CN116338164A - 苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用。其包括荧光试纸条和含有铕标记的荧光探针的样品反应杯，所述铕标记的荧光探针是铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干品，其中，所述的荧光试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴有吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫并自上而下横向设置质控线和检测线，质控线和检测线上分别包被有羊抗鼠二抗、苯并[a]芘检测抗原。操作简单且可准确、快速的测定样品中苯并[a]芘含量。

Description

苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属真菌毒素检测领域，具体涉及苯并[a]芘流动滞后时间分辨荧光速测试剂盒及其应用。

背景技术

苯并[a]芘具有致畸、致癌的慢性毒性。长期生活在含BaP的空气环境中，会造成慢性中毒。主要通过食物或饮水进入人体内，经肠道吸收通过血液循环遍布于身体各个部位，并在乳腺和脂肪组织内不断蓄积。苯并[a]芘对皮肤、眼睛有较强的刺激作用，是导致人体病变的诱变剂和致癌物。经动物试验发现，由口直接摄入的苯并[a]芘可通过胎盘进入胎体，造成不同程度的毒性和致癌作用；苯并[a]芘通过肝脏、肾等排毒器官后，随粪便排出体外，苯并[a]芘粪便作为肥料施入土地，进而污染种植的粮食作物，最终影响人们的身体健康。苯并[a]芘的毒性超过黄曲霉毒素，不仅是多环芳香烃类中毒性最大的一种，也是所占比例较高的一种，约占环境中全部致癌多环芳烃类化合物的1/5。动物性试验研究表明，多环芳香烃特别是3，4-苯并[a]芘与动物和人类的肺癌有一定关系，是导致肺癌的病源。

随着生活水平的不断提高，人们对食品质量安全的要求越来越高。为了提高我国食品质量安全水平，更大程度的满足人们的安全消费需求，亟需食品中苯并[a]芘的准确、高效检测技术。

目前苯并[a]芘的检测方法主要是仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法如高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测。免疫分析法是以抗原与抗体的特异性识别作用和可逆性结合反应为基础的分析方法，该方法具有很高的选择性和灵敏度，与仪器分析法相比大大简化缩短样品处理时间，节约了检测成本。

由于近年来多篇文献中报道谷物中苯并[a]芘污染呈加重趋势，因此迫切需要可快速现场检测苯并[a]芘污染的检测技术，以保障我国食品安全。目前市场上未见用于苯并[a]芘检测的免疫时间分辨荧光试剂盒产品。

发明内容

本发明目的是提供一种操作简单且可准确、快速的测定样品中苯并[a]芘含量的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用。

本发明采用的技术方案如下：

苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其包括荧光试纸条和含有铕标记的荧光探针的样品反应杯，所述铕标记的荧光探针是铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干品，其中，所述的荧光试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴有吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫并自上而下横向设置质控线和检测线，质控线和检测线上分别包被有羊抗鼠二抗、苯并[a]芘检测抗原，所述的抗苯并[a]芘单克隆抗体由杂交瘤细胞株BBBE1H1分泌得到的，所述杂交瘤细胞株BBBE1H1于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201882。

按上述方案，所述铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干品为通过表面修饰的羧基与抗苯并[a]芘单克隆抗体的氨基端偶联形成，具体制备方法如下：将铕标记试剂加硼酸缓冲液超声，然后加EDC溶液，振荡混匀，离心，去上清，加硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体，摇床反应，离心去上清，封闭，分装冻干。

按上述方案，所述的铕标记试剂为氧化铕乳胶荧光微光微球。

按上述方案，EDC溶液振荡活化15～30min，离心转速10000～15000rpm，摇床反应2-4h；所述的封闭为离心后沉淀加入含有0.5～1％ BSA的硼酸缓冲液复溶，封闭铕标记试剂表面多余结合位点。

按上述方案，所述的苯并[a]芘检测抗原为BAP-OVA。

按上述方案，所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的苯并[a]芘检测抗原包被量480～1000ng；每厘米质控线所需的羊抗鼠多抗的包被量100～900ng；所述样品反应杯中荧光探针的含量为0.2～1.0μg。

按上述方案，所述并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒还包括样品缓释液及样品缓释液吸管，所述的样品缓释液为：含1.0％～1.5％蔗糖(w/w)，0.05％～3.0％BSA(w/w)和0.01％～0.30％ Tween-20的PBS溶液(v/v)；

