CN115894727A - 一种陈皮多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然产物提取领域，具体公开了一种陈皮多糖及其制备方法和应用。按质量比计，该陈皮多糖中的单糖组成为：鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：半乳糖醛酸＝(2.5～3.5)：(16.0～17.5)：(12.5～14.5)：(1.5～2)：(60～70)。经实验验证，该陈皮多糖具有良好的抗血栓效果，尤其能够有效抑制由普纳替尼引起的血栓形成。

Description

一种陈皮多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及天然产物提取领域，尤其是涉及一种陈皮多糖及其制备方法和应用。

背景技术

普纳替尼(ponatinib)是一种多靶点的激酶制剂，作为第三代酪氨酸激酶抑制剂被FDA批准用于治疗对酪氨酸激酶抑制药耐药或不能耐受的慢性期、加速期或急变期慢性粒细胞白血病(CML)及费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)。然而，在临床应用过程中发现，普纳替尼会引发诸如高血压、心力衰竭和重度血栓等副作用，极大阻碍了该药物的进一步使用。目前，该类药物的主要治疗方案是和抗血栓口服药物联用。常用的抗血栓药物主要为小分子抑制剂如VKA拮抗剂、Xa因子抑制剂、COX1抑制剂等。但过量使用此类药物会引发如脑出血、胃肠道出血、急性肾衰竭和肝损伤以及复发性血栓栓塞等二次伤害，因此，寻找一种能与普纳替尼联合用药，降低血栓同时维持机体正常运行的药物，具有十分重要的临床意义。

天然植物多糖是指由10个及以上的单糖组成的一类天然高分子多聚糖。据报道，多糖具有广泛的药理作用，如增强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、保护胃肠功能等活性。陈皮为芸香科植物橘属(Citrus reticulata Blanco)，已被证实具有多种药效作用。但是多糖作为陈皮中的主要成分，其缓解血栓形成的研究尚未见相关报道。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种陈皮多糖及其制备方法和应用，该陈皮多糖具有良好的抗血栓效果，尤其能够有效抑制由普纳替尼引起的血栓形成，可用于普纳替尼的辅助治疗。

本发明的第一方面，提供一种陈皮多糖，按质量比计，所述陈皮多糖中的单糖组成为：鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：半乳糖醛酸＝(2.5～3.5)：(16.0～17.5)：(12.5～14.5)：(1.5～2)：(60～70)。

根据本发明的一些优选的实施例，按质量比计，所述陈皮多糖中的单糖组成为：鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：半乳糖醛酸＝(2.5～3.0)：(16.5～17.0)：(13.5～14.0)：(1.5～2.0)：(64.0～65.0)。

根据本发明的一些更优选的实施例，按质量比计，所述陈皮多糖中的单糖组成为：鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：半乳糖醛酸＝2.9：16.8：13.7：1.9：64.7。

根据本发明的一些实施例，所述陈皮多糖的糖苷键由Araf-(1→，Arap-(1→，→3)-Araf-(1→，→5)-Araf-(1→，Galp-(1→，→3,5)-Araf-(1→，→4)-Galp-(1→，→4)-Glcp-(1→，→3)-Galp-(1→，→6-Glcp-(1→，→6)-Galp-(1→，→4,6)-Galp-(1→，→3,6)-Galp-(1→组成。

根据本发明的一些实施例，所述Araf-(1→，Arap-(1→，→3)-Araf-(1→，→5)-Araf-(1→，Galp-(1→，→3,5)-Araf-(1→，→4)-Galp-(1→，→4)-Glcp-(1→，→3)-Galp-(1→，→6-Glcp-(1→，→6)-Galp-(1→，→4,6)-Galp-(1→，→3,6)-Galp-(1→的摩尔比为：0.252：0.032：0.019：0.339：0.011：0.164：0.045：0.010：0.022：0.022：0.015：0.011：0.057。

