CN115887569A

CN115887569A - 延龄草提取物的制备方法及其在抗辐射损伤中的应用

Info

Publication number: CN115887569A
Application number: CN202111162993.9A
Authority: CN
Inventors: 马百平; 李艳华; 张洁; 裴雪涛; 庞旭; 王思涵; 宋妃灵; 陈晓娟
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明提出了一种延龄草提取物的制备方法，包括：步骤1：将延龄草根茎粉碎，得到延龄草粉末；步骤2：用第一乙醇溶液浸泡所述延龄草粉末，煎煮或回流提取，过滤，收集滤液，浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第一乙醇溶液浓度为0～75体积％。利用本发明的制备方法获得的延龄草提取物具有预防和治疗辐射损伤作用，应用前景好。

Description

延龄草提取物的制备方法及其在抗辐射损伤中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及延龄草提取物的制备方法及其在抗辐射损伤中的应用。

背景技术

延龄草是来自百合科延龄草属植物的名贵中药，也是土家族著名常用药味之一。该属植物主要包括延龄草Trillium tschonoskii Maxim.、吉林延龄草Trilliumkamtschaticum Pall.ex Purs和西藏延龄草Trillium govanianum Wall.ex Royle等。现有研究表明，延龄草具有良好的抗肿瘤、抗炎、免疫调节、改善大鼠学习记忆功能和抗衰老等作用。临床主要用于头晕目眩、失眠、跌打损伤、外伤出血、神经衰弱、高血压病、脑震荡后遗症等疾病的治疗。

随着科技的发展，核技术的广泛应用，电离辐射已经渗入到生活中的各个领域。如核能技术的应用愈来愈广泛；临床上患者接受医学诊疗期间尤其是肿瘤放射治疗过程中，其健康组织也会受到一定程度的辐射损伤。电离辐射在给人们带来便利的同时，也对健康造成了一定的影响，其能够通过组织与细胞等产生活性氧(ROS)自由基，干扰DNA、蛋白质等大分子，诱导细胞损伤和细胞功能的异常，导致人与动物的机体损伤，如造血系统、免疫系统及消化系统等，最终导致机体多种器官发生功能性紊乱、发生病变甚至引起机体死亡。随着人们对辐射损伤和防护的深入了解，许多辐射防护剂已经被发现。辐射防护剂分为两类：一类是以人工合成的药物为主，主要是色氨类化合物、含硫化合物等，但该类辐射防护剂存在副作用大、作用时效短、价格昂贵等缺点；另一类是天然辐射防护剂，包括植物多酚类、生物碱类、皂苷类、花青素类、维生素类等，其优点是作用时效长、成本低且无明显毒副作用。

人体不同组织细胞对辐射的敏感性存在差异。其中，肠道是放射损伤敏感的组织之一。高剂量电离辐射容易引发急性胃肠道综合征(Acute Gastrointestinal Syndrome,AGS)极大地威胁受辐射人群的生存；临床上对预防或治疗高剂量电离辐射诱发的AGS尚无有效、且不良反应小的药物。寻找高效、无毒副作用、可长期服用的用于预防和/或治疗肠组织辐射损伤的新型天然辐射防护剂已成为目前的研究重点。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种延龄草提取物的制备方法、延龄草提取物及其应用，利用该制备方法获得的延龄草提取物具有预防和治疗辐射损伤作用，应用前景好。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种延龄草提取物的制备方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：步骤1：将延龄草根茎粉碎，得到延龄草粉末；步骤2：用第一乙醇溶液浸泡所述延龄草粉末，煎煮或回流提取，过滤，收集滤液，浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第一乙醇溶液浓度为0～75体积％。采用根据本发明实施例的方法所获得的延龄草提取物可以提取出延龄草中的有效成分，例如寡糖，获得的提取物具有预防和治疗辐射损伤的作用。

根据本发明的实施例，上述延龄草提取物的制备方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，进行所述浓缩干燥之前，将所述滤液进一步进行如下操作：将所述滤液加入到层析柱中，用第二乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，将所述浓缩液进行所述浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第二乙醇溶液浓度为0～30体积％，更优选地，所述第二乙醇溶液浓度为0～20体积％。

发明人发现，采用柱层析方式以更好地分离出具有辐射损伤防护的提取物。进一步地，发明人发现，滤液中的寡糖对于辐射损伤的防护有极佳的效果，进而，发明人为了获得更纯的寡糖，进一步研究发现，采用0～30体积％乙醇溶液洗脱后，流出液中寡糖含量较高，由此，所获得的提取物具有很好的辐射损伤的防护作用。

