CN115902200A - 评价食用植物油安全的快速检测试剂盒、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒、制备方法及其应用。包括荧光试纸条和含有铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体、铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的样品反应瓶，荧光试纸条的一面从上至下依次为吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫于连接处交叠相接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜设有横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线位于质控线下方，个数为两条或三条，呈间隔分布，每条检测线上分别包被有一种待检物‑蛋白偶联物。能在一条试纸条上实现多靶标物的同步、快速检测。用于食用植物油质量安全评价，鉴别餐厨废弃油及发现食用植物油中强致癌物。

Description

评价食用植物油安全的快速检测试剂盒、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及食用植物油安全领域，具体涉及一种检测评价食用植物油安全的快速检测试剂盒、制备方法及其应用。

背景技术

我国是世界上最大的食用植物油生产和消费国。由于油料及食用油供给形势严峻，植物油原料及加工过程中危害因子的影响，导致食用油质量安全事件频发。比如餐厨废弃油脂回流餐桌引起的食用油质量安全问题，来自油脂原料及加工过程中的苯并[a]芘、黄曲霉毒素等强致癌物污染问题，成为全球食品安全领域研究的热点难点。

苯并[a]芘可产生于油脂加工过程中，对人体具有致畸、致癌和致突变性。黄曲霉毒素B₁是毒性最强的一类真菌毒素，属一类致癌物，可发生在油料原料的种、收、储、运、加等各环节。辣椒素类化合物是使辣椒具有辛辣刺激的主要化学物质，其成分主要包括辣椒素、二氢辣椒素、高二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素等化合物。其中辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类物质总量的90％。合成辣椒素被广泛应用于医药、杀虫剂、防污涂料、军事武器等领域。将苯并[a]芘与黄曲霉毒素、辣椒素类物质结合，对食用油质量安全进行检测，可以大大提高食用油安全性判别的准确度。

发明内容

本发明涉及一种评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒及制备方法。其具有操作简单、检测快速、灵敏度高的特点，可同步检测样品中苯并[a]芘、黄曲霉毒素B₁和辣椒素类物质的含量，用于食用植物油的质量安全评价。

本发明为解决上述技术问题，采用了如下技术方案：

评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒，包括荧光试纸条和含有铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体、铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的样品反应瓶，荧光试纸条的一面从上至下依次为吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫于连接处交叠相接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜设有横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线位于质控线下方，个数为两条或三条，呈间隔分布，每条检测线上分别包被有一种待检物-蛋白偶联物，所述的待检物为苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质，所述待检物-蛋白偶联物为苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物(BAP-OVA)、黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物(AFB1-OVA)、辣椒素类物质-卵清白蛋白偶联物(CAP-OVA)，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述的抗苯并[a]芘单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO:C201882的杂交瘤细胞株BBBE1H1分泌产生的；所述杂交瘤细胞株BBBE1H1分泌于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学。

按上述方案，所述铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体的制备方法如下：将铕标记试剂加硼酸缓冲液超声，然后加EDC溶液，振荡混匀，离心，去上清，加硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体，摇床反应，离心去上清，封闭，分装冻干。

按上述方案，所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法如下：将铕标记试剂加硼酸缓冲液超声，然后加EDC溶液，振荡混匀，离心，去上清，加硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体，摇床反应，离心去上清，封闭，分装冻干。

按上述方案，所述铕标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的制备方法如下：将铕标记试剂加硼酸缓冲液超声，然后加EDC溶液，振荡混匀，离心，去上清，加硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体，摇床反应，离心去上清，封闭，分装冻干。

按上述方案，所述的铕标记试剂为氧化铕乳胶荧光微光微球。

按上述方案，EDC溶液振荡活化15～30min，离心转速10000～15000rpm，摇床反应2-4h；所述的封闭为离心后沉淀加入含有0.5～1％BSA的硼酸缓冲液复溶，封闭铕标记试剂表面多余结合位点。

按上述方案，优选地，抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的IC50小于等于1.6ppb。如中国专利号201210117614.9公开的保藏编号为CCTCC NO.C201014的杂交瘤细胞株3G1分泌的单克隆抗体。

按上述方案，抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的IC50小于等于8.5ppb。如中国专利号201610079095X公开的保藏编号为CCTCC NO:C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌的单克隆抗体。

按上述方案，检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的距离为8-20mm，所述每相邻两条检测线之间的间距为1.0-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为3-10mm，所述样品反应瓶为1～5mL卡口瓶。

