CN115887700A - 吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒显影剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒显影剂及其制备方法与应用。本发明首先提供了一种吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其是于介孔硅上修饰有吲哚菁绿及透明质酸的产物。本发明还提供了所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的制备方法，以及所述的述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒在制备显影剂中的应用。本发明的显影剂借助近红外荧光成像系统，来实现对淋巴疾病的精确检查，同时借助近红外荧光探头，可在手术中对微小淋巴管/结进行精确定位，保证手术顺利进行；同时还可以在手术完成后直视下注入淋巴管进行直接/间接淋巴管造影，保证手术通畅率，提高手术疗效。
Description
技术领域
本发明是关于一种吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒显影剂及其制备方法与应用，具体地说，是关于吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒大分子荧光显影剂、其合成方法以及其在淋巴系统疾病中的应用。
背景技术
淋巴水肿是由于淋巴功能不全而引起的组织的慢性进行性肿胀。在世界卫生组织对常见病的排位中淋巴水肿位列第11位，致残类疾病排第2位。全世界多达2.5亿人患有淋巴水肿，可分为两大类型：原发性淋巴水肿和继发性淋巴水肿。原发性淋巴水肿较少见。肿瘤术后继发性淋巴水肿发生率近50％。癌症相关淋巴水肿是导致非传染性继发性淋巴水肿的首要原因。淋巴水肿被认为是癌症治疗中最常见和最具破坏性的后遗症之一。随着肿瘤发病率的逐年上升和就诊率的增加，继发性淋巴水肿的病人还会有所增加。淋巴水肿严重影响幸存者的生活质量。目前对于淋巴水肿的治疗，尚无法达到根治。适当的诊断、分期和进一步选择最佳治疗方法是治疗肢体淋巴水肿的基础。
淋巴系统显像技术的不断进步对于优化淋巴系统疾病的诊断方法和评估淋巴系统的新疗法至关重要。淋巴系统显像是明确诊断淋巴水肿疾病的重要辅助手段，在发病机制研究、疾病分期、治疗方案的选择等方面具有十分重要的作用。而目前临床上所应用的检查方法都存在各自缺陷。
荧光微淋巴管造影是一种有用的局部检查，以显示定位于真皮皮肤的初始毛细血管淋巴网。在这种技术中，最初是在1980年代初，开发FITC右旋糖酐(150kDa)注入皮内。荧光示踪剂扩散到初始淋巴管用显微镜观察，并测量染料沉积外边界的最大距离。示踪剂更广泛的扩散表明没有引流到更深层的淋巴收集血管，提示有损伤。研究表明，12mm的截距可以区分健康腿和淋巴水肿腿，具有较高的敏感性和特异性。然而，这项技术在淋巴学领域很少被采用，因为FITC-右旋糖酐虽然在患者中耐受性良好，却没有正式批准用于人类。近红外(NIR)淋巴造影是一项相对较新的技术，大约15年前首次用于人类。在临床近红外淋巴造影术中，临床批准的染料吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)被注射到感兴趣区域附近的皮内，并使用耦合电荷探测器(CCD)摄像机对感兴趣区域(ROI)进行成像。由于近红外范围内的高光穿透性和低散射性，该技术能够使用微克ICG剂量显示皮肤以下2厘米的淋巴结构。与淋巴显像相比，近红外淋巴显像改善了空间和时间分辨率，为精确描绘淋巴结构和定量评估功能(如测量收集血管收缩性)提供了多种机会。例如，在放射性淋巴闪烁扫描术中，真皮回流只能评估存在与否，而近红外淋巴造影允许观察与淋巴功能障碍和临床症状严重程度相关的不同皮肤回流模式(飞溅、星尘和弥漫、无流动)。近红外淋巴造影术在临床中也可用于评估移植(如手部移植、游离皮瓣移植或带血管的淋巴结转移)中的淋巴流动，LVA手术前淋巴管识别，和前哨淋巴结定位。虽然在后者应用中由于其分子量小，前哨淋巴结中留存少，易泄漏到手术区域等原因并不理想，但它已被证明结合现代术中显影设备检测多种类型的癌症(乳腺癌、妇科癌症、黑色素瘤、头颈部癌症)的前哨淋巴结的临床应用价值。ICG用于SLN定位的一个优点是可以实时跟踪从注射部位到SLN的淋巴流动。近年来，ICG近红外荧光显像已被广泛用于淋巴水肿疾病的早期诊断、临床分期、术中导航及预后监测，并逐渐成为目前研究浅表淋巴系统功能状态的最佳方法。