根据本发明的实施例，进行所述浓缩干燥之前，将所述流出液再次加入层析柱中，用第三乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，将所述浓缩液进行所述浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第三乙醇溶液的浓度为0～20体积％。由此，以便于将获得的寡糖再次纯化，以进一步提高提取物中寡糖纯度。

根据本发明的实施例，所述层析柱中填充有大孔吸附树脂，优选地，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂，更优选型号为AB-8型、D-101型、SP825型或HP20型。由此，可以更好地吸附滤液中除寡糖以外的其他组分，从而可以更好地获得富含寡糖的提取物。

根据本发明的实施例，所述延龄草根茎的药材来源为百合科延龄草属植物，包括但不限于延龄草Trillium tschonoskii Maxim.、吉林延龄草Trillium kamtschaticumPall.ex Pursh和西藏延龄草Trillium govanianum Wall.ex Royle中的一种或多种。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种延龄草提取物。根据本发明的实施例，所述延龄草提取物是通过前面所述延龄草提取物的制备方法获得的。该延龄草提取物富含具有辐射损伤防护作用的成分，例如寡糖，具有预防和治疗辐射损伤的作用，应用前景好。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述延龄草提取物在制备抗辐射损伤产品中的应用。利用该延龄草提取物可用于辐射损伤的预防和治疗，应用前景好。

根据本发明的实施例，所述辐射损伤为电离辐射损伤；所述电离辐射损伤包括但不限于α射线、β射线、γ射线和X射线中的一种或多种。

根据本发明的实施例，所述电离辐射损伤为电离辐射所致的肠损伤。

根据本发明的实施例，所述抗辐射损伤产品包括但不限于食品、保健食品或药物。

根据本发明的实施例，所述药物的剂型为颗粒剂、口服液、胶囊、片剂、泡腾片、粉针剂、水针剂或注射剂。

根据本发明的实施例，所述药物包括单方剂型或复方剂型。

有益效果：

本发明通过从天然药物延龄草中提取具有辐射损伤防护的活性成分(主要为寡糖)，其具有良好的生物相容性，对于由γ射线、X射线照射的小鼠损伤模型具有明显的防护作用，尤其是对由γ射线照射的小肠损伤有明显的防护作用和较强的生物活性。本发明的提取物可以制成抗辐射产品，例如食品、药物或保健品，应用前景好。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为延龄草纯化寡糖(TT-2-0)和(TT-2-15)对γ射线照射的IEC细胞的克隆形成能力的影响；

图2为延龄草寡糖部位(TT-2)抑制γ射线照射的IEC细胞的凋亡；

图3为延龄草寡糖部位(TT-2)促进γ射线照射的IEC细胞的增殖。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

一种延龄草提取物的制备方法：将20kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1小时，10倍量50％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。浓缩滤液，烘干，即得延龄草粗提取物5.7kg；

实施例2

一种延龄草提取物的制备方法：将5kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用70％乙醇浸泡1小时，8倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。浓缩滤液，减压真空干燥，即得延龄草粗提取物1.1kg；

实施例3

一种延龄草提取物的制备方法：将5kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用水浸泡1小时，8倍量水加热提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。浓缩滤液，冰冻干燥，即得延龄草粗提取物2.2kg；

实施例4

一种延龄草寡糖部位的制备方法：将6kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1小时，10倍量50％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液于60-70℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏静置过夜，过滤，滤液上AB-8大孔吸附树脂柱富集，用15％乙醇洗脱，得到洗脱物，减压浓缩洗脱物，浓缩液用冷冻干燥机干燥，收集冻干粉即为所述延龄草寡糖部位，共280.2g；

实施例5

一种延龄草寡糖部位的制备方法：将3kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用75％乙醇浸泡1小时，12倍量75％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液于60-70℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，过滤，滤液上D101大孔吸附树脂柱富集，用30％乙醇洗脱，得到洗脱物，减压浓缩洗脱物，，浓缩液减压真空干燥，收集干粉即为所述延龄草寡糖部位，共160.4g；

实施例6

一种延龄草寡糖部位的制备方法：将5kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用水浸泡1小时，8倍量水加热提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液于60-70℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，过滤，滤液上SP825大孔吸附树脂柱富集，用20％乙醇洗脱，得到洗脱物，减压浓缩洗脱物，浓缩液用冷冻干燥机干燥，收集冻干粉即为所述延龄草寡糖部位，共340.5g；