所述的荧光试纸条是采用以下方法获得的：

(1)将吸水纸剪裁成所需大小得吸水垫；

(2)检测垫的制备：

将苯并[a]芘检测抗原配成抗原包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线；将羊抗鼠二抗配成包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线；

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜放入封闭液中完全浸湿，取出后于37～40℃条件下干燥过夜，得所需样品垫，备用；

(4)荧光试纸条的组装：

依次将吸水垫、检测垫、样品垫粘贴在衬板的一面，相邻各垫在连接处交叠连接即得荧光试纸条，相互之间重叠长度为1～2mm。

按上述方案，所述的试纸条中样品垫长13mm～15mm、检测垫长25mm～28mm、吸水垫长17mm～20mm，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为10-18mm，质控线和检测线的间距为2-6mm。。

按上述方案，试纸条宽度3～5mm宽，长度45～65mm，置于放有干燥机的试纸条筒中4℃保存。

按上述方案，所述样品垫封闭液为：1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

上述苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在苯并[a]芘含量检测中的应用：将样品反应杯放置在37℃孵育器里，将待测样品液样品反应杯中，吹打混匀，然后插入荧光试纸条，反应6～10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线(T)荧光强度值和质控线(C)荧光强度值的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线，获得待测样品液中苯并[a]芘的含量。

按上述方案，所述的待测样品为食用植物油，待测样品前处理步骤为：食用植物油加正已烷超声萃取，取上清液，加水稀释8-12倍，然后加偶联了抗苯并[a]芘单克隆抗体的免疫磁珠，涡旋混合，弃上清，加甲醇涡旋混合，用样品缓释液稀释，获得上清即待测样品液。

所述偶联抗苯并[a]芘单克隆抗体的免疫磁珠包括磁珠和基于磁珠上COOH基团和抗体氨基基团偶联的抗苯并[a]芘单克隆抗体。免疫磁珠中抗苯并[a]芘单克隆抗体和磁珠的质量比为2：1～1：5。

按上述方案，所述的检测液为含有0.5wt％Tween 20的PBS,pH 7.4。

按上述方案，所述的荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：

(1)配制得到一系列浓度梯度的苯并[a]芘标准品溶液；

(2)将适量上述各浓度的苯并[a]芘标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应6分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)；

(3)经拟合得到荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线。

本研究将苯并[a]芘单克隆抗体与稀土元素铕标记试剂相偶联，研制出了高灵敏的苯并[a]芘时间分辨荧光免疫层析试纸条，同时建立了时间分辨荧光免疫层析方法，其具有灵敏度高、性质稳定、避免荧光背景的干扰，检测时间短(一般检测只需6-8min)等优点，非常适合开发农药残留快速检测方法，可实现苯并[a]芘的快速灵敏检测。

本发明的有益效果：

本发明提供的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒可准确、快速的测定苯并[a]芘含量。其对苯并[a]芘的样品检出限为0.5ng/mL(空白样品检测11次，计算SD值，检出限为3SD)。该试纸条应用于实际样品的检测，检测结果与HPLC方法进行比对，回收率在90.3％-110.2％之间，结果符合相关系数达到0.987(R2)，可用于苯并[a]芘实际样品检测。

附图说明

图1为本发明提供的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒中荧光试纸条的结构示意图。图中：1样品垫、2检测线、3质控线、4吸水垫。

具体实施方式

下面结合具体实施案例来进一步阐述本发明。

实施例1：抗苯并[a]芘单克隆抗体的获得

抗苯并[a]芘单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201882的BBBE1H1杂交瘤细胞株分泌产生，制备方法为：

将抗苯并[a]芘单克隆抗体杂交瘤细胞株BBBE1H1注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L PBS透析两天，再改用PB透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗苯并[a]芘单克隆抗体；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株BBBE1H1分泌的抗苯并[a]芘单克隆抗体的亚型为IgG1。

用常规非竞争酶联免疫吸附法(ELISA)测得小鼠腹水纯化得到的抗体效价可达到1.2×10⁵，即抗体稀释1.2×10⁵倍时溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA测定其对苯并[a]芘灵敏度IC50为0.013ng/mL。抗体的特异性高低可用交叉反应率来评价。采用间接竞争ELISA方法测定BBBE1H1单克隆抗体，将BaP、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[ghi]苝、苯并[j]荧蒽、苯并[k]荧蒽、屈、荧蒽、芘配制系列浓度的标准溶液，分别与等体积抗体共同加入酶标板中，37℃孵育1h，其他步骤同间接竞争ELISA方法。以上述标准品浓度为横坐标，以酶标仪测定的450nm下OD值B/B₀为纵坐标，绘制竞争抑制曲线，通过计算BaP与其他类似物的IC₅₀值比值来判定交叉反应率。计算公式如下：