尽管ICG在淋巴成像领域得到了广泛的应用，但ICG存在以下不足：(1)分子尺寸小(＜1nm)，皮下注射后迅速地进入毛细静脉(内皮间隙＜4nm)和毛细淋巴管(内皮间隙30～120nm)，显像多呈弥散型、星辰型，对浅表淋巴系统显影造成干扰；(2)淋巴组织显影深度受限(＜1cm)。此外，ICG不理想的物理化学性质，如稳定性差、自猝灭和量子产率低，目前限制了近红外淋巴造影技术的全部潜力。
因此，研发具有更深层组织成像能力、生物安全性高的特异性淋巴系统显影剂，实现实时、高效、精准的浅表淋巴系统成像对淋巴水肿的临床诊疗具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的淋巴系统显影剂。
本发明的另一目的在于提供所述淋巴系统显影剂的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述淋巴系统显影剂的应用。
为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其是于介孔硅上修饰有吲哚菁绿及透明质酸的产物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其中，吲哚菁绿与介孔硅之间以化学方式结合，优选通过酰胺键结合；透明质酸与介孔硅之间以化学方式结合，优选通过酰胺键结合。
根据本发明的具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其中，所述介孔硅为氨基化介孔硅，即，介孔硅表面是已经经过氨基化处理的，表面分布着大量的伯氨。这样的介孔硅可以商购获得。本发明中，在氨基化介孔硅表面修饰吲哚菁绿时，采用的吲哚菁绿为羧基化吲哚菁绿，即，吲哚菁绿经修饰后已经含有单个羧基基团，这样的羧基化吲哚菁绿可以商购获得。本发明中，在氨基化介孔硅表面修饰透明质酸时，采用的透明质酸可以为市场上普遍销售的透明质酸，本发明中利用透明质酸带有羧基的性能，将透明质酸修饰到介孔硅上。在本发明的一些具体实施方案中，本发明中所用的透明质酸为来源于马链球菌的天然发酵产物，自带大量羧基。
根据本发明的具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其中，所述介孔硅为氨基化可自降解的有机介孔硅，介孔硅表面暴露的伯氨基的量为0.2～1.0μmol/mg介孔硅。
根据本发明的具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其中，所述伯氨基中的30％-70％与羧基化吲哚菁绿的羧基反应后形成酰胺键结合，其余伯氨基与透明质酸的羧基反应后形成酰胺键结合。
根据本发明的具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其粒径为60nm–120nm。优选地，所述纳米颗粒的90％粒径分布范围为60nm–120nm，平均粒径可为80nm–100nm。
另一方面，本发明还提供了所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的制备方法，该方法包括：
将氨基化介孔硅与ICG-COOH反应，生成ICG与介孔硅结合产物；
在ICG与介孔硅结合产物上修饰透明质酸，得到所述吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒。
根据本发明的具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的制备方法中，氨基化介孔硅与ICG-COOH反应、在ICG与介孔硅结合产物上修饰透明质酸的具体操作条件可以参照酰胺化反应的常规操作进行，本发明中对酰胺化反应的反应条件、所用溶剂等不做特殊要求。
根据本发明的具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的制备方法中，氨基化介孔硅与ICG-COOH反应按照以下操作进行：将介孔硅分散于N,N-二甲基甲酰胺中，加入ICG-COOH的羧基活化溶液，反应后离心收集沉淀，得到ICG与介孔硅结合产物。更具体地，其中，所述反应可在18-40℃条件下进行，反应时间通常为16-48小时，反应过程中可辅以搅拌使反应体系更均匀。氨基化介孔硅与ICG-COOH的用量可根据介孔硅上的氨基基团的数量进行调整，通常使介孔硅表面的伯氨基中的30％-70％与羧基化吲哚菁绿的羧基反应，形成酰胺键而将介孔硅与吲哚菁绿结合。