按上述方案，所述时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测线上苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物包被量为0.4～0.8μg/cm，黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg/cm，辣椒素类物质-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.8-1.0μg/cm；所述样品反应瓶中铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.15-0.4μg，抗辣椒素单克隆抗体冻干品的含量为0.2-0.4μg。

按上述方案，所述的同步检测苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素混合污染的时间分辨荧光免疫层析试纸条还包括样品缓释液及样品缓释液吸管，所述的样品缓释液为含0.01％～0.30％吐温-20、0.5～1.5％蔗糖和0.1～1％牛血清蛋白的PBS溶液；

按上述方案，所述时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法如下：

(1)将吸水纸剪裁为吸水垫；

(2)检测垫的制备：

将苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物，黄曲霉毒素B₁-卵清白蛋白偶联物、辣椒素类物质-卵清白蛋白偶联物配制成浓度为0.25-2mg/mL的包被液，根据待测检测物的种类和数量，用划膜方式在硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，对应得到两条或三条检测线，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；包被苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg，黄曲霉毒素B₁-卵清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg；包被辣椒素-卵清白蛋白偶联物的检测线上所需要的的包被量为0.8-1.0μg；

将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1-0.45mg/mL的包被液，于距检测线5-10mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.4～0.8μg，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条。

按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8-20mm，所述每相邻两条检测线之间的间距为1.0-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为3-10mm。

按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物包被液、苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物包被液、辣椒素类物质-卵清白蛋白偶联物包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

上述免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒在苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应6分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)时间分辨荧光强度与质控线(C)时间分辨荧光强度的比值；基于预先获得的时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)分别与苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中苯并[a]芘、黄曲霉毒素、辣椒素的含量，最后经换算即得待测样品中苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素的含量。

按上述方案，所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)分别与苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：

(1)配制得到一系列浓度的苯并[a]芘标准品溶液；配制得到一系列浓度黄曲霉毒素B₁标准品溶液；配制得到一系列浓度的辣椒素标准品溶液；

(2)将适量上述各浓度的苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的时间分辨荧光强度值，由此获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；

(3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线；经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线。

本发明的有益效果：

(1)快速、同步检测苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质。本发明提供的免疫层析时间分辨荧光试剂盒能在一条试纸条上实现对苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质多靶标物的同步、快速检测，使用的抗体均为单克隆抗体，特异性好、灵敏度高，三者之间无干扰，简单、快速。用于食用植物油质量安全评价，鉴别餐厨废弃油及发现食用植物油中强致癌物。

(2)灵敏度高。本发明提供的免疫层析时间分辨荧光试剂盒对检测溶液中苯并[a]芘的最低检测限为0.5ng/mL，黄曲霉毒素B1的最低检测限为0.01ng/mL，对辣椒素类物质的最低检测限为1.91ng/mL，该检测限能满足欧盟对食品中的限量要求。。

附图说明

图1为本发明提供的苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图。图中：1吸水垫、2检测垫、3样品垫、4质控线、5辣椒素类物质检测线、6黄曲霉毒素B₁检测线、7苯并[a]芘检测线。

图2为本发明提供的苯并[a]芘、辣椒素类物质时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图。图中：1吸水垫、2检测垫、3样品垫、4质控线、5苯并[a]芘检测线、6辣椒素类物质检测线。

具体实施方式

实施例1：抗苯并[a]芘单克隆抗体的获得

抗苯并[a]芘单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201882的BBBE1H1杂交瘤细胞株分泌产生，制备方法为：

将抗苯并[a]芘单克隆抗体杂交瘤细胞株BBBE1H1注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L PBS透析两天，再改用PB透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗苯并[a]芘单克隆抗体；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株BBBE1H1分泌的抗苯并[a]芘单克隆抗体的亚型为IgG1。

用常规非竞争酶联免疫吸附法(ELISA)测得小鼠腹水纯化得到的抗体效价可达到1.2×10⁵，即抗体稀释1.2×10⁵倍时溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA测定其对苯并[a]芘灵敏度IC50为0.013ng/mL。抗体的特异性高低可用交叉反应率来评价。采用间接竞争ELISA方法测定BBBE1H1单克隆抗体，将BaP、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[ghi]苝、苯并[j]荧蒽、苯并[k]荧蒽、屈、荧蒽、芘配制系列浓度的标准溶液，分别与等体积抗体共同加入酶标板中，37℃孵育1h，其他步骤同间接竞争ELISA方法。以上述标准品浓度为横坐标，以酶标仪测定的450nm下OD值B/B₀为纵坐标，绘制竞争抑制曲线，通过计算BaP与其他类似物的IC₅₀值比值来判定交叉反应率。计算公式如下：

