CN115894695A - 重组scca单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组SCCA单克隆抗体及其制备方法和应用，其中重组SCCA单克隆抗体包括由抗SCCA的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗SCCA的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。本发明制备的重组SCCA单克隆抗体蛋白质和基因结构明确，稳定性好，可重复表达。将制备的重组SCCA单克隆抗体应用于检测鳞状细胞癌抗原试剂盒中，临床检测灵敏度高，检测时通过对雅培样本的检测，结果发现本发明重组SCCA单克隆抗体用于试剂盒检测时的检测结果与雅培临床结果相符，与雅培试剂相比无显著差异，因此，本发明制备的重组SCCA单克隆抗体可以用于临床对血清SCCA含量的血清学检测。

Description

重组SCCA单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种重组SCCA单克隆抗体，本发明还涉及该单抗的制备方法和应用。

背景技术

鳞状细胞癌抗原（SCCA/SCCAg）是肿瘤相关抗原TA-4（Tumor Associated-Antigen4）的亚片段，最早由Kato等人从子宫颈鳞状细胞肿瘤组织中提取出来。SCCA表达量升高会使癌细胞抑制细胞凋亡，从而使机体内的几种细胞对自杀机制产生抵抗性。其中SCCA 1型主要在肿瘤组织细胞内部，其主要是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白激酶（catL、S 和K）的抑制物，通过抑制作用可以促使癌细胞对机体内的几种细胞自杀机制产生抵抗作用，从而增强肿瘤细胞抵抗细胞程序性凋亡的能力。SCCA 2型释放于循环系统中，其主要是糜蛋白酶样蛋白激酶（catG）的抑制物，通过抑制作用可抵抗catG介导的炎症反应，从而保护肿瘤细胞免受降解。

SCCA作为鳞癌肿瘤标志物，具有较好的特异性，对于子宫颈癌、肺癌（非小细胞肺癌）等鳞状上皮细胞起源的癌症具有辅助诊断的意义。早期研究表明，患有宫颈鳞状细胞癌的妇女血清中的SCCA水平要高于健康人群的水平。同时其它相关研究也表明，血清中的SCCA水平可以指示患有宫颈鳞状细胞癌的妇女体内病灶的扩张，所以SCCA水平可有助于早期诊断、检测复发和疾病状态监测，对于其他类型的鳞状细胞癌（口腔、食道、舌、头颈等），SCCA也具有一定的辅助诊断价值。但该标志物的检测主要用于对恶性肿瘤患者病情的动态监测，不宜用于早期诊断或普通人群筛查等目的。

抗体是生物科学领域的主力，长期以来，鼠源性的单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗，但是由于鼠源性的mAb会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，从而限制了其在临床方面的应用。因此，对鼠源性抗体特别是SCCA单克隆抗体进行改造使其安全应用在临床中是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组SCCA单克隆抗体。

本发明还提供了上述重组SCCA单克隆抗体的制备方法。

本发明还提供重组SCCA单克隆抗体在制备检测鳞状细胞癌抗原试纸或试剂盒方面的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的重组SCCA单克隆抗体，包括由抗SCCA的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗SCCA的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。

当所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列时，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列；

当所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列时，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.6 所示的氨基酸序列。

本发明还提供了上述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

第一步，用免疫原制备杂交瘤细胞株并从其中提取RNA，反转录获得cDNA；

第二步，设计引物，以cDNA为模板，扩增含有SEQ ID NO.1/ SEQ ID NO.5的轻链可变区和含有SEQ ID NO.2/ SEQ ID NO.6的重链可变区的编码基因；

第三步，将带信号肽与轻链恒定区的表达载体和信号肽与重链恒定区的表达载体，分别进行双酶切；分别与目的轻链基因和目的重链基因采用同源重组的构建方法进程重组构建，构建成功的质粒转入感受态细胞，挑选阳性克隆测序；将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒；

第四步，将携带重链和轻链基因的质粒共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO-S细胞，4-5天收集培养细胞上清进行蛋白纯化，得到重组SCCA单克隆抗体。