根据本发明的优选具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的制备方法中，ICG-COOH的羧基活化溶液可以按照以下方法配制得到：将ICG-COOH、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，得到ICG-COOH的羧基活化溶液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的制备方法中，在ICG与介孔硅结合产物上修饰透明质酸的过程包括：将ICG与介孔硅结合产物与透明质酸羧基活化溶液混合，搅拌后产生沉淀，所得沉淀即于介孔硅上修饰有吲哚菁绿及透明质酸的产物。更具体地，其中，搅拌反应可在18-40℃条件下进行，搅拌反应时间通常为16-48小时。生成的沉淀可根据需要离心分离得到本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒。
根据本发明的优选具体实施方案，本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的制备方法中，所述透明质酸羧基活化溶液是按照以下方法配制得到的：取透明质酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于水中，搅拌，得到透明质酸羧基活化溶液。
另一方面，本发明还提供了一种介孔硅与吲哚菁绿结合物(即前述制备吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的中间体)，其是于介孔硅上修饰吲哚菁绿得到的产物。
另一方面，本发明还提供了所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒或所述的介孔硅与吲哚菁绿结合物在制备显影剂中的应用。优选地，所述显影剂为用于检测淋巴系统疾病的显影剂。
本发明的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒用作显影剂，通过细胞实验证实了其可以特异性与淋巴管内皮细胞结合(增强了特异性)。并且通过人体组织切片成像试验，证实了显影剂体系确实可以对人体的淋巴管进行特异性结合、显像。
本发明的浅表淋巴系统显影剂，通过精确控制纳米粒子的结构(粒径大小和分布)和组成(ICGD)，使得显影剂的大小适中，组分合理，专一且更容易进入淋巴循环系统进行特异性荧光显像，可实现浅表淋巴系统的专一性、深层次、高分辨率显像，具有以下优势：
(1)淋巴管特异性显像，排除小静脉同期显影干扰；
(2)能对大于皮下1cm的深层次浅表淋巴管显像；
(3)空间分辨率优于ICG，实现3D淋巴管显像。
综上所述，本发明选择氨基化可自降解的有机介孔硅富集ICG，并在介孔硅表面修饰透明质酸，合成具有近红外荧光的介孔硅大分子显影剂。介孔硅富集ICG既可实现成像体系尺寸变大，又可以克服ICG易在体内扩散的不足，提升ICG的半衰期；在介孔硅表面修饰透明质酸，可以与淋巴管内部分布的“淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)”相互作用，提高了成像体系在淋巴管内的成像特异性和停留时间；同时，该体系的生物兼容性好，七天内可降解，生物安全性高。本发明的技术，可借助近红外荧光成像系统，来实现对淋巴疾病的精确检查，同时借助近红外荧光探头，可在手术中对微小淋巴管/结进行精确定位，保证手术顺利进行。同时还可以在手术完成后直视下注入淋巴管进行直接/间接淋巴管造影，保证手术通畅率，提高手术疗效。本发明的技术尤其在提高淋巴回流重建术技术水平方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1显示透射电镜表征介孔硅、介孔硅-ICG和介孔硅-ICG-HA的形貌。
图2显示介孔硅分散于生理盐水中的水合粒径尺寸变化。
图3显示介孔硅-ICG分散于生理盐水中的水合粒径尺寸变化。
图4显示介孔硅-ICG-HA分散于生理盐水中的水合粒径尺寸变化。
图5显示介孔硅、介孔硅-ICG、介孔硅-ICG-HA三种材料的7天内降解的总趋势。
图6显示介孔硅-ICG-HA体系对小鼠RAW细胞株的毒性实验的检测结果。
图7显示ICG对不同细胞的染色效果。
图8显示使用介孔硅-ICG-HA对不同细胞的染色效果。
图9显示介孔硅-ICG-HA对人体组织切片染色的成像结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。实施例中，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件操作。
实施例1
