CN115902241A - 波形蛋白在制备广州管圆线虫病治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了波形蛋白在制备广州管圆线虫病治疗药物中的应用。本发明通过构建广州管圆线虫病小鼠感染模型，发现小鼠感染后期脑组织波形蛋白水平及其磷酸化水平显著升高，血脑屏障通透性显著增加。利用Vimentin‑knockout小鼠模型敲除波形蛋白后，通过磁共振成像、伊文思蓝实验发现感染小鼠血脑屏障破坏程度得到有效缓解，血脑屏障破坏相关分子AQP4表达显著降低，紧密连接蛋白occludin表达显著升高。本发明研究结果表明波形蛋白是参与广州管圆线虫病血脑屏障破坏的关键调控因子，下调波形蛋白可起到治疗广州管圆线虫病的作用，波形蛋白可作为广州管圆线虫病的治疗靶点，用于制备或筛选广州管圆线虫病治疗药物。

Description

波形蛋白在制备广州管圆线虫病治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及波形蛋白在制备广州管圆线虫病治疗药物中的应用。

背景技术

广州管圆线虫病(Angiostrongyliasis cantonensis)是一种严重侵害中枢神经系统的人兽共患传染病，由于人类摄入未煮熟的淡水螺和陆生蜗牛等软体动物或受污染的蔬菜，幼虫穿破身体的血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)进入中枢神经系统而引起的。广州管圆线虫病是东南亚、太平洋岛屿、加勒比海以及南美洲地区嗜酸性脑膜炎最常见的病因，被视为世界重大公共卫生问题之一。广州管圆线虫感染适宜宿主和非适宜宿主会引发不同的病理损伤，适宜宿主的症状较为轻微，然而非适宜宿主往往会出现严重的脑膜炎症状，甚至死亡。人类是广州管圆线虫的非适宜宿主，幼虫感染非适宜宿主后，可以通过血液循环系统穿过血脑屏障到达中枢神经系统，在脑组织中生长发育，但虫体在非适宜宿主的脑部发育为V期幼虫后不能进一步移行至其他器官，从而引发严重的嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎。广州管圆线虫在感染后期会引起血脑屏障完整性的严重破坏，导致患者脑压升高，脑脊液显著增多，血脑屏障完整性的破坏是脑损伤进一步恶化的重要原因，因此深入研究广州管圆线虫破坏血脑屏障的具体机制，发掘调控血脑屏障破坏的关键调控因子迫在眉睫。

波形蛋白(Vimentin)属于细胞中间丝蛋白家族的成员，在人体内主要存在于间充质来源的细胞如内皮细胞、胶质细胞和某些未分化细胞如神经干细胞、神经祖细胞中，是构成细胞骨架的重要成分，在维持支持细胞形态、固定胞内亚细胞结构和细胞分化、生长调节等方面起着重要作用。最近也有报道称Vimentin参与了机体免疫反应。然而，关于Vimentin在广州管圆线虫病中的具体作用还未知。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供波形蛋白在制备广州管圆线虫病治疗药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种广州管圆线虫病治疗药物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明先构建广州管圆线虫病小鼠模型，通过伊文思蓝渗透性实验、血生化分析实验及增强型磁共振成像检测感染不同时间点小鼠与正常小鼠血脑屏障渗透性变化，发现感染小鼠血脑屏障渗透性显著升高，接下来通过透射电镜观察血脑屏障微结构组成成分变化，发现星形胶质细胞终足发生明显肿胀，RT-qPCR、Western blot检测发现水通道蛋白AQP4表达升高，脑组织含水量显著增加。进一步利用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光及流式细胞术发现在感染小鼠脑组织显著高表达。再通过构建Vimentin敲除小鼠，发现敲除Vimentin后，血脑屏障渗透性显著降低，AQP4表达降低，紧密连接蛋白occludin表达显著升高，脑组织含水量显著减少，提示Vimentin是治疗广州管圆线虫病的潜在药物靶点。通过下调Vimentin可抑制AQP4的表达，减少水渗透量，减轻血脑屏障渗透性，从而达到治疗广州管圆线虫病血脑屏障破坏的作用。因此本发明首先提供关于波形蛋白在以下方面的新应用：