CR％＝(IC₅₀ BaP/IC₅₀其他类似物)×100。

本发明提供的BBBE1H1单克隆抗体与其他结构类似物苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[ghi]苝、苯并[j]荧蒽、苯并[k]荧蒽、屈、荧蒽、芘的交叉反应，均小于15％，部分低至1％以下。

详细结果见表1：

表1.BBBE1H1与其他结构类似物的交叉反应

利用间接非竞争ELISA测定BBBE1H1的亲和力：

用BaP-OVA按2.0、1.0、0.5、0.25μg/mL浓度包被酶标板，100μL/孔，37℃，2h；封闭液封闭1h后，将用PBS稀释好的抗体(稀释因子1:2)加入酶标板，其余步骤同间接非竞争ELISA方法。以测定的OD₄₅₀值为纵坐标，抗体浓度(mol/L)的对数值为横坐标，做出4个浓度的4条S形曲线。找出每条S曲线最顶部的最大OD值即ODmax，找出每条曲线50％ODmax值对应的抗体浓度。将4个浓度任意两两一组，根据公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)计算抗体的亲和力常数，其中[Ab’]t、[Ab]t为每组中两个50％最大OD值对应的抗体浓度，n为每组中包被抗原浓度的倍数(包括1：2，1：4，1：8三个比值)，共得到6个Ka值。将得到的六个Ka值取平均，得抗苯并[a]芘小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法亲和力可达1.6×10⁹L/moL。

实施例2杂交瘤细胞株BBBE1H1的筛选

1.动物免疫

采用实验室制备的苯并[a]芘完全抗原BaP-BSA对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。第一次免疫将苯并[a]芘完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下五点注射。第二次免疫于21天后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的苯并[a]芘完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔2周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠100μg。前3次每次免疫后8-10天，剪尾采血，分离血清，采用间接ELISA对小鼠的血清效价进行检测。第3次免疫后8天，断尾采血，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的1/2倍。

2.细胞融合

加强免疫3天后，采用50％聚乙二醇PEG(分子量为1450)作为融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死小鼠，取出脾脏，用匀浆器碾碎脾脏，采用过滤网分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5：1-10：1的个数比混合，1000rpm离心5min，用RPMI-1640基础培养液重悬混合细胞，1000rpm离心5min，弃上清。加入50％PEG 1mL，共用时1分钟，贴壁加入RPMI-1640基础培养液20mL重悬细胞，离心，弃上清，管底的融合细胞用20mL含1％HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板中，1-2mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱中静置培养。所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，1％(体积百分数)生长因子(clone easy)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶岭-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于sigma-Aldrich公司。

细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后1-2周，细胞集落长至肉眼可见时，用微量移液器将克隆从培养基中挑出，转移至96孔细胞培养板采用HAT液体培养，待细胞长至2/3孔底时，吸取培养上清进行检测。采用两步筛选法，第一步采用间接ELISA方法，筛选出抗苯并[a]芘而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用苯并[a]芘作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，获得杂交瘤细胞株BBBE1H1。该杂交瘤细胞株已于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201882。

实施例3抗苯并[a]芘单克隆抗体杂交瘤细胞株BBBE1H1抗体可变区序列测定。

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株BBBE1H1的总RNA；

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以CDNA为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至苏州泓迅生物科技股份有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-CAG GTS MAR CTG MAG GAG TCW G-3’(22mer)和5’-CAG GGG CCAGTG GAT AGA CAG ATG GGG G-3’(28mer)，其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATC AAG ATG ACC CAG TCT CCA-3’(24mer)和5’-CCG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长360bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由120个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长321bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由107个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。

实施例4抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的获得

抗黄曲霉毒素单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201014的杂交瘤细胞株3G1，具体根据201210117614.9公开的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将获得的杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗黄曲霉毒素单克隆抗体。其中，纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。

实施例5抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的获得

抗辣椒素类物质通用单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生的单克隆抗体，具体根据201610079095.X公开的专利中报道的方法预先制得具体制备方法：