本实施例中，选择平均粒径90nm的氨基化可自降解的有机介孔硅，与羧基化的吲哚菁绿(ICG-COOH)通过羧基和氨基间生成酰胺键相连，并利用介孔硅表面剩余的氨基，继续修饰透明质酸，合成了具有近红外荧光的介孔硅大分子显影剂。以下从材料制备、生物安全和生物成像三方面研究进行说明。
1.淋巴系统显影剂的制备方法
(1)购买市售的平均粒径为90nm(粒径分布60nm-120nm)的氨基化可自降解的有机介孔硅(以下简称为“介孔硅”)，利用滴定法测定介孔硅表面暴露的伯氨数量(测定方法：利用伯胺与水杨醛的反应生成西弗碱和水，而仲胶和叔胺不发生此反应的原理。再用甲醇钠的吡啶标准溶液滴定过量的水杨醛，求出伯氨基耗用的水杨醛量，进而算出伯氨基的含量)，测定结果为约0.6μmol伯氨/mg介孔硅(本实施例中，每次修饰反应均以5mg介孔硅为单位，即一单位介孔硅上约含有暴露伯氨3μmol)。
(2)取1mg ICG-COOH(约1.4μmol)，1.44mg二环己基碳二亚胺(缩写为DCC)(约7.0μmol)，0.8mg N-羟基琥珀酰亚胺(缩写为NHS)(约7.0μmol)，溶解于1ml N,N-二甲基甲酰胺(缩写为DMF)中，室温搅拌24h，得到羧基活化的ICG。
(3)取5mg介孔硅分散于2ml DMF中，将步骤(2)的反应产物直接加入，继续室温搅拌24h，随后10000rpm/min离心收集沉淀，并用DMF洗涤沉淀三次，即得ICG修饰的介孔硅(此时，介孔硅表面的氨基基团已经有约一半生成酰胺键与ICG结合)。
(4)取5mg市售透明质酸(缩写为HA，来源于马链球菌，购于阿拉丁试剂公司，CAS号：9067-32-7，货号：H107141)(相对于介孔硅表面剩余下的另一半氨基，此时透明质酸的使用量为大过量，目的即为在下一步中可以彻底反应介孔硅表面的所有氨基)，0.103g DCC(约0.5mmol，大过量)，0.0575g NHS(约0.5mmol，大过量)溶解于5ml水中，室温搅拌24h，得到羧基活化的HA。
(5)将步骤(3)所得ICG修饰的介孔硅分散于5ml甲醇中，随后将步骤(4)反应产物直接加入，继续室温搅拌8h，随后10000rpm/min离心收集沉淀，并用DMF洗涤沉淀三次，水洗沉淀三次，即得最终ICG-介孔硅-HA显影剂体系。
2、成像体系的结构及性质表征
(1)透射电镜表征
分别取1ng的介孔硅、介孔硅-ICG和介孔硅-ICG-HA，利用超声波均匀分散于生理盐水中，随后滴加于铜网上，自然挥发至干。用纯净水滴加清洗铜网三次，自然挥发至干。于透射电镜上表征形貌。
结果请参见图1所示。图中第一竖排的标尺代表100nm，第二竖排的标尺代表20nm。可以看出：修饰前后，介孔硅形貌没有明显变化。
(2)7天水合粒径
取0.1mg的ICG-介孔硅-HA显影剂体系分散于生理盐水中，利用粒度仪每天监测显影剂体系的水合粒径变化。
结果请参见图2至图5所示。其中，图2显示了介孔硅的尺寸变化，图3显示了介孔硅-ICG的尺寸变化，图4显示了介孔硅-ICG-HA的尺寸变化，图5显示了三种材料的7天内降解的总趋势。可以得出结论：修饰前后并不影响介孔硅的7天可降解性质。
(3)体外毒性实验
RAW细胞(小鼠单核巨噬细胞)在含有5％牛血清的达尔伯克(氏)必需基本培养基(DMEM)中培养。培养条件为37℃ 5％CO2。随后分板至96孔板中，每孔中加入约30000个细胞。继续培养24小时后，加入介孔硅、介孔硅-ICG或者介孔硅-ICG-HA样品，继续在37℃下培养24小时。细胞毒性通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(简称MTT)试剂盒检测。用酶标仪检测490nm处的吸收值。所有的检测重复三次。
图6显示了本实施例的介孔硅-ICG-HA体系对小鼠RAW细胞株的毒性实验的检测结果。图中编号，1、control(只有RAW细胞，将其存活率定义为100％)；2、RAW细胞中加入0.1mg/ml的介孔硅-ICG-HA；3、RAW细胞中加入0.3mg/ml的介孔硅-ICG-HA；4、RAW细胞中加入0.5mg/ml的介孔硅-ICG-HA；5、RAW细胞中加入1.0mg/ml的介孔硅-ICG-HA；6、RAW细胞中加入2.0mg/ml的介孔硅-ICG-HA。可以得出结论，介孔硅-ICG-HA未发现有明显的细胞毒性。
3、细胞层面成像研究
本实施例中，选取了三种鼠源细胞：RAW(小鼠单核巨噬细胞)，CT26(小鼠结肠癌细胞)和MLEC(小鼠淋巴管内皮细胞)。选取原因：RAW为小鼠正常细胞，不含有LYVE-1受体；CT26为小鼠癌细胞，含有少量LYVE-1受体；MLEC为小鼠淋巴管内皮细胞，含有大量LYVE-1受体。