当扩增含有SEQ ID NO.1的轻链可变区和含有SEQ ID NO.2的重链可变区的编码基因时，分别构建含有如 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有 SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列的表达载体含有人 IgG1 的重链恒定区的表达基因。

同样的，当扩增含有SEQ ID NO.5的轻链可变区和含有SEQ ID NO.6的重链可变区的编码基因时，分别构建含有如 SEQ ID NO.7 和 SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID NO.7 所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有 SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列的表达载体含有人 IgG1 的重链恒定区的表达基因。

在本发明所述的重组SCCA单克隆抗体的制备方法中，第一步的杂交瘤细胞株的具体制备方法如下：

第一步，采用重组抗原或浓缩后的人源汗液作为免疫原，首先将免疫原稀释成一定浓度后与弗氏完全佐剂或不完全佐剂进行乳化，对小鼠进行基础免疫、加强免疫和融合前冲击免疫；

第二步，采用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；

第三步，选取血清效价高于1:8000的鼠脾脏细胞，与骨髓瘤细胞进行体外融合，经过多次亚克隆即可获得稳定分泌抗SCCA的杂交瘤细胞株。

本发明还提供了一种用于检测鳞状细胞癌抗原的试纸，所述试纸是以上述重组SCCA单克隆抗体可作为检测试剂。

本发明还提供了一种用于检测检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，所述试剂盒包括上述的试纸或上述的重组SCCA单克隆抗体。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明制备的重组SCCA单克隆抗体蛋白质和基因结构明确，稳定性好，可重复表达。将制备的重组SCCA单克隆抗体应用于检测鳞状细胞癌抗原试剂盒中，临床检测灵敏度高，检测时通过对雅培样本的检测，结果发现本发明重组SCCA单克隆抗体用于试剂盒检测时的检测结果与雅培临床结果相符，与雅培试剂相比无显著差异，因此，本发明制备的重组SCCA单克隆抗体可以用于临床对血清SCCA含量的血清学检测。

附图说明

图1是小鼠脾脏细胞和NS1融合的杂交瘤细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳。

图2是重组单克隆抗体可变区基因扩增产物电泳图。

图3是PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因。

图3中：泳道2-4为实施案例2中PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因重链的测序图；泳道8-10为实施案例2中PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因轻链的测序图；泳道5-7为实施案例3中PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因重链的测序图；泳道11-13为实施案例3中PCR筛选扩增单克隆重组抗体基因轻链的测序图。

图4是真核表达并纯化的重组单克隆抗体的SDS-PAGE检测结果。

图中：图4中左图是实施例2中重组SCCA抗体的SDS-PAGE检测结果，图4中右图是实施例3中重组SCCA-2抗体的SDS-PAGE检测结果。

图5是本发明实施例4试剂盒对质控品和临床样本的灵敏度。

图6是本发明实施例4中试剂盒和雅培试剂的相关性图（线性0.7-59.3ng/ml）。

图7是本发明实施例4中试剂盒和雅培试剂的相关性图（线性0.7-5.0ng/ml）。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的检测试剂和检测仪器均为本领域市售产品，所用的检测方法也为本领域常规方法。

实施例1 小鼠免疫及抗血清滴度检测

S1、将SCCA抗原序列构建到PET-32a表达载体，并引入GST标签，通过大肠杆菌诱导表达获得SCCA重组抗原（Gene ID:6317）；将SCCA重组抗原纯化后作为免疫抗原，免疫BalB/C小鼠（3次），具体免疫内容如下：

第一次免疫后21天进行第二次免疫，第三次免疫与第二次免疫相差21天。其中，首次免疫采用皮下+腹腔注射，第一次取100ug免疫抗原与等体积弗氏完全佐剂乳化充分后免疫，后两次取50ug免疫抗原与等体积弗氏不完全佐剂乳化充分后免疫（进行腹腔注射）。第三次免疫后于第10天尾静脉取血，37℃静置放置1h后于6000 r/min离心10min，收集上清(抗血清)进行ELISA检测免疫效果。效价不低于1:8000即满足融合要求，融合前3天进行腹腔冲击免疫，50ug/只。