波形蛋白作为治疗靶点在制备或筛选广州管圆线虫病治疗药物中的应用。

波形蛋白作为治疗靶点在制备或筛选预防和/或治疗广州管圆线虫病引起的血脑屏障破坏的药物中的应用。

抑制或下调波形蛋白表达的制剂在制备广州管圆线虫病治疗药物中的应用。

抑制或下调波形蛋白表达的制剂在预防和/或治疗广州管圆线虫病引起的血脑屏障破坏的药物中的应用。

所述抑制或下调波形蛋白表达的方式包括但不限于RNAi干扰技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术等，任何可实现患者体内波形蛋白抑制或下调的方式均应在本发明保护范围内。

优选地，所述制剂为含有波形蛋白RNA干扰载体的试剂或含有波形蛋白CRISPR/Cas9基因编辑载体的试剂。

本发明还提供一种治疗广州管圆线虫病的药物，所述药物包括抑制或下调波形蛋白表达的制剂。

优选地，所述制剂为含有波形蛋白RNA干扰载体的试剂或含有波形蛋白CRISPR/Cas9基因编辑载体的试剂。

优选地，还包括药学上可添加的辅料。

进一步优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了波形蛋白在制备广州管圆线虫病治疗药物中的新用途。本发明通过构建广州管圆线虫病小鼠感染模型，发现小鼠感染后期脑组织波形蛋白水平及其磷酸化水平显著升高，血脑屏障通透性显著增加。利用Vimentin-knockout小鼠模型敲除波形蛋白后，通过磁共振成像、伊文思蓝实验发现感染小鼠血脑屏障破坏程度得到有效缓解，血脑屏障相关分子AQP4表达显著降低，紧密连接蛋白occludin表达显著升高。本发明研究结果表明波形蛋白是参与广州管圆线虫病血脑屏障破坏的关键调控因子，下调波形蛋白可起到治疗广州管圆线虫病血脑屏障破坏的作用，波形蛋白可作为广州管圆线虫病的治疗靶点，用于制备或筛选广州管圆线虫病治疗药物。

附图说明

图1为广州管圆线虫感染小鼠不同时间点(0、3、7、14、21天)伊文思蓝实验结果。图A是脑大体观结果，图B是脑组织伊文思蓝定量结果，图C是脑组织冰冻切片荧光代表图，图D是荧光相对定量结果。

图2为广州管圆线虫感染小鼠不同时间点(0、3、7、14、21天)增强型磁共振结果。

图3为广州管圆线虫感染小鼠与空白对照组小鼠透射电镜结果。

图4为广州管圆线虫感染小鼠不同时间点(0、3、7、14、21天)脑组织含水量结果。

图5为广州管圆线虫感染小鼠不同时间点(0、3、7、14、21天)Vimentin在海马处mRNA水平和蛋白水平变化。图A是Vimentin在海马处mRNA水平，图B是Western blot条带代表图，图C是Western blot条带相对定量图。

图6为广州管圆线虫感染小鼠不同时间点(0、3、7、14、21天)Vimentin在皮质处mRNA水平和蛋白水平变化。图A是Vimentin在皮质处mRNA水平，图B是Western blot蛋白条带代表图，图C是Western blot蛋白条带相对定量图。

图7为广州管圆线虫感染小鼠不同时间点(0、3、7、14、21天)Vimentin表达情况的免疫荧光结果。图A是Vimentin在海马和皮质处免疫荧光代表图，图B是荧光相对定量结果。