根据本发明的一些实施例，所述陈皮多糖的重均分子量(Mw)为95000～100000。

根据本发明的一些优选的实施例，所述陈皮多糖的重均分子量为98001。

根据本发明的一些实施例，所述陈皮多糖的数均分子量(Mn)为60000～70000。

根据本发明的一些优选的实施例，所述陈皮多糖的数均分子量为60000～65000。

根据本发明的一些更优选的实施例，所述陈皮多糖的数均分子量为63104。

根据本发明的一些实施例，所述陈皮多糖的最高峰分子量(Mp)70000～80000。

根据本发明的一些优选的实施例，所述陈皮多糖的最高峰分子量75000～80000。

根据本发明的一些优选的实施例，所述陈皮多糖的最高峰分子量76280。

本发明的第二方面，提供上述陈皮多糖的制备方法，包括以下步骤：

取陈皮样品，经脱脂、水提、醇沉、脱色、Sevag试剂除蛋白、透析，得到陈皮多糖。

根据本发明的一些实施例，所述陈皮样品为五年份干制陈皮。

根据本发明的一些实施例，所述陈皮样品为粒度不粗于60目的陈皮粉。

根据本发明的一些实施例，所述脱脂使用无水乙醇。

根据本发明的一些优选的实施例，陈皮样品与无水乙醇的固液比为1g：8～12mL，优选1g：10mL。

根据本发明的一些优选的实施例，采用加热回流的方式进行脱脂。进一步地，所述加热的温度为70～90℃，所述回流的时间为1～2h，所述加热回流步骤重复2～3次。

根据本发明的一些实施例，所述水提步骤中，脱脂后的陈皮样品与水的固液比为1g：8～12mL，优选1g：10mL。

根据本发明的一些实施例，采用水浴回流的方式进行水提。进一步地，所述水浴的温度为90～110℃，所述回流的时间为5～7h。

根据本发明的一些实施例，所述水提包括用水浸提后，进行抽滤，将所得滤液进行离心。进一步地，所述抽滤采用0.45μm滤纸，所述离心的转速为6000～10000r/min，所述离心的时间为20～40min。