实施例7

一种延龄草纯化寡糖的制备方法：将5kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1小时，10倍量50％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液于60-70℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，过滤，滤液上SP825大孔吸附树脂柱富集，用15％乙醇洗脱，得到洗脱物，减压浓缩洗脱物，浓缩液再次上HP20大孔吸附树脂，用水洗脱，水洗脱部分浓缩后用冷冻干燥机干燥，收集冻干粉即为所述延龄草纯化寡糖，共30.2g。

实施例8

一种延龄草纯化寡糖的制备方法：将5kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1小时，10倍量50％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液于60-70℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，过滤，滤液上SP825大孔吸附树脂柱富集，用15％乙醇洗脱，得到洗脱物，减压浓缩洗脱物至小体积(约800ml)，浓缩液再次上SP825大孔吸附树脂，用10％乙醇洗脱部分浓缩后用冷冻干燥机干燥，收集冻干粉即为所述延龄草纯化寡糖，共40.6g。

实施例9

采用致死剂量的γ-射线辐射损伤C57BL/6小鼠模型，观察延龄草提取物、吉林延龄草提取物对辐射小鼠生存率的影响，实验结果显示，延龄草提取物及吉林延龄草提取物可改善模型小鼠在照射后30d的存活。

1.受试物制备

a.延龄草提取物的制备：将2kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1小时，10倍量溶剂加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。浓缩滤液，减压真空干燥，即得延龄草提取物。将以上延龄草提取物配制成适量浓度的水溶液/混悬液备用；

b.吉林延龄草提取物的制备：将3kg吉林延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％浸泡1小时，8倍量溶剂加热提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。浓缩滤液，减压真空干燥，即得吉林延龄草提取物。将以上吉林延龄草提取物配制成适量浓度的水溶液/混悬液备用。

2.动物分组及全身辐射

C57BL/6小鼠随机分为8组，包括：1个正常对照组、1个全身辐射模型对照组和低、中、高三个剂量的延龄草提取物组及低、中、高三个剂量的吉林延龄草提取物组，10只/组。延龄草提取物组低、中、高三个剂量分别为200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg；吉林延龄草提取物组低、中、高三个剂量分别为200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg。从辐射前7天开始每天灌胃延龄草提取物、吉林延龄草提取物受试物，每次灌胃体积约为0.4mL(各受试物灌胃体积根据动物实际体重进行调整)，正常对照组(不添加延龄草提取物)和辐射对照组每日平行灌胃0.4mL的动物日常饮用灭菌水。除正常对照组外，辐射对照组及各给药组均接受⁶⁰Co-γ放射源一次性全身辐射，吸收剂量为8.5Gy，剂量率为67.51cGy/min，动物距放射源4.0米，辐射后继续灌胃21天，每日观察受试小鼠行为状态，记录辐射后30d内的死亡情况。

3.实验结果

3.1体征、行为变化

相对于正常对照组，辐射组小鼠在照射当天体温略高，行为狂躁。辐射模型组小鼠第二天开始逐渐失去活力，表现为行动缓慢、精神不振，毛色逐渐暗灰，一周后可见背毛稀疏、凌乱，光泽性差；延龄草提取物组及吉林延龄草提取物组小鼠较辐射模型组背毛光泽度及行为状态良好。

3.2存活率

如下表1所示，8.5Gyγ-射线照射后，全身辐射模型对照组C57BL/6小鼠在辐射后的19天内全部死亡，延龄草提取物组及吉林延龄草提取物各受试物组中小鼠表现出了较好的存活率。在辐射后的30天观察期内，延龄草提取物组及吉林延龄草提取物组可提高辐射小鼠的存活率，其中延龄草提取物组低(200mg/kg)、中(400mg/kg)、高剂量(800mg/kg)组分别有2只、4只和5只小鼠存活，吉林延龄草提取物组低(200mg/kg)、中(400mg/kg)、高剂量(800mg/kg)组分别有2只、4只和3只小鼠存活，以上实验结果表明延龄草提取物组及吉林延龄草提取物均可以减轻8.5Gyγ-射线对C57BL/6小鼠的辐射损伤。

表1延龄草及吉林延龄草提取物生存率实验结果

实施例10

采用致死剂量的X-射线辐射损伤BALB/C小鼠模型，观察延龄草提取物、吉林延龄草提取物对辐射小鼠生存率的影响，实验结果显示，延龄草提取物及吉林延龄草提取物可改善模型小鼠在照射后30天的存活。