CR％＝(IC₅₀ BaP/IC₅₀其他类似物)×100。

本发明提供的BBBE1H1单克隆抗体与其他结构类似物苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[e]芘、苯并[ghi]苝、苯并[j]荧蒽、苯并[k]荧蒽、屈、荧蒽、芘的交叉反应，均小于15％，部分低至1％以下。

详细结果见表1：

表1.BBBE1H1与其他结构类似物的交叉反应

利用间接非竞争ELISA测定BBBE1H1的亲和力：

用BaP-OVA按2.0、1.0、0.5、0.25μg/mL浓度包被酶标板，100μL/孔，37℃，2h；封闭液封闭1h后，将用PBS稀释好的抗体(稀释因子1:2)加入酶标板，其余步骤同间接非竞争ELISA方法。以测定的OD₄₅₀值为纵坐标，抗体浓度(mol/L)的对数值为横坐标，做出4个浓度的4条S形曲线。找出每条S曲线最顶部的最大OD值即ODmax，找出每条曲线50％ ODmax值对应的抗体浓度。将4个浓度任意两两一组，根据公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)计算抗体的亲和力常数，其中[Ab’]t、[Ab]t为每组中两个50％最大OD值对应的抗体浓度，n为每组中包被抗原浓度的倍数(包括1：2，1：4，1：8三个比值)，共得到6个Ka值。将得到的六个Ka值取平均，得抗苯并[a]芘小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法亲和力可达1.6×10⁹L/moL。

实施例2杂交瘤细胞株BBBE1H1的筛选

1.动物免疫

采用实验室制备的苯并[a]芘完全抗原BaP-BSA对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。第一次免疫将苯并[a]芘完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下五点注射。第二次免疫于21天后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的苯并[a]芘完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔2周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠100μg。前3次每次免疫后8-10天，剪尾采血，分离血清，采用间接ELISA对小鼠的血清效价进行检测。第3次免疫后8天，断尾采血，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的1/2倍。

2.细胞融合

加强免疫3天后，采用50％聚乙二醇PEG(分子量为1450)作为融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死小鼠，取出脾脏，用匀浆器碾碎脾脏，采用过滤网分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5：1-10：1的个数比混合，1000rpm离心5min，用RPMI-1640基础培养液重悬混合细胞，1000rpm离心5min，弃上清。加入50％ PEG 1mL，共用时1分钟，贴壁加入RPMI-1640基础培养液20mL重悬细胞，离心，弃上清，管底的融合细胞用20mL含1％HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板中，1-2mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱中静置培养。所述的含1％ HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，1％(体积百分数)生长因子(clone easy)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶岭-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于sigma-Aldrich公司。

细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后1-2周，细胞集落长至肉眼可见时，用微量移液器将克隆从培养基中挑出，转移至96孔细胞培养板采用HAT液体培养，待细胞长至2/3孔底时，吸取培养上清进行检测。采用两步筛选法，第一步采用间接ELISA方法，筛选出抗苯并[a]芘而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用苯并[a]芘作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，获得杂交瘤细胞株BBBE1H1。该杂交瘤细胞株已于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201882。

实施例3抗苯并[a]芘单克隆抗体杂交瘤细胞株BBBE1H1抗体可变区序列测定。

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株BBBE1H1的总RNA；

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以CDNA为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至苏州泓迅生物科技股份有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-CAG GTS MAR CTG MAG GAG TCW G-3’(22mer)和5’-CAG GGG CCAGTG GAT AGA CAG ATG GGG G-3’(28mer)，其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATC AAG ATG ACC CAG TCT CCA-3’(24mer)和5’-CCG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长360bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由120个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长321bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由107个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。

实施例4：苯并[a]芘免疫时间分辨荧光速测试剂盒及其应用

苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，包括荧光试纸条、样品反应瓶(含有铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干品)、样品稀释液及样品稀释液吸管。所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1-2mm，其中：吸水垫长15mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；样品垫长13mm，宽4mm。所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和检测线，所述质控线包被有羊抗鼠二抗，所述检测线上包被苯并[a]芘检测抗原，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15mm，质控线和检测线的间距为5mm。