根据本发明的一些实施例，所述醇沉使用质量分数95％及以上的乙醇，优选质量分数95％的乙醇水溶液。

根据本发明的一些实施例，所述醇沉步骤中，水提液与乙醇的体积比为1：3～5，优选1：4。

根据本发明的一些实施例，所述醇沉的温度为0～4℃，醇沉的时间为8～12h。

根据本发明的一些实施例，所述醇沉步骤还包括：分别用乙醚和丙酮洗涤醇沉所得沉淀。

进一步地，所述乙醚和丙酮可分别洗涤沉淀，也可以混合液形式洗涤沉淀；优选将所述乙醚和丙酮按先后顺序分别洗涤沉淀。

根据本发明的一些实施例，所述脱色包括以下步骤：

向醇沉所得沉淀的水溶液中加入活性炭，搅拌，脱色，得脱色液。

根据本发明的一些优选的实施例，所述沉淀与活性炭的质量比为1:1～3，优选1:2。

根据本发明的一些优选的实施例，所述搅拌的时间为1～3h。

根据本发明的一些优选的实施例，所述脱色的温度为0～4℃，脱色的时间为8～12h。

根据本发明的一些优选的实施例，所述脱色液为混合体系离心后的上清。进一步地，所述离心的转速为6000～10000r/min，所述离心的时间为20～40min。

根据本发明的一些实施例，所述Sevag试剂为氯仿和正丁醇按体积比4:1搭配的混合溶液。

根据本发明的一些实施例，所述脱色液与Sevag试剂的体积比为4～6:1，优选5:1。

根据本发明的一些实施例，所述透析采用截留分子量为8000～14000Da的透析袋进行。

根据本发明的一些实施例，所述透析的时间为2～4d。

本发明的第三方面，提供上述陈皮多糖在制备抗血栓药物中的应用。

根据本发明的一些实施例，所述抗血栓药物为抑制普纳替尼引起的血栓形成的药物。

根据本发明的一些实施例，所述陈皮多糖在斑马鱼上的用量为1～1000μg/mL。

斑马鱼(Daninorero，zebrafish)可作为研究肝脏、血液及免疫等疾病的一种有效的模式生物，其基因与人类基因同源性达82％，具有全身透明、个体小以及发育繁殖快的特点。与大鼠模型造模方式为皮下注射盐酸肾上腺素后冰泳造成急性血瘀不同，利用斑马鱼进行疾病研究，经幼鱼整体邻联茴香胺染色即可直接观察，具有操作简单、实验周期短、试验成本低、可重复性强等优势。

本发明的第四方面，提供上述陈皮多糖联合普纳替尼在制备酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

有益效果：

本发明从陈皮中提取分离得到了一种多糖成分，通过低剂量的普纳替尼构建斑马鱼血栓模型，验证了提取得到的陈皮多糖能够有效缓解由普纳替尼引起的血栓副作用，对于开发普纳替尼的辅助用药具有一定的价值。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是陈皮多糖的高效液相色谱图；

图2是陈皮多糖中单糖组分的高效液相色谱图；其中，A为单糖标准品的色谱图；B为陈皮多糖水解样品的色谱图；

图3是GCMS色谱图；

图4是不同等级血栓图；

图5是不同浓度普纳替尼引起的斑马鱼尾部血栓形成图；

图6是不同浓度陈皮多糖对血栓的缓解效果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明采用陈皮样品原产地为江门市新会区，由新宝堂公司提供。

本发明所用葡聚糖标准品购于西格玛。

实施例1、陈皮多糖的制备

具体步骤包括：

(1)制粉：

选择五年份干制陈皮，烘干后经粉碎机粉碎成粉，过40目筛网后收集，在干燥环境常温中保存。

(2)脱脂：

将步骤(1)制得的陈皮粉以料液比1g：10mL加入无水乙醇进行脱脂处理，设置处理条件为80℃条件下加热回流1.5h，重复两次。脱脂后收集滤渣烘干备用。

(3)水提：

取步骤(2)制得的滤渣以料液比1g：10mL加入纯水，浸提条件设置为100℃，水浴回流6h。浸提液使用布氏漏斗，用0.45μm滤纸进行抽滤，滤液后以8000r/min离心30min，收集上清液。

(4)醇沉：

将步骤(3)制得的上清液与4倍体积的95wt％乙醇进行混合，在4℃冰箱中过夜醇沉后进行过滤并保留沉淀，将沉淀物进行烘干得到陈皮粗多糖粉。

(5)脱色：

将步骤(4)得到多糖粉分别用乙醚和丙酮进行洗涤，过滤沉淀后挥干有机溶剂，以1:100的质量比将沉淀溶解于纯水中，以质量比为1:2加入活性炭搅拌2h后置于4℃冰箱静置过夜进行脱色处理。将混合液以8000r/min离心30min，收集脱色液。

(6)除蛋白：

将步骤(5)制备的上清液进行除蛋白处理。以体积比4:1将氯仿和正丁醇溶液混合制备Sevag试剂。脱色液与Sevag试剂以体积比5:1混合于分液漏斗中，充分振荡10-15min，静置分层后弃去下层变性蛋白沉淀，重复操作直至无变性蛋白形成。收集上层粗多糖溶液。

(7)透析、冻干：

将步骤(6)脱蛋白的粗多糖溶液用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析3天，收集透析液经冷冻干燥机冻干即得到陈皮多糖。

实施例2、陈皮多糖分子量及纯度测定

2.1试剂及样品的制备

精确称取适量氯化钠溶解于超纯水中配制0.05mol/L NaCl溶液，超声辅助溶解10min，用0.45μm微孔滤膜过滤备用。精确称取样品和标准品，样品配制成5mg/mL溶液，经12000rpm离心10min，收集上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8mL进样小瓶中。

