瘤免疫抑制的方法。
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