将杂交瘤细胞株YQQD8注射到预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗辣椒素类物质通用单克隆抗体。纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L PBS透析两天，再改用PB透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。

本发明提供的杂交瘤细胞株YQQD8可以用于制备高效价辣椒素单克隆抗体，通过酶联免疫吸附法(ELISA)测得抗体的效价可达2.56×10⁶。灵敏度高、特异性好，对辣椒素的50％抑制浓度IC₅₀为5.8ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50％抑制浓度IC₅₀依次为8.5ng/mL、5.0ng/mL、13.5ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9％-170％。

实施例6：苯并[a]芘、辣椒素类物质、黄曲霉毒素B1免疫磁珠的制备：

a清洗：称取2.5mg修饰了羧基的磁珠粉末于15mL离心管中，加入2mL清洗液清洗两遍，置于磁力架进行磁分离，弃去上清，然后用偶联缓冲液清洗2遍，磁分离，弃去上清。

b偶联：向清洗完的磁珠中加入4mL偶联缓冲液，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体2.5mg，抗辣椒素类物质单克隆抗体4mg、抗黄曲霉毒素单克隆抗体1mg，置于摇床8℃，200r/min过夜偶联，反应完成后，置于磁力架进行磁分离。

c封闭：向偶联后的磁珠中加入Tris-HCl缓冲液清洗两遍，然后加入4mL Tris-HCl封闭液，于摇床8℃，200r/min反应2h。

d保存：封闭反应完成后，进行磁分离，弃去上清，用0.01％NaN₃的PBS溶液定容到5mL，于4℃冰箱保存备用。用于后续样品前处理。

实施例7同步检测苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、苯并[a]芘时间分辨荧光试剂盒及其应用

定量检测苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括荧光试纸条、含有铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体、铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的辣椒素单克隆抗体反应瓶、样品稀释液，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长18mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；样品垫长15mm，宽4mm，相邻各垫的交叠长度为1mm；所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线，质控线上包被有兔抗鼠多克隆抗体，其包被量为0.25μg/cm质控线，以及第一检测线，第二检测线和第三检测线，检测线上分别苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.4μg/cm，黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.4μg/cm；辣椒素类物质-卵清白蛋白偶联物包被量为1.0μg/cm检测线，第一检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为10mm，质控线和第一检测线的间距4mm，与第二检测线的间距8mm，与第三条检测线的间距12mm。

所述荧光试纸条的获得：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长18mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将苯并[a]芘包被抗原用包被缓冲液配制成浓度为1.25mg/mL的包被液；用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为0.4μg，然后于37℃条件下干燥60分钟；

将黄曲霉毒素包被抗原用包被缓冲液配制成浓度为0.25mg/mL的包被液；用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为0.4μg，然后于37℃条件下干燥60分钟；

将辣椒素包被抗原用包被缓冲液配制成浓度为1mg/mL的包被液；用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为1.0μg，然后于37℃条件下干燥60分钟；

所述的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清白蛋白BSA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的包被液；用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.4μg，然后于37℃条件下干燥2小时；

所述的包被缓冲液为：

每10mL中含有卵清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽4mm。

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长15mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

所述的封闭液为2.9g十二水磷酸氢二钠，0.3g二水合磷酸二氢钠，1.0g Tween-20，1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-30)，0.25g EDTA，0.5g卵清白蛋白BSA，0.02g叠氮钠，加水定容至100mL所得；

(4)荧光试纸条的组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得荧光试纸条。

所述铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体探针的获得：

取0.2mol/L pH 8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。超声3S。加入40μL 15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。13000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声3S。加入30μg苯并[a]芘单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体。

所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1克隆抗体探针的获得：

取0.2mol/L pH8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。超声3S。加入40μL15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。13000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声3S。加入20μg抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体。

所述铕标记的抗辣椒素单克隆抗体探针的获得：

取0.2mol/L pH 8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。超声3S。加入40μL 15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。

13000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声3S。加入20μg辣椒素单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗辣椒素单克隆抗体。

上述的时间分辨荧光免疫层析试剂盒在苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质定量检测中的应用：

1.荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质、苯并[a]芘浓度的关系曲线的建立：

(1)取经高效液相色谱法(HPLC)检测为苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1和辣椒素类物质为阴性的大豆油添加苯并[a]芘/黄曲霉毒素B1/辣椒素类物质标准品(1：1：1)，其中辣椒素类物质的标准品为天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素的1：1：1的混合。