2.2测样条件

采用Shimadzu高效液相色谱仪(配RI-10A示差检测器)；

色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；

流动相：0.05mol/L NaCl溶液；

流速：0.6mL/min；

柱温：40℃；

进样量：20μL。

分子量校正曲线所用葡聚糖标准品：Mw667800、Mw409800、Mw273000、Mw148000、Mw80900、Mw48600、Mw23800、Mw11600、Mw5000。

实验结果如图1所示，只出现一个产物峰，和一个流动相的色谱峰，无其他杂峰出现，且产物峰形状对称，表明产物均一，纯度高。

分子量结果如表1所示。

表1陈皮多糖分子量分析结果

RT(min)	lgMp	lgMw	lgMn	Mp	Mw	Mn	峰面积比％
								37.451	4.9	5.0	4.8	76280	98001	63104	100

实施例3、单糖组分分析

精确称取5mg样品置于安瓿瓶中，加入2mL 3mol/L三氟乙酸，在120℃条件下水解3h，水解溶液转移至管中氮气吹干，加入5mL去离子水涡旋混匀。吸取50μL溶液加入950μL去离子水，于12000rpm/min离心5min，取上清液进行离子色谱分析。

色谱条件如下：

色谱柱：Dionex^TM Carbopac^TM PA20(3×150mm)；

流动相：A:H₂O；B:15mM NaOH；C:15mM NaOH和100mM NaOAC；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

柱温：30℃；

检测器：电化学检测器。

通过高效液相分析可知，陈皮多糖中单糖组分主要为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸。单糖标准和陈皮多糖水解样品的色谱图如图2所示，陈皮多糖水解样品中单糖种类及含量如表2所示。

表2陈皮多糖中单糖含量分析结果

单糖类型	鼠李糖	阿拉伯糖	半乳糖	葡萄糖	半乳糖醛酸
						RT	11.5	12.075	15.034	17.025	45.242
M ratio	0.029	0.168	0.137	0.019	0.647

实施例4、陈皮多糖连接方式检测

4.1试剂及方法

4.1.1试剂

4.1.2甲基化方法

样品经甲基化、水解、乙酰化后，经GC-MS测定并与标准质谱图库进行比对。

称量多糖样品(2-3mg)置于玻璃反应瓶中，加入1mL无水DMSO，快速加入甲基化试剂A液，封闭，在超声作用下溶解，再加入甲基化试剂B液。在磁力搅拌水浴30℃反应60min反应。最后将2mL超纯水加入到上述混合物中终止甲基化反应。

取甲基化后的多糖，加入1mL的2M三氟乙酸(TFA)水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2mL双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101度烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却。然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL CH₂Cl₂溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。CH₂Cl₂层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，放入液相小瓶。分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；

4.1.3测样条件

GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m×0.25mm×0.25um；

程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；

进样口温度为250℃；

检测器温度为250℃/min；

载气为氦气，流速为1mL/min。

4.2结果

样品甲基化结果分析如表3所示。GCMS色谱图如图3所示。

表3甲基化结果分析

实施例5、陈皮多糖对普纳替尼诱导的斑马鱼血栓的影响

5.1普纳替尼诱导斑马鱼尾部形成血栓

(1)挑选3月龄的成年斑马鱼在产卵前一天晚将雌雄鱼按1：1或1:2的比例配对到交配盒中，次日收集胚胎后用养殖水冲洗鱼卵后挑出未受精的卵和粪便等杂质，然后置于胚胎培养缸中，放入恒温培养箱进行孵化。

(2)普纳替尼DMSO溶解配制成浓度为1μmol/L的储备液，用养殖水稀释成1nmol/L、3nmol/L、10nmol/L、30nmol/L四个浓度梯度，保持DMSO的含量为1％的体积分数，溶剂对照为1％二甲基亚砜(DMSO)溶液。

(3)邻联茴香胺染液配比：6mmol/L邻联茴香胺溶液(溶于无水乙醇)、pH 4.5的醋酸钠溶液、纯净水以及30％H₂O₂按体积比为20:5:20:1的比例混合。其中30％H₂O₂指体积浓度为30％的过氧化氢水溶液。