S2、抗血清滴度检测

将SCCA重组抗原用1%Triton处理后加入0.05mol/L CB（pH 9.6）中，以1μg/ml的浓度固相包被，50μl/孔，4℃过夜；PBST洗涤2次，拍干，加入Casein封闭液，100μl/孔，37℃封闭2h；试验血清从1:200开始倍比稀释，50μl/孔，同时设未免疫的BalB/C阴性血清对照，37℃温箱温育30 min；PBST洗涤5次，拍干，加入工作浓度的羊抗鼠酶结合物，50μl／孔，37℃温箱温育30 min；PBST洗涤5次，拍干，加入显色底物A、B液，各50μl／孔，反应10 min，酶标仪测定信号值。测试结果如表1所示。

表1 抗血清滴度检测

由上表可知，效价均超过1:8000，达到融合要求，进行最后一次的加强免疫，三天后处死动物，进行细胞融合和克隆筛选。

实施例2 重组SCCA单克隆抗体构建表达1

 1、杂交瘤细胞RNA提取及反转录

用实施例1得到的SCCA重组抗原免疫BalB/C小鼠，获得小鼠脾脏细胞，将小鼠脾脏细胞与NS1通过PEG融合获得杂交瘤细胞，Trizol法提取杂交瘤细胞RNA，经琼脂糖凝胶电泳可见清晰的28S和18S条带（见图1），说明RNA完整性较好。RNA浓度和纯度测定结果为D(260nm)/D(280nm)＝1.85，可以满足本实验要求。以RNA为模板反转录合成cDNA。

2、重组SCCA单克隆抗体可变区PCR扩增

以cDNA为模板，以SEQ ID NO.9-12所示的核苷酸序列为引物，用TaqDNA酶分别扩增单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因。其中：

SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列为轻链上游引物，SEQ ID NO.9的序列具体为：CTGCCTGGCCGGGAGAGCGCTCGCAGACATCAAGATGACCCAGTCTC；

SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为轻链下游引物，具体为：

AGATGGTGCAGCCACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCAG；

SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列为重链上游引物，具体为：CTGCCTGGCCGGGAGAGCGCTCGCAGAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAC；

SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列为重链下游引物，具体为：GAAGACCGATGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTC

扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示（即图2中左图）：VH(重链可变区)基因片段长度约为350bp，轻链可变区基因片段长度约为340bp，与目的片段长度一致。

3、重组质粒构建

重链表达载体Sig-GFc-PCMV经HindⅢ和NheⅠ双酶切（该载体含有人IgG1的重链恒定区的表达基因），与重链可变区基因进行同源重组；轻链表达载体Sig-LFc-PCMV3经HindⅢ和BsiWI双酶切（该载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因），与轻链可变区进行同源重组；构建表达轻链与重链的重组质粒；重组后的质粒转入感受态细胞后，随机挑取单克隆进行菌体PCR扩增检测并测序，测序结果如图3所示。在图3中，泳道2，3，4为重组的重链表达质粒；泳道8,9,10重组的轻链表达质粒（引物使用的是载体骨架区通用引物扩增），结果显示这些克隆均含有目的基因，表明重组质粒构建成功率高。

4、重组单克隆抗体表达纯化

将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒，将携带重链和轻链基因的质粒共转染哺乳动物细胞293F细胞或CHO-S细胞，4-5天收集培养细胞上清进行蛋白纯化，得到当轻链可变区含有如SEQ ID NO.1所示，重链可变区含有如SEQ ID NO.2 所示的重组SCCA单克隆抗体1，收集的蛋白合并后SDS-PAGE检测，结果如图4中的左图。

从图4可知，说明纯化后的抗体纯度高。

实施例3 重组SCCA单克隆抗体构建表达2

S1，小鼠免疫及抗血清滴度检测

本步骤与实施例1的不同之处在于：本实施例收集人体汗液经透析浓缩后免疫BalB/C小鼠（3次）：免疫时间间隔同实施例1，免疫剂量100ug/只，免疫位置同实施例1。第三次免疫后于第10天尾静脉取血，37℃静置放置1 h后于6000 r/min离心10min，收集上清(抗血清)进行ELISA检测免疫效果。效价达到融合要求，融合前3天进行腹腔冲击免疫，50ug/只。