1.受试物制备

a.延龄草提取物的制备：将5kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用水浸泡1小时，12倍量溶剂加热提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。浓缩滤液，减压真空干燥，即得延龄草提取物。将以上延龄草提取物配制成适量浓度的水溶液备用；

b.吉林延龄草提取物的制备：将3kg吉林延龄草根茎粉碎成粗粉，用水浸泡1小时，10倍量溶剂加热提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。浓缩滤液，减压真空干燥，即得吉林延龄草提取物。将以上吉林延龄草提取物配制成适量浓度的水溶液备用。

2.动物分组及全身辐射

BALB/C小鼠随机分为8组，包括：1个正常对照组、1个全身辐射模型对照组和低、中、高三个剂量的延龄草提取物组及低、中、高三个剂量的吉林延龄草提取物组，10只/组。延龄草提取物组低、中、高三个剂量分别为150mg/kg、300mg/kg、600mg/kg；吉林延龄草提取物低、中、高三个剂量分别为150mg/kg、300mg/kg、600mg/kg。从辐射前7天开始每天灌胃延龄草提取物、吉林延龄草提取物受试物，每次灌胃体积约为0.4mL(各受试物灌胃体积根据动物实际体重进行调整)，正常对照组和辐射对照组每日平行灌胃0.4mL的动物日常饮用灭菌水。

除对照组外，其余各组动物均进行一次性X射线全身照射(当天照射后给予)，辐射后继续给予受试物或溶媒21天。照射剂量为6.0Gy，照射剂量率为190.7cGy/min。每日观察受试小鼠行为状态，记录辐射后30d内的死亡情况。

3.实验结果

3.1体征、行为变化

相对于正常对照组，辐射组小鼠在照射当天体温略高，行为狂躁。辐射模型组小鼠第二天开始逐渐失去活力，表现为行动缓慢、精神不振，约7天后可见背毛稀疏、光泽性差；延龄草提取物组及吉林延龄草提取物组小鼠较辐射模型组背毛光泽度及行为状态良好。

3.2存活率

如下表2所示，6.0Gy X-射线照射后，全身辐射模型对照组BALB/C小鼠在辐射后的12d内全部死亡，延龄草提取物组及吉林延龄草提取物各受试物组中BALB/C小鼠表现出了较好的存活率。在辐射后的30d观察期内，延龄草提取物组及吉林延龄草提取物组可提高辐射小鼠的存活率，其中延龄草提取物组低(150mg/kg)、中(300mg/kg)、高剂量(600mg/kg)组分别有3只、4只和5只小鼠存活，吉林延龄草提取物组低(150mg/kg)、中(300mg/kg)、高剂量(600mg/kg)组分别有2只、4只和4只小鼠存活，以上实验结果表明延龄草提取物组及吉林延龄草提取物均可以减轻6.0Gy X-射线对BALB/C小鼠的辐射损伤。

表2延龄草及吉林延龄草提取物生存率实验结果

实施例11

基于γ射线照射的肠隐窝细胞系IEC-6的克隆形成实验，观察延龄草纯化寡糖对其克隆形成能力的影响。

1.受试物制备

a.延龄草纯化寡糖的制备：

将6kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1小时，10倍量溶剂加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液于60-70℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，过滤，滤液上SP825大孔吸附树脂柱富集，用15％乙醇洗脱，得到洗脱物。减压浓缩洗脱物至小体积，浓缩液再次上HP20大孔吸附树脂，分别用水和15％乙醇洗脱，树脂洗脱物浓缩后用冷冻干燥机干燥，分别收集水洗脱物及15％乙醇洗脱物冻干粉即为所述延龄草纯化寡糖，分别记作TT-2-0和TT-2-15。将以上延龄草纯化寡糖配制成适量浓度的水溶液备用。