(4)取受精后2天的发育正常的幼鱼，随机分配在12孔板中，每孔10条，每孔加入相应浓度的溶液4mL，设置3个平行组。

(5)在恒温培养箱中处理72h，环境条件为温度28.5℃，明暗周期为14h/10h。72h后将幼鱼收集到1.5mL离心管中，每管10条，弃去所有水分。

(6)每管离心管加入0.5mL的染液，在黑暗中染色1min。

(7)弃去染液，用纯净水洗涤1-2次后每管加入1mL 4％多聚甲醛，在4℃的条件下固定过夜。

(8)将斑马鱼置于琼脂板上，在体式显微镜下观察斑马鱼染色情况并用拍照软件Mshot Image进行记录保存。

(9)对斑马鱼尾部血管染色面积进行记录分级，斑马鱼尾部血管红细胞聚集面积作为血栓发生程度的指标。

(10)数据统计分析

采用GraphPad Prism 9.0统计软件对染色数据进行统计分析，所有数据均以均值±标准差表示。多组间的统计学分析采用单因素方差分析和多因素方差分析，当P<0.05时考虑差异有统计学意义。

5.2陈皮多糖治疗普纳替尼诱导的血栓

(1)挑选3月龄的成年斑马鱼在产卵前一天晚上将雌雄鱼按1：1或1:2的比例配对到交配盒中，次日收集胚胎后用养殖水冲洗鱼卵后挑出未受精的卵和粪便等杂质，然后置于胚胎培养缸中，放入恒温培养箱进行孵化。

(2)普纳替尼用DMSO溶解配制成1μmol/L的储备液，然后用养殖水稀释成浓度为3nmol/L的溶液，阿司匹林用DMSO溶解为10mg/mL的母液，再用养殖水稀释成浓度为100μg/mL的溶液，保持DMSO的含量为1％的体积分数，溶剂对照为1％DMSO溶液。五年份陈皮多糖用养殖水分别稀释为5mg/mL的母液备用。

(3)邻联茴香胺染液配比：6mmol/L邻联茴香胺溶液(溶于无水乙醇)、pH 4.5的醋酸钠溶液、纯净水以及30％H₂O₂按体积比为20:5:20:1的比例混合。

(4)取受精后2天的发育正常的幼鱼，随机分配在24孔板中，每孔8条，空白对照组每孔加入2mL含1％DMSO的养殖水；模型组每孔加入2mL浓度为3nmol/L的普纳替尼溶液；阳性药组每孔加入1mL普纳替尼溶液和1mL阿司匹林溶液使普纳替尼终浓度为3nmol/L，阿司匹林终浓度为50μg/mL；实验组每孔加入1mL普纳替尼溶液及对应浓度的陈皮多糖水溶液使普纳替尼终浓度为3nmol/L，陈皮多糖终浓度分别为0.01、0.1、1mg/mL，设置4个平行组。

(5)在恒温培养箱中处理72h，环境条件为温度28.5℃，明暗周期为14h/10h。72h后将幼鱼收集到1.5mL离心管中，每管10条，弃去所有水分。

(6)每管离心管加入0.5mL的染液，在黑暗中染色1min。

(7)弃去染液，用纯净水洗涤1-2次后每管加入1mL 4％多聚甲醛，在4℃的条件下固定过夜。

(8)将斑马鱼置于琼脂板上，在体式显微镜下观察斑马鱼染色情况并用拍照软件Mshot Image进行记录保存。

(9)对斑马鱼尾部血管染色面积进行定量分级，斑马鱼尾部血管红细胞聚集面积作为血栓发生程度的指标。

(10)数据统计分析

采用GraphPad Prism 9.0统计软件对染色数据进行统计分析，所有数据均以均值±标准差表示。多组间的统计学分析采用单因素方差分析和多因素方差分析，当P<0.05时考虑差异有统计学意义。