图8为广州管圆线虫感染小鼠与空白对照组小鼠Vimentin表达情况的流式细胞术结果。

图9为Vimentin与星形胶质细胞标志物(GFAP)免疫荧光双标结果。

图10为Vimentin与神经元标志物(NeuN)免疫荧光双标结果。

图11为Vimentin与小胶质细胞标志物(Iba1)免疫荧光双标结果。

图12为广州管圆线虫感染小鼠与空白对照组的流式细胞术结果，检测的是Viemntin与GFAP、NeuN、Iba1双阳细胞比例。

图13为野生型小鼠空白对照组(WT-NC)、野生型小鼠感染组(WT-AC)、敲除小鼠空白对照组(KO-NC)、敲除小鼠感染组(KO-AC)伊文思蓝结果，A是脑大体观结果，B是脑组织冰冻切片荧光代表图，C是荧光相对定量结果。

图14为野生型小鼠空白对照组(WT-NC)、野生型小鼠感染组(WT-AC)、敲除小鼠空白对照组(KO-NC)、敲除小鼠感染组(KO-AC)增强型磁共振结果。

图15为野生型小鼠空白对照组(WT-NC)、野生型小鼠感染组(WT-AC)、敲除小鼠空白对照组(KO-NC)、敲除小鼠感染组(KO-AC)脑组织含水量结果。

图16为野生型小鼠空白对照组(WT-NC)、野生型小鼠感染组(WT-AC)、敲除小鼠空白对照组(KO-NC)、敲除小鼠感染组(KO-AC)AQP4和Occludin的mRNA水平和蛋白水平变化结果。图A是海马组织Western blot蛋白条带代表图，图B是皮质组织Western blot蛋白条带代表图，图C是海马组织Western blot蛋白条带相对定量图，图D是皮质组织Western blot蛋白条带相对定量。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

7-8周龄SPF级BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心，Vimentin敲除小鼠来自南方医科大学彭鸿娟教授捐赠，广州管圆线虫Ⅲ期幼虫来自于本实验室保种的光滑双脐螺。

实施例1广州管圆线虫感染后小鼠血脑屏障渗透性增加

广州管圆线虫病小鼠模型的具体构建方法如下：将含有Ⅲ期幼虫的光滑双脐螺压碎，剔除螺壳，夹取螺肉至离心管中并剪碎，加入消化液37°孵育1小时，用PBS终止消化，在解剖镜下数虫，每只小鼠感染30条Ⅲ期幼虫，通过灌胃感染。

成功构建广州管圆线虫病小鼠模型后，在感染第0、3、7、14、21天进行伊文思蓝渗透性实验、增强型磁共振成像实验。伊文思蓝实验操作步骤包括配制2％伊文思蓝溶液，对小鼠进行尾静脉注射，剂量为200μL/只鼠，循环2小时后，进行灌注取材并拍照，广州管圆线虫感染小鼠不同时间点(0、3、7、14、21天)伊文思蓝实验结果如图1所示。增强型磁共振成像实验操作流程是通过尾静脉注射造影剂GD-DTPA，剂量为287mg/kg，20分钟后利用磁共振成像仪进行扫描成像，广州管圆线虫感染小鼠不同时间点(0、3、7、14、21天)增强型磁共振结果如图2所示，以上结果显示感染小鼠的血脑屏障渗透性在第21天显著升高。