b.实验材料及仪器

IEC-6细胞是大鼠小肠隐窝细胞系；超净工作台，离心机，CO₂恒温细胞培养箱，光学显微镜(Olympus公司)，⁶⁰Co射线源，细胞活力分析仪等。

c.实验方法

从CO₂恒温细胞培养箱中取出装有IEC-6的T75细胞培养瓶，添加5mL的PBS洗涤细胞，弃PBS。添加2mL的0.25％Trypsin-EDTA消化细胞约3分钟。于显微镜下观察到大部分细胞都已被消化下来。添加8mL的细胞培养基，混匀；吸出细胞培养瓶中全部液体转移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟弃上清，向细胞沉淀部分添加1mL细胞培养基，重悬细胞沉淀。利用⁶⁰Co射线源(γ射线)照射IEC-6细胞，照射剂量为10Gy，剂量率为54.22cGy/min。照射完成后，1000rpm离心5分钟。弃上清，添加1mL细胞培养基，重悬细胞沉淀，于细胞活力分析仪中进行计数。取6孔板，按细胞密度为1×10³个细胞/mL计算接种所需的细胞体积数，接种细胞于6孔板中，同时设立对照组和实验组，混匀细胞后放入CO₂恒温细胞培养箱培养，每隔1天换液，培养7天后，取出结晶紫染色液，恢复至室温。取出6孔板，弃孔中旧的培养基，添加1mL的PBS洗涤细胞，弃PBS。添加1mL的结晶紫染色液，于室温中静置30分钟。弃结晶紫染色液，添加1mL的H₂O洗涤细胞，弃H₂O，于通风橱中晾干6孔板，后于凝胶成像仪下观察并计数细胞克隆数量。

d.实验结果

实验结果显示(如图1所示)，与对照组(不添加延龄草纯化寡糖)相比，延龄草纯化寡糖(TT-2-0)和(TT-2-15)使γ射线照射的IEC-6细胞的克隆形成数量明显增加。表明延龄草纯化寡糖TT-2-0和TT-2-15具有增强γ射线照射的IEC-6细胞的克隆形成能力。

以上结果表明，延龄草纯化寡糖可能具有促进辐照后肠隐窝细胞增殖的能力。

实施例12

1.受试物制备

延龄草寡糖部位的制备

将6kg延龄草根茎粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1小时，10倍量溶剂加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液于60-70℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，过滤，滤液上AB-8大孔吸附树脂柱富集，用15％乙醇洗脱，得到洗脱物。减压浓缩洗脱物，浓缩液用冷冻干燥机干燥，收集冻干粉即为所述延龄草寡糖部位。

将以上延龄草寡糖部位配制成适量浓度的水溶液备用。

2.实验材料及仪器

IEC-6细胞是大鼠小肠隐窝细胞系；超净工作台，离心机，CO₂恒温细胞培养箱，光学显微镜，⁶⁰Co射线源，细胞活力分析仪，共聚焦显微镜，流式细胞仪等。

3.实验方法

3.1IEC-6细胞凋亡检测

从CO₂恒温细胞培养箱中取出装有IEC-6的T75细胞培养瓶，添加5mL的PBS洗涤细胞，弃PBS。添加2mL的0.25％Trypsin-EDTA消化细胞约3分钟。于显微镜下观察到大部分细胞都已被消化下来。添加8mL的细胞培养基，混匀；吸出细胞培养瓶中全部液体转移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟弃上清，向细胞沉淀部分添加1mL细胞培养基，重悬细胞沉淀。利用⁶⁰Co射线源(γ射线)照射IEC-6细胞，照射剂量为10Gy，剂量率为54.22cGy/min。照射完成后，1000rpm离心5分钟，取T25细胞培养瓶，按细胞密度为4×10⁶个细胞/mL计算接种所需的细胞体积数，接种细胞于T25细胞培养瓶中，同时设立对照组和实验组，混匀细胞后放入CO₂恒温细胞培养箱培养。培养48小时后，消化并收集细胞，同时回收旧培养基，1000rpm离心5分钟。离心完毕，弃上清，添加1mL的PBS，重悬细胞沉淀，1000rpm离心5分钟，并于细胞活力分析仪中进行计数。用蒸馏水将10×Annexin V Binding Solution稀释成1×Annexin VBinding Solution。取出离心管，弃上清，加入1×Annexin V Binding Solution，制成终浓度为1×10⁶个细胞/mL的细胞悬液，一般推荐不超过500μL的细胞悬液，并设立对照组：未染色细胞，Annexin V、FITC染色细胞(无PI)，PI染色细胞(无Annexin V、FITC)。取100μL的细胞悬液，加入到新的1.5mL EP管中。加入5μL的Annexin V、FITC结合物，再加入5μL的PISolution，于室温下避光孵育15分钟。加入400μL的1×Annexin V Binding Solution，并在1小时内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