表2 抗血清滴度检测

由上表可知，效价均超过1:8000，达到融合要求，进行最后一次的加强免疫，三天后处死动物，进行细胞融合和克隆筛选。

S2，杂交瘤细胞RNA提取及反转录，同实施例2；

S3，重组SCCA单克隆抗体可变区PCR扩增：以cDNA为模板，以SEQ ID NO.13-16所示的核苷酸序列为引物，用TaqDNA酶分别扩增单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因。其中：

SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列为轻链上游引物，具体为：CTGCCTGGCCGGGAGAGCGCTCGCACGACGATTGGATACAGTTGGTGC；

SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为轻链下游引物，具体为：AGATGGTGCAGCCACCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAAC；

SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列为重链上游引物，具体为：CTGCCTGGCCGGGAGAGCGCTCGCAGAGGTGAAGCTTCAGGAGTCAG；

SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列为重链下游引物，具体为：GAAGACCGATGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTG。

扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示（即图2中右图）：VH(重链可变区)基因片段长度约为350bp，轻链可变区基因片段长度约为340bp，与目的片段长度一致。

S4，按实施例2中的步骤进行重组质粒构建。

本实施例中构建的重链表达载体为含有 SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列的表达载体，且该表达载体中含有人 IgG1 的重链恒定区的表达基因；本实施例构建的轻链表达载体为含有如 SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的表达载体，且该表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因。

随机挑取单克隆进行菌体PCR扩增检测并测序，图3中的泳道5-7为重组的重链表达质粒；泳道11-13重组的轻链表达质粒（引物使用的是载体骨架区通用引物扩增），结果显示这些克隆均含有目的基因，表明重组质粒构建成功率高。

S5，按实施例2中的重组单克隆抗体表达纯化步骤进行纯化

在本实施例中，纯化得到的是轻链可变区含有如SEQ ID NO.5所示，重链可变区含有如SEQ ID NO.6所示的重组SCCA单克隆抗体2，收集的蛋白合并后SDS-PAGE检测，结果如图4中右图所示，图4右图显示纯化后的抗体纯度高。

实施例4

将实施例2制备的重组SCCA单克隆抗体1和实施例3制备的重组SCCA单克隆抗体2用于检测鳞状细胞癌抗原试剂盒，该试剂盒采用双抗夹心法检测鳞状细胞癌抗原，具体包括鳞状细胞癌抗原校准品、质控品、包被有重组SCCA单克隆抗体1的磁珠混悬液和包被有重组SCCA单克隆抗体2的酶标记物2。

1、最低检测限

 准备5份浓度范围为1-4倍LoB的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据，按照EP17的方法进行数据检验和结果分析，计算LoD。如果日常工作中使用非真实临床样本的质控品标本（如0校准品稀释液稀释阳性制备LoD质控品），则需要同时建立质控品标本的LoD（方法同上）。取两种做法中浓度值较大的结果作为本批次的LoD，3批试剂盒取浓度值最大的LoD结果作为本试剂盒宣称的LoD。结果见表3和表4。

表3 真实临床血清/血浆标本评估试剂盒LoD

表4 质控品标本评估试剂盒LoD

按照EP17-A的计算方法（采用软件MVS计算），3批试剂盒临床标本的LoD分别为：0.21ng/ml、0.19ng/ml、0.20ng/ml；3批试剂盒质控品标本的LoD分别为：0.15ng/ml、0.19ng/ml、0.18ng/ml。本试剂盒小试阶段得到的LoD为：0.21ng/ml。

2、功能灵敏度

采用LoD实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、SD和CV%，最接近20%的浓度为功能灵敏度；两种考核样本、3批试剂盒分别计算，取浓度值最大的为本项目功能灵敏度（FS）。根据样本浓度和CV%，分别对两种基质进行考核，其结果见图5。