样品前处理：取10mL塑料离心管作反应容器，准确称取1g大豆油，加入200ng标样储备液，涡旋混匀1min。加入5mL正己烷溶液，超声10min，再加入5mL正己烷溶液，超声10min。取1mL提取液，用9mL ddH₂O定容至10mL，涡旋2min，加入偶联了苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1和辣椒素单克隆抗体的免疫磁珠，涡旋混合10分钟，弃上清。加入甲醇溶液1mL，涡旋混合2分钟，用检测液稀释5倍，上清作为待测液。

(2)取不同浓度的苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1与辣椒素混合标准样溶液300μL加入样品瓶，混匀，将荧光试纸条样品垫一端插入反应瓶中，37℃反应10分钟，上机检测。检测仪器为时间分辨荧光免疫分析仪，激发波长365nm，发射波长615nm。检测得到各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)。

(3)分别以苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1和辣椒素类物质浓度为横坐标，各浓度标准品溶液相应的检测线与质控线时间分辨荧光强度的比值即T/C值为纵坐标，拟合得到关系曲线。该方法的有效检测范围为辣椒素类物质1.9～62.5ng/mL；黄曲霉毒素B1为0.01-5ng/mL；苯并[a]芘为0.5～28.7ng/mL。

2.样品中苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1与辣椒素含量的加标回收实验：

对经高效液相色谱法(HPLC)检测为苯并[a]芘、辣椒素类物质和黄曲霉毒素B1为阴性的大豆油添加苯并[a]芘/黄曲霉毒素B1/辣椒素类物质标准品(1：1：1)10ng/mL、20ng/mL和40ng/mL，充分混匀后进行样品前处理提取。样品前处理步骤如下：取10mL塑料离心管作反应容器，准确称取1g大豆油，加入200ng标样储备液，涡旋混匀1min。加入5mL正己烷溶液，超声10min，再加入5mL正己烷溶液，超声10min。取1mL提取液，用9mL ddH₂O定容至10mL，涡旋2min，加入偶联了苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1和辣椒素单克隆抗体的免疫磁珠，涡旋混合10分钟，弃上清。加入甲醇溶液1mL，涡旋混合2分钟，用检测液稀释5倍，上清作为待测液。取上述待测液300μL加入到含有铕标记的单克隆抗体的样品反应瓶中，混匀，将荧光试纸条样品垫一端插入反应瓶中，37℃反应10min，上机检测。检测仪器为时间分辨荧光免疫分析仪，激发波长365nm，发射波长615nm。检测得到各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与标准品物质浓度的关系曲线，得到样品溶液中的苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1与辣椒素类物质浓度，然后根据稀释倍数即可求得样品中苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1与辣椒素类物质含量。测得大豆油样品中的苯并[a]芘加标回收率依次为：92.5％，93.2％，103.5％；辣椒素加标回收率依次为：91.2％，89.6％，110.2％；黄曲霉毒素B1加标回收率依次为95.2％，93.1％，108.2％。

实施例8：苯并[a]芘、辣椒素类物质免疫磁珠的制备：

a清洗：称取2.5mg修饰了羧基的磁珠粉末于15mL离心管中，加入2mL清洗液清洗两遍，置于磁力架进行磁分离，弃去上清，然后用偶联缓冲液清洗2遍，磁分离，弃去上清。

b偶联：向清洗完的磁珠中加入4mL偶联缓冲液，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体2.5mg，抗辣椒素类物质单克隆抗体4mg，置于摇床8℃，200r/min过夜偶联，反应完成后，置于磁力架进行磁分离。

c封闭：向偶联后的磁珠中加入Tris-HCl缓冲液清洗两遍，然后加入4mL Tris-HCl封闭液，于摇床8℃，200r/min反应2h。

d保存：封闭反应完成后，进行磁分离，弃去上清，用0.01％NaN₃的PBS溶液定容到5mL，于4℃冰箱保存备用。用于后续样品前处理。

实施例9：同步检测苯并[a]芘、辣椒素类物质的时间分辨荧光试剂盒及其应用

定量检测苯并[a]芘、辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括荧光试纸条、含有铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体、抗辣椒素类物质通用单克隆抗体、反应瓶、样品稀释液，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长18mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；样品垫长15mm，宽4mm，相邻各垫的交叠长度为1mm；所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和第一条检测线和第二条检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，其包被量为0.25μg/cm质控线，所述检测线上包被辣椒素包被抗原，其包被量为0.4μg/cm检测线，第一条检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为9mm，质控线和第一条检测线的间距4mm，与第二条检测线的间距8mm。