将三种细胞置于带1cm*1cm的玻璃片的24孔板中，分别加入培养基进行培养，让细胞在玻璃片上贴壁生长。利用DAPI+ICG或者DAPI+介孔硅-ICG-HA对细胞双染，随后用无菌生理盐水对玻璃片清洗1、2、3或者5次(将细胞贴壁生长的玻璃片全部浸泡于无菌生理盐水中，静置5分钟，取出，即为完成1次清洗)。用4％多聚甲醛固定细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope)进行成像。
图7显示了ICG对三种细胞的染色效果，图片中的编号1、2、3、5分别代表染色后对细胞清洗1、2、3或者5次。图8显示了使用本发明的介孔硅-ICG-HA对三种细胞的染色效果，图片中的编号1、2、3、5分别代表染色后对细胞清洗1、2、3或者5次。可以得出结论，使用ICG染色，既没有选择性，与细胞结合地也不牢靠(容易被代谢)。使用介孔硅-ICG-HA染色，既出现了选择性(与MLEC产生了特异性结合)，且与细胞结合地也非常牢靠(不容易被代谢)。
4、人体组织切片成像研究
取临床废弃的人体组织：腘窝处淋巴结(含有高水平淋巴管)，进行超低温切片。随后对切片进行抗体+介孔硅-ICG-HA双染，利用利用激光扫描共聚焦显微镜进行成像。
成像结果请参见图9，可以得出结论，本发明的介孔硅-ICG-HA体系在人体组织内可以对淋巴管进行特异性成像。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其是于介孔硅上修饰有吲哚菁绿及透明质酸的产物。
2.根据权利要求1所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其中，吲哚菁绿与介孔硅之间以化学方式结合，优选通过酰胺键结合；透明质酸与介孔硅之间以化学方式结合，优选通过酰胺键结合。
3.根据权利要求1或2所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其中，所述介孔硅为氨基化可自降解的有机介孔硅，介孔硅表面暴露的伯氨基的量为0.2～1.0μmol/mg介孔硅，所述伯氨基中的30％-70％与羧基化吲哚菁绿的羧基反应后形成酰胺键结合，其余伯氨基与透明质酸的羧基反应后形成酰胺键结合。
4.根据权利要求1所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其粒径为60nm–120nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒，其是按照以下方法制备得到的：
将氨基化介孔硅与ICG-COOH反应，生成ICG与介孔硅结合产物；
在ICG与介孔硅结合产物上修饰透明质酸，得到所述吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒的方法，该方法包括：
将氨基化介孔硅与ICG-COOH反应，生成ICG与介孔硅结合产物；
在ICG与介孔硅结合产物上修饰透明质酸，得到所述吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，氨基化介孔硅与ICG-COOH反应按照以下操作进行：
将介孔硅分散于N,N-二甲基甲酰胺中，加入ICG-COOH的羧基活化溶液，反应后离心收集沉淀，得到ICG与介孔硅结合产物；
优选地，其中，ICG-COOH的羧基活化溶液是按照以下方法配制得到的：
将ICG-COOH、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，得到ICG-COOH的羧基活化溶液。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，在ICG与介孔硅结合产物上修饰透明质酸的过程包括：
将ICG与介孔硅结合产物与透明质酸羧基活化溶液混合，搅拌后产生沉淀，所得沉淀即于介孔硅上修饰有吲哚菁绿及透明质酸的产物；
优选地，所述透明质酸羧基活化溶液是按照以下方法配制得到的：
取透明质酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于水中，搅拌，得到透明质酸羧基活化溶液。
9.一种介孔硅与吲哚菁绿结合物，其是于介孔硅上修饰吲哚菁绿得到的产物。
10.权利要求1-5任一项所述的吲哚菁绿介孔硅纳米颗粒或权利要求9所述的介孔硅与吲哚菁绿结合物在制备显影剂中的应用；优选地，所述显影剂为用于检测淋巴系统疾病的显影剂。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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