所述荧光试纸条的获得：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长15mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将苯并[a]芘检测抗原(BAP-BSA)用包被缓冲液配制成浓度为0.8mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需BAP-BSA的包被量为480ng，然后于37℃条件下干燥30分钟；

所述的包被缓冲液为：0.1g牛血清白蛋白，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到10mL所得；

质控线的包被：

将羊抗鼠二抗用包被缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的包被液；于距检测线5mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的羊抗鼠二抗的包被量为100ng，然后于37℃条件下干燥1小时；

所述的包被缓冲液0.1g牛血清白蛋白，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到10mL所得；

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长13mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

所述的封闭液为1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

(4)荧光试纸条的组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、荧光标记抗体反应垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得荧光试纸条(见图1)。

所述的铕标记试剂为氧化铕乳胶，制备方法如下：取0.2mol/L pH 8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL氧化铕乳胶(聚苯乙烯荧光微球，粒径200nm，固形物含量1％)，超声1min，加入40μL 15mg/ml的EDC溶液，振荡混匀15min，然后离心(12000r/min，10℃，10min)，去上清液(去除EDC等)，再加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀。加入10ng苯并[a]芘单克隆抗体，250r/min、4℃下摇床反应2h。然后取出，离心(12000r/min,10℃，10min)，去上清液(去除未连接的抗体及BSA)，加入1mL含有0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀后超声1min。再250r/min、4℃下摇床反应1h。偶联成功后分装冻干。所述含有铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干粉的样品反应瓶的获得：取上述铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体0.25μg放于3mL卡口瓶中，采用常规冷冻真空干燥方法抽干后，即得铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干粉，4℃保存，备用。

实施例5：上述苯并[a]芘免疫磁珠的制备用于样品前处理：

苯并[a]芘免疫磁珠的制备：

a清洗：称取2.5mg修饰了羧基的磁珠粉末于15mL离心管中，加入2mL清洗液清洗两遍，置于磁力架进行磁分离，弃去上清，然后用偶联缓冲液清洗2遍，磁分离，弃去上清。

b偶联：向清洗完的磁珠中加入4mL偶联缓冲液，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体2.5mg，置于摇床8℃，200r/min过夜偶联，反应完成后，置于磁力架进行磁分离。

c封闭：向偶联后的磁珠中加入Tris-HCl缓冲液清洗两遍，然后加入4mL Tris-HCl封闭液，于摇床8℃，200r/min反应2h。

d保存：封闭反应完成后，进行磁分离，弃去上清，用0.01％NaN₃的PBS溶液定容到5mL，于4℃冰箱保存备用。用于后续样品前处理。

实施例6：上述流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在植物油苯并[a]芘检测中的应用：

荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线的建立：

(1)对经高效液相色谱(HPLC)检测苯并[a]芘为阴性的植物油样品进行前处理，将苯并[a]芘加标至浓度为200、66.6、22.2、7.4、2.4、0.8、0.2、0.09ng/mL。

样品前处理方法：取10mL塑料离心管作反应容器，准确称取1g大豆油，涡旋混匀1min。向其中加入5mL正己烷溶液，超声10min，再加入5mL正己烷溶液，超声10min。取1mL提取液，用9mL ddH₂O定容至10mL，涡旋2min，加入的偶联了苯并芘单克隆抗体的免疫磁珠用于特异性结合样品中的苯并[a]芘，涡旋混合14分钟，弃上清。加入甲醇溶液1mL，涡旋混合2分钟，将结合在磁珠上的苯并[a]芘洗脱下来，用缓释液(含1.0％蔗糖，1.0％BSA和0.1％Tween-20的PBS溶液)稀释5倍作为待测液用于上样检测。

(2)取上述各浓度的苯并[a]芘标准品溶液各100μL，分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应6分钟，用吸水纸吸干样品垫残留液体，即刻用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长:365nm，测定波长：615nm)，得到各荧光试纸条上检测线处(T)和质控线(C)处的荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)。以标准品浓度为横坐标，T/C值为纵坐标，建立标准曲线。其定量检测限为0.5ng/mL。

(3)在空白玉米油样品中添加苯并[a]芘浓度为5ng/mL、10ng/mL、50μg/mL，通过标准曲线定量计算，该方法的添加回收率在90.3％-110.2％之间。