3.2 EdU流式细胞术检测

提前2小时添加EdU(10μM，试剂A)孵育，而后消化收集细胞；添加3mL的1％BSA的PBS洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清液。添加100μL的

fixative(试剂D)重悬细胞，混匀后于室温下避光孵育15分钟。添加3mL的含1％BSA的PBS洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清液。添加100μL的

saponin-based permeabilization and washreagent(试剂E)重悬细胞，混匀后于室温下避光孵育15分钟。将

EdU bufferadditive(试剂G)按1:9制备成

EdU buffer additive。根添加0.5mL的

Plus reaction cocktails，吹打混匀细胞，于室温下避光孵育30分钟；添加3mL的

saponin-based permeabilization and wash reagent(试剂E)，洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清液。加入1mL的PBS重悬细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清，加入250μL的PBS重悬，利用70μm细胞筛网将细胞滤过至96孔板内，于流式细胞仪中检测细胞中EdU掺入情况。

4.实验结果

实验结果显示(如图2所示)，与对照组(不添加延龄草寡糖部位)相比，在延龄草寡糖部位(TT-2)组中，γ射线照射的IEC-6细胞的凋亡细胞百分比均显著降低(**p<0.01)。以上结果表明，延龄草寡糖部位(TT-2)能够抑制γ射线照射的IEC-6细胞的凋亡。

实验结果表明(如图3所示)，与对照组(不添加延龄草寡糖部位，4.25±0.250％)相比，延龄草寡糖部位(TT-2)组显著增强了γ射线照射的IEC-6细胞核中EdU的掺入百分比(**p<0.01)。以上结果表明，延龄草寡糖部位(TT-2)能够促进γ射线照射的IEC-6细胞的增殖。

本发明分别采用γ射线照射辐射损伤小鼠模型、X射线照射辐射损伤小鼠模型、γ射线照射的大鼠小肠隐窝细胞系IEC-6细胞克隆形成实验，观察延龄草提取物对辐照小鼠存活率的影响、延龄草寡糖部位(TT-2)及其纯化寡糖(TT-2-0和TT-2-15)对大鼠小肠隐窝细胞系IEC-6细胞克隆形成能力的影响，及延龄草寡糖部位(TT-2)对辐射的IEC-6细胞增殖与凋亡的影响。结果表明，延龄草提取物能明显提高γ射线、X射线等照射的辐射损伤小鼠的存活率；延龄草寡糖部位(TT-2)及其纯化寡糖(TT-2-0和TT-2-15)对由γ射线照射大鼠肠损伤有明显的防护作用，为进一步开发辐射损伤防护产品，尤其是肠组织辐射损伤的新型天然辐射防护剂提供了理论依据。

本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。

本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种延龄草提取物的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：将延龄草根茎粉碎，得到延龄草粉末；

步骤2：用第一乙醇溶液浸泡所述延龄草粉末，煎煮或回流提取，过滤，收集滤液，浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第一乙醇溶液浓度为0～75体积％。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进行所述浓缩干燥之前，将所述滤液进一步进行如下操作：将所述滤液加入到层析柱中，用第二乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，将所述浓缩液进行所述浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第二乙醇溶液浓度为0～30体积％，更优选地，所述第二乙醇溶液浓度为0～20体积％。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，进行所述浓缩干燥之前，将所述流出液再次加入层析柱中，用第三乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，将所述浓缩液进行所述浓缩干燥，得到所述延龄草提取物，其中，所述第三乙醇溶液的浓度为0～20体积％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述层析柱中填充有大孔吸附树脂，优选地，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂，更优选型号为AB-8型、D-101型、SP825型或HP20型。

5.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述延龄草根茎的药材来源为百合科延龄草属植物，包括但不限于延龄草Trillium tschonoskii Maxim.、吉林延龄草Trillium kamtschaticum Pall.ex Pursh和西藏延龄草Trillium govanianum Wall.exRoyle中的一种或多种。

6.一种延龄草提取物，其特征在于，所述延龄草提取物是通过权利要求1～5任一项所述延龄草提取物的制备方法获得的。

7.权利要求6所述延龄草提取物在制备抗辐射损伤产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述辐射损伤为电离辐射损伤；所述电离辐射损伤包括但不限于α射线、β射线、γ射线和X射线中的一种或多种；

优选地，所述电离辐射损伤为电离辐射所致的肠损伤。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗辐射损伤产品包括但不限于食品、保健食品或药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为颗粒剂、口服液、胶囊、片剂、泡腾片、粉针剂、水针剂或注射剂；

所述药物包括单方剂型或复方剂型。