5.3实验结果分析

(1)普纳替尼引起斑马鱼尾部血栓形成

血栓颜色的差异是一个连续谱，而非定值，此为正常的个体差异，因此有必要对正常还是病变进行定义与区分。血栓形成严重程度的分级结果如图4及图5所示，按斑马鱼尾部血栓程度将每组中的样本分为：正常、轻度、重度三个等级，作为判断血栓形成程度的依据。

其中，“正常”组的特征是斑马鱼尾部经染色后观察到无明显大面积红细胞聚集，红细胞呈零散分布状态，提示无血栓形成，此时为正常状态。“轻度”组的特征为斑马鱼尾部经染色后观察到有小面积且分段红细胞的聚集，提示已经有血栓形成。“重度”组的特征为斑马鱼尾部经染色后观察到有大面积且不分段红细胞的聚集，提示已经形成严重血栓。

当普纳替尼溶液浓度为3nmol/L时，血栓程度为“重度”及“轻度”的样本占全部样本比例比其他两组高，提示在浓度3nmol/L的普纳替尼诱导斑马鱼尾部形成血栓的效果最佳。超过3nM尾部作用变弱是由于普纳替尼作用过于强烈，血细胞于心脏淤堵不能全身游移。首先，心脏血细胞淤堵不容易进行定量分析，需要借助切片等辅助手段；其次，在临床使用中，普纳替尼的浓度不会过高从而导致不可逆的损伤，所以监测更高浓度剂量意义不大。因此本发明选择了中间浓度3nM作为阳性对照。

(2)陈皮多糖缓解斑马鱼幼鱼尾部血栓形成

用不同浓度陈皮多糖探究其对斑马鱼幼鱼尾部血栓的缓解效果。结果如图6所示，当单独暴露于普纳替尼后，幼鱼尾部出现明显血栓，其中，形成“重度”血栓的样本占全部样本比例明显比空白组高，表明用普纳替尼成功诱导血栓模型。

采用50μg/mL的阿司匹林与普纳替尼共处理后，幼鱼尾部血栓形成情况得到改善，但是仍形成“重度”血栓的样本。

采用不同浓度陈皮多糖与普纳替尼共处理后，幼鱼尾部血栓形成情况得到明显改善，样本中无“重度”血栓形成，“轻度”血栓样本数量也随陈皮多糖浓度增加而减少，说明陈皮多糖可逆转由普纳替尼诱导引起的斑马鱼幼鱼尾部血栓，尤其是可逆转普纳替尼引起的“重度”血栓(有可能逆转为“轻度”或“正常”)，且该作用具有剂量依赖性趋势。

综上，陈皮多糖能有效缓解斑马鱼幼体尾部血栓，可用于后续抗血栓药物的研发，有望作为潜在的治疗血栓的天然药物。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种陈皮多糖，其特征在于，按质量比计，所述陈皮多糖中的单糖组成为：鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：半乳糖醛酸＝(2.5～3.5)：(16.0～17.5)：(12.5～14.5)：(1.5～2)：(60～70)。

2.根据权利要求1所述的陈皮多糖，其特征在于，所述陈皮多糖的重均分子量为95000～100000；

和/或，所述陈皮多糖的数均分子量为60000～70000；

和/或，所述陈皮多糖的最高峰分子量70000～80000。

3.如权利要求1或2所述的陈皮多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取陈皮样品，经脱脂、水提、醇沉、脱色、Sevag试剂除蛋白、透析，得到陈皮多糖。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述透析采用截留分子量为8000～14000Da的透析袋进行。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Sevag试剂为氯仿和正丁醇按体积比4:1搭配的混合溶液。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述醇沉使用质量分数95％及以上的乙醇。

7.如权利要求1或2所述的陈皮多糖在制备抗血栓药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗血栓药物为抑制普纳替尼引起的血栓形成的药物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述陈皮多糖在斑马鱼上的用量为1～1000μg/mL。

10.如权利要求1或2所述的陈皮多糖联合普纳替尼在制备酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

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