由图5可以看出，当CV=20%时，3批试剂盒临床标本的FS分别为：0.15ng/ml、0.20ng/ml、0.18ng/ml；3批试剂盒质控品标本的FS分别为：0.20ng/ml、0.25ng/ml、0.15ng/ml；本试剂盒小试阶段得到的FS为：0.25ng/ml。

3、临床符合率

临床考核590例样本，本发明试剂与雅培的阳性符合率95.12%，阴性符合率91.09%，总符合率93.74%。具体分析结果见表5。

表5 阴阳符合率统计表

4、临床相关性

临床考核591例样本(剔除一份高值超线性稀释样本，剩余590份样本)，在0.7-59.3ng/ml范围内，临床相关性如图6所示。

由于本实验参考值为1.5ng/ml，因此，低值区的相关性更值得关注，在0.7-5.0ng/ml范围内，考核样本471例，临床相关性如图7所示：图中显示，在低值区0.7-5.0ng/ml范围内，改进试剂与雅培的临床相关性（R²=0.92076）较好。

通过特异性检测发现，E01医院雅培定值血清271例，在1.3-66.8ng/ml范围内，与雅培临床相关性y=0.8681x+0.4262，R²=0.9903，阳性符合率99.26%，阴性符合率为100%，总符合率为99.26%；A13医院雅培定值血浆140份，在1.2-42.4ng/范围内，与雅培临床相关性为y=1.129x-0.5051，R²=0.9933，阳性符合率100%，阴性符合率为87.765，总符合率为91.43%。

通过对雅培样本的检测，结果发现本发明重组SCCA单克隆抗体用于试剂盒检测时的检测结果与雅培临床结果相符，与雅培试剂相比无显著差异，因此，本发明制备的重组SCCA单克隆抗体可以用于临床对血清SCCA含量的血清学检测。

Claims (9)

1.一种重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：包括由抗SCCA的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗SCCA的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。

2.根据权利要求1所述的重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的重组SCCA单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.6 所示的氨基酸序列。

4.权利要求2或3所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，用免疫原制备杂交瘤细胞株并从其中提取RNA，反转录获得cDNA；

第二步，设计引物，以cDNA为模板，扩增含有SEQ ID NO.1/ SEQ ID NO.5的轻链可变区和含有SEQ ID NO.2/ SEQ ID NO.6的重链可变区的编码基因；

第三步，将带信号肽与轻链恒定区的表达载体和信号肽与重链恒定区的表达载体，分别进行双酶切；分别与目的轻链基因和目的重链基因采用同源重组的构建方法进程重组构建，构建成功的质粒转入感受态细胞，挑选阳性克隆测序；将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒；

第四步，将携带重链和轻链基因的质粒共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO-S细胞，4-5天收集培养细胞上清进行蛋白纯化，得到重组SCCA单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：扩增含有SEQ IDNO.1的轻链可变区和含有SEQ ID NO.2的重链可变区的编码基因时，分别构建含有如 SEQID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有 SEQ ID NO.4 所示的核苷酸序列的表达载体含有人 IgG1 的重链恒定区的表达基因。

6.根据权利要求4所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：扩增含有SEQ IDNO.5的轻链可变区和含有SEQ ID NO.6的重链可变区的编码基因时，分别构建含有如 SEQID NO.7 和 SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID NO.7 所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有 SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列的表达载体含有人 IgG1 的重链恒定区的表达基因。

7.根据权利要求4所述重组SCCA单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述杂交瘤细胞株的制备方法为：

第一步，采用重组抗原或浓缩后的人源汗液作为免疫原，首先将免疫原稀释成一定浓度后与弗氏完全佐剂或不完全佐剂进行乳化，对小鼠进行基础免疫、加强免疫和融合前冲击免疫；

第二步，采用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；

第三步，选取血清效价最高的鼠脾脏细胞，与骨髓瘤细胞进行体外融合，经过多次亚克隆即可获得稳定分泌抗SCCA的杂交瘤细胞株。

8.权利要求1-3任一项所述的重组SCCA单克隆抗体在检测鳞状细胞癌抗原试纸中的应用。

9.权利要求1-3任一项所述的重组SCCA单克隆抗体在检测鳞状细胞癌抗原试剂盒中的应用。

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