所述荧光试纸条的获得：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长18mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将辣椒素包被抗原用包被缓冲液配制成浓度为1mg/mL的包被液；用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为1.0μg，然后于37℃条件下干燥60分钟；

将苯并[a]芘包被抗原用包被缓冲液配制成浓度为1.25mg/mL的包被液；用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为0.4μg，然后于37℃条件下干燥60分钟；

所述的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清白蛋白BSA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的包被液；用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.4μg，然后于37℃条件下干燥2小时；

所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽4mm。

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长15mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

所述的封闭液为2.9g十二水磷酸氢二钠，0.3g二水合磷酸二氢钠，1.0g Tween-20，1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-30)，0.25g EDTA，0.5g卵清白蛋白BSA，0.02g叠氮钠，加水定容至100mL所得；

(4)荧光试纸条的组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得荧光试纸条。

所述铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体的获得：

取0.2mol/L pH 8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。超声3S。加入40μL 15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。13000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声3S。加入20μg苯并[a]芘单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体。

所述铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体的获得：

取0.2mol/L pH 8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。超声3S。加入40μL 15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。13000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声3s。加入20μg苯并[a]芘单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体。

上述的时间分辨荧光免疫层析试纸条苯并[a]芘、辣椒素类物质定量检测中的应用：

1.荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘、辣椒素类物质浓度的关系曲线的建立：

(1)对经高效液相色谱法(HPLC)检测为苯并[a]芘和辣椒素类物质为阴性的大豆油添加苯并[a]芘/辣椒素类物质标准品(1：1)，其中辣椒素类物质的标准品为天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素的1：1：1的混合溶液。样品前处理步骤如下：取10mL塑料离心管作反应容器，准确称取1g大豆油，加入200ng标样储备液，涡旋混匀1min。加入5mL正己烷溶液，超声10min，再加入5mL正己烷溶液，超声10min。取1mL提取液，用9mL ddH₂O定容至10mL，涡旋2min，加入偶联了苯并[a]芘、；辣椒素类物质单克隆抗体的免疫磁珠，涡旋混合10分钟，弃上清。加入甲醇溶液1mL，涡旋混合2分钟，用样品缓释液(体积分数为0.20％吐温-20、0.5％蔗糖和1％牛血清蛋白PBS溶液)稀释5倍，上清作为待测液。

(2)取苯并[a]芘与辣椒素提取液300μL加入样品瓶，加入到含有铕标记的单克隆抗体的样品反应瓶中，混匀，将荧光试纸条样品垫一端插入反应瓶中，37℃反应10分钟，上机检测。检测仪器为时间分辨荧光免疫分析仪，激发波长365nm，发射波长615nm。检测得到各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)。

(3)分别以苯并[a]芘和辣椒素类物质标准品浓度为横坐标，各浓度标准品溶液相应的检测线与质控线时间分辨荧光强度的比值即T/C值为纵坐标，拟合得到关系曲线。该方法的有效检测范围为辣椒素类物质1.9～62.5ng/mL；苯并[a]芘0.5～28.7ng/mL。

2.大豆油样品中苯并[a]芘和辣椒素类物质含量的加标回收实验：

对经高效液相色谱法(HPLC)检测为苯并[a]芘和辣椒素类物质为阴性的大豆油添加苯并[a]芘/辣椒素标准品(1：1)10ng/mL、20ng/mL和40ng/mL，充分混匀后进行样品前处理提取。取10mL塑料离心管作反应容器，准确称取1g花生油，加入200ng标样储备液，涡旋混匀1min。向加标的植物油中加入5mL正己烷溶液，超声10min，再加入5mL正己烷溶液，超声10min。取1mL提取液，用9mL ddH₂O定容至10mL，涡旋2min，加入的偶联了苯并[a]芘和辣椒素类物质单克隆抗体的免疫磁珠，涡旋混合数14分钟，弃上清。加入甲醇溶液1mL，涡旋混合2分钟，用样品缓释液(体积分数为0.20％吐温-20、0.5％蔗糖和1％牛血清蛋白PBS溶液)稀释5倍，上清作为待测液。取上述待测液300μL加入到含有铕标记的单克隆抗体的样品反应瓶中，混匀，将荧光试纸条样品垫一端插入反应瓶中，37℃反应10min，上机检测。检测仪器为时间分辨荧光免疫分析仪，激发波长365nm，发射波长615nm。检测得到各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与标准品物质浓度的关系曲线，得到样品溶液中的苯并[a]芘与辣椒素类物质浓度，然后根据稀释倍数即可求得样品中苯并[a]芘与辣椒素类物质含量。测得大豆油样品中的苯并[a]芘加标回收率依次为：92.5％，93.2％，103.5％；辣椒素类物质加标回收率依次为：91.2％，89.6％，110.2％。