实施例7：上述流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在实际玉米油样品苯并[a]芘检测中的应用：

取待测玉米油样品5个，前处理后检测步骤同实施例2，采用时间分辨荧光免疫分析仪检测，获得各荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T_x/C)，然后将其代入荧光试纸条检测线荧光强度与质控荧光强度的比值(T_x/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线，试剂盒与HPLC检测结果相关系数达到0.987(R2)，检测回收率在90.3％-110.2％之间。

Claims (10)

1.苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于，包括荧光试纸条和含有铕标记的荧光探针的样品反应杯，所述铕标记的荧光探针是铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干品，其中，所述的荧光试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴有吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫并自上而下横向设置质控线和检测线，质控线和检测线上分别包被有羊抗鼠二抗、苯并[a]芘检测抗原，所述的抗苯并[a]芘单克隆抗体由杂交瘤细胞株BBBE1H1分泌得到的，所述杂交瘤细胞株BBBE1H1分泌于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201882。

2.根据权利要求1所述的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于，所述的铕标记试剂为氧化铕乳胶荧光微光微球。

3.根据权利要求1所述的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于，所述铕标记的抗苯并[a]芘单克隆抗体冻干品为通过表面修饰的羧基与抗苯并[a]芘单克隆抗体的氨基端偶联形成，具体制备方法如下：将铕标记试剂加硼酸缓冲液超声，然后加EDC溶液，振荡混匀，离心，去上清，加硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，加入抗苯并[a]芘单克隆抗体，摇床反应，离心去上清，封闭，分装冻干。

4.根据权利要求1所述的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于，所述的苯并[a]芘检测抗原为BAP-OVA；所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的苯并[a]芘检测抗原包被量480～1000ng；每厘米质控线所需的羊抗鼠二抗的包被量100～900ng；所述样品反应杯中荧光探针的含量为0.2～1.0μg。

5.根据权利要求1所述的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于，还包括样品缓释液及样品缓释液吸管，所述的样品缓释液为：含1.0％～1.5％蔗糖(w/w)，0.05％～3.0％BSA(w/w)和0.01％～0.30％Tween-20的PBS溶液(v/v)；

所述的试纸条中样品垫长13mm～15mm、检测垫长25mm～28mm、吸水垫长17mm～20mm，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为10-18mm，质控线和检测线的间距为2-6mm。

6.根据权利要求1所述的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于，所述的待测样品为食用植物油，待测样品前处理步骤为：食用植物油加正已烷超声萃取，取上清液，加水稀释8-12倍，然后加偶联了抗苯并[a]芘单克隆抗体的免疫磁珠，涡旋混合，弃上清，加甲醇涡旋混合，用样品缓释液稀释，获得上清即待测样品液。

7.根据权利要求1所述的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于，所述的荧光试纸条是采用以下方法获得的：

(1)将吸水纸剪裁成所需大小得吸水垫；

(2)检测垫的制备：

将苯并[a]芘检测抗原配成抗原包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线；将羊抗鼠二抗配成浓度包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线；

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜放入封闭液中完全浸湿，取出后于37～40℃条件下干燥过夜，得所需样品垫，备用；

(4)荧光试纸条的组装：

依次将吸水垫、检测垫、样品垫粘贴在衬板的一面，相邻各垫在连接处交叠连接即得荧光试纸条。

8.权利要求1所述的苯并[a]芘流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在苯并[a]芘含量检测中的应用：将样品反应杯放置在37℃孵育器里，将待测样品液样品反应杯中，吹打混匀，然后插入荧光试纸条，反应6～10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线(T)荧光强度值和质控线(C)荧光强度值的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线，获得待测样品液中苯并[a]芘的含量。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，

所述的待测样品为食用植物油，待测样品前处理步骤为：食用植物油加正已烷超声萃取，取上清液，加水稀释8-12倍，然后加偶联了抗苯并[a]芘单克隆抗体的免疫磁珠，涡旋混合，弃上清，加甲醇涡旋混合，用样品缓释液稀释，获得上清即待测样品液。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，

所述的荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：

(1)配制得到一系列浓度梯度的苯并[a]芘标准品溶液；

(2)将适量上述各浓度的苯并[a]芘标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应6分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)；

(3)经拟合得到荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与苯并[a]芘浓度的关系曲线。

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