接下来利用透射电镜观察空白对照组和感染第21天血脑屏障微结构变化，结果如图3所示，发现感染小鼠的星形胶质细胞终足明显肿胀。

通过称重法检测感染不同时间点脑组织含水量变化，结果如图4所示，发现感染小鼠脑组织含水量显著增加，提示小鼠出现明显脑水肿病理表现。

实施例2广州管圆线虫感染后小鼠脑组织Vimentin表达升高

在小鼠感染第0、3、7、14、21天分离海马和皮质，利用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光及流式细胞术检测Vimentin表达情况。RT-qPCR实验步骤包括提取组织RNA，然后利用逆转录试剂盒进行逆转录成cDNA，接下来配制RT-qPCR体系，最后上机检测。Westernblot操作步骤包括提取组织蛋白质，利用BCA进行定量，然后制备蛋白变性样本进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行封闭、孵育一抗、洗涤、孵育二抗和化学发光仪显影。免疫荧光操作步骤包括烤片，脱蜡脱水，然后进行抗原修复、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育及荧光显微镜拍摄。流式细胞术操作步骤包括取新鲜组织，研磨后制成单细胞悬液，然后进行荧光抗体孵育，洗涤后进行流式细胞仪上机并分析。RT-qPCR、Western blot结果如图5和图6所示，免疫荧光及流式细胞术结果如图7和图8所示，发现Vimentin在海马和皮质表达均显著升高。

实施例3Vimentin主要表达在星形胶质细胞

在小鼠感染第0、3、7、14、21天，利用免疫荧光共定位及流式细胞术检测Vimentin主要表达细胞类型。免疫荧光共定位就是在免疫荧光的基础上，孵育来源不同的两个一抗，然后再孵育两个来源不同的二抗。图9显示Vimentin与GFAP存在共定位表达，图10显示Vimentin与NeuN没有共定位表达，图11显示Vimentin与IBA1没有共定位表达，图12显示流式细胞术检测发现Vim+GFAP+细胞数、Vim+IBA1+细胞数显著升高，Vim+NeuN+细胞数没有显著变化，以上结果表明Vimentin在星形胶质细胞中表达，在神经元和小胶质细胞及血管内皮细胞不表达。

实施例4敲除Vimentin抑制AQP4表达和升高occludin表达，降低血脑屏障渗透性

为了证明Vimentin在广州管圆线虫病小鼠模型中的作用，利用Vimentin敲除小鼠模型，然后用广州管圆线虫感染敲除小鼠，另设有野生型小鼠空白对照组、野生型小鼠感染组和敲除小鼠空白对照组，通过伊文思蓝实验、增强型磁共振成像实验。伊文思蓝结果如图13所示，增强型磁共振结果如图14所示，发现敲除Vimentin后可以显著缓解血脑屏障渗透性的升高，减轻血脑屏障破坏程度。

通过称重法检测各组小鼠脑组织含水量的变化，结果如图15所示，发现敲除Vimentin可以降低脑含水量，缓解小鼠脑水肿情况。

接下来，利用Western blot检测AQP4和occludin表达情况变化，结果如图16所示，无论是在海马还是皮质，相比于WT-NC组，WT-AC组AQP4表达显著上升，occludin表达显著降低，KO-AC组与WT-AC组相比，AQP4表达显著降低，occludin表达显著升高，表明敲除Vimentin后可以显著降低AQP4表达上调，缓解occludin的降解，提示Vimentin通过介导AQP4/occludin的变化从而参与广州管圆线虫感染小鼠血脑屏障破坏过程，Vimentin可以作为治疗广州管圆线虫病的潜在靶点。

Claims (9)

1.波形蛋白作为治疗靶点在制备或筛选广州管圆线虫病治疗药物中的应用。

2.波形蛋白作为治疗靶点在制备或筛选预防和/或治疗广州管圆线虫病引起的血脑屏障破坏的药物中的应用。

3.抑制或下调波形蛋白表达的制剂在制备广州管圆线虫病治疗药物中的应用。

4.抑制或下调波形蛋白表达的制剂在预防和/或治疗广州管圆线虫病引起的血脑屏障破坏的药物中的应用。

5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述制剂为含有波形蛋白RNA干扰载体的试剂或含有波形蛋白CRISPR/Cas9基因编辑载体的试剂。

6.一种治疗广州管圆线虫病的药物，其特征在于，包括抑制或下调波形蛋白表达的制剂。

7.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述制剂为含有波形蛋白RNA干扰载体的试剂或含有波形蛋白CRISPR/Cas9基因编辑载体的试剂。

8.根据权利要求6所述药物，其特征在于，还包括药学上可添加的辅料。

9.根据权利要求8所述药物，其特征在于，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂中的一种或多种。

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