Claims (9)

1.评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：包括荧光试纸条和含有铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体、铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的样品反应瓶，荧光试纸条的一面从上至下依次为吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫于连接处交叠相接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜设有横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线位于质控线下方，个数为两条或三条，呈间隔分布，每条检测线上分别包被有一种待检物-蛋白偶联物，所述的待检物为苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质，所述待检物-蛋白偶联物为苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物(BAP-OVA)、黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物(AFB1-OVA)、辣椒素类物质-卵清白蛋白偶联物(CAP-OVA)，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述的抗苯并[a]芘单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO:C201882的杂交瘤细胞株BBBE1H1分泌产生的。

2.根据权利要求1所述的评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体为通过表面修饰的羧基与抗苯并[a]芘单克隆抗体的氨基端偶联形成，制备方法为：将铕标记试剂加硼酸缓冲液超声，然后加EDC溶液，振荡混匀，离心，去上清，加硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体，摇床反应，离心去上清，封闭，分装冻干；

所述铕标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法如下：将铕标记试剂加硼酸缓冲液超声，然后加EDC溶液，振荡混匀，离心，去上清，加硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体，摇床反应，离心去上清，封闭，分装冻干；

所述铕标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的制备方法如下：将铕标记试剂加硼酸缓冲液超声，然后加EDC溶液，振荡混匀，离心，去上清，加硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体，摇床反应，离心去上清，封闭，分装冻干。

3.根据权利要求1所述的评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测线上苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物包被量为0.4～0.8μg/cm，黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg/cm，辣椒素类物质-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.8-1.0μg/cm；所述样品反应瓶中铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.15-0.4μg，抗辣椒素单克隆抗体冻干品的含量为0.2-0.4μg。

4.根据权利要求1所述的评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的IC50小于等于1.6ppb；抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的IC50小于等于8.5ppb。

5.根据权利要求1所述的评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：还包括样品缓释液及样品缓释液吸管，所述的样品缓释液为含0.01％～0.30％吐温-20(v/v)、0.5～1.5％蔗糖(w/w)和0.1～1％牛血清蛋白(w/w)的PBS溶液。

6.根据权利要求1所述的评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法如下：

(1)将吸水纸剪裁为吸水垫；

(2)检测垫的制备：

将苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物，黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物、辣椒素类物质-卵清白蛋白偶联物配制成浓度为0.25-2mg/mL的包被液，根据待测检测物的种类和数量，用划膜方式在硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，对应得到两条或三条检测线，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；包被苯并[a]芘-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg，黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg；包被辣椒素-卵清白蛋白偶联物的检测线上所需要的的包被量为0.8-1.0μg；

将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1-0.45mg/mL的包被液，于距检测线5-10mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.4～0.8μg，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条。

按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8-20mm，所述每相邻两条检测线之间的间距为1.0-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为3-10mm。

7.根据权利要求1所述的评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述时间分辨荧光免疫层析试纸条中，检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的距离为8-20mm，所述每相邻两条检测线之间的间距为1.0-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为3-10mm，所述样品反应瓶为1～5mL卡口瓶。

8.权利要求1所述的评价食用植物油安全性的时间分辨荧光试剂盒在苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应6分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)时间分辨荧光强度与质控线(C)时间分辨荧光强度的比值；基于预先获得的时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)分别与苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质的含量，最后经换算即得待测样品中苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质的含量。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)分别与苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：

(1)配制得到一系列浓度的苯并[a]芘标准品溶液；配制得到一系列浓度黄曲霉毒素B1标准品溶液；配制得到一系列浓度的辣椒素类物质标准品溶液；

(2)将适量上述各浓度的苯并[a]芘、黄曲霉毒素B1、辣椒素类物质标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的时间分辨荧光强度值，由此获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；

(3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线；经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线。

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