CN115873702B - 深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统及方法，本发明的装置包括：置于设定恒温环境的分离操作单元、注液单元、取样单元、压力控制单元及环境参数检测单元，分离操作单元具有封闭的分离操作区，在分离操作区中设有一三轴移动机构和至少一枪头盒，枪头盒内放置有多个枪头，三轴移动机构的移动Z轴设有一用于从枪头盒中提取枪头的机械臂，三轴移动机构的移动XY轴平面区域还放置有培养区，培养区上固定有设置有培养皿，培养皿设有多个装有不同营养配比的培养基的分区；注液单元具有微生物富集釜和喷洒装置，微生物富集釜通过送液管道连接到分离操作区的上方的喷洒装置，喷洒装置的喷口朝向培养区。

Description

深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统及方法

技术领域

本发明涉及保温、保压单菌落高通量自动筛分技术领域，具体涉及一种深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统及方法。

背景技术

深海通常是指水深超过1000m的区域，一般认为是一个黑暗、高静水压、低温(热液除外)和寡营养的极端环境。19世纪就探明深海存在大量人类未知的生物且有超乎人类想象的生物多样性，在20世纪30年代的时候也发现海床下数厘米至数米的深海沉积物内存在大量微生物，它们在基因、生理代谢等方面具有极高的创新性和多样性，在促进海洋能量传递和物质循环及维护海洋乃至全球生态系统稳定等方面具有不可取代的作用。因此，深海微生物具有重要的科研价值和经济价值。

海洋中微生物一般在常压环境条件下进行筛分，即使在高压环境下的筛分，也是释压后人为增压进行，因此，获得的单菌落一般为非嗜压菌。然而，深海环境存在大量因压力而生存的嗜压菌，或者和嗜压菌具有伴随关系的微生物，一旦释压会导致嗜压菌其活性丧失或者休眠，导致嗜压菌或者伴随菌很难在常压下得到纯培养。此外，现有的技术方法不能在深海原位温度和压力条件下进行全流程培养筛分单菌落，导致90％以上功能菌无法获得纯培养的单菌落，这限制了我们对深海微生物的全面认识以及微生物资源的合理开发利用。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统及方法，其可以在海洋原位的温度和压力环境条件下实现海洋微生物的分离和纯培养。

为实现上述目的，本发明可以采用以下技术方案进行：

第一方面，本发明提供一种单菌落自动筛分的系统，其包括：

置于设定恒温环境的分离操作单元，其具有封闭的分离操作区，在所述分离操作区中设有一三轴移动机构和至少一枪头盒，所述枪头盒内放置有多个枪头，所述三轴移动机构的移动Z轴设有一用于从所述枪头盒中提取枪头的机械臂，所述三轴移动机构的移动XY轴平面区域还放置有培养区，所述培养区上设置有固定的培养皿，所述培养皿设有多个装有不同营养配比的培养基的分区；

注液单元，其具有微生物富集釜和喷洒装置，所述微生物富集釜通过送液管道连接到所述分离操作区的上方的所述喷洒装置，所述喷洒装置的喷口朝向所述培养区；

取样单元，其具有一端连接在所述分离操作区底部的取样管道，所述取样管道内设有将所述枪头从所述机械臂拆分的卡口结构，所述取样管道的另一端通过快捷拆装结构连接有设定压力的培养釜；

压力控制单元，其用于给所述分离操作区提供与微生物在海洋原位相仿的压力环境；以及，环境参数检测单元，其用于检测所述分离操作区内的各物理参数。

如上所述的单菌落自动筛分的系统，进一步地，所述送液管道上设有过滤装置和微注泵，其中，所述过滤装置设置于所述微生物富集釜和所述微注泵之间的管道上，且所述过滤装置内安装有设定孔径的多级滤膜，所述多级滤膜由多个不同孔径的滤膜组成；所述喷口具有设定直径并规则排列，且所述喷口具有与喷洒菌液相匹配的圆形孔径，所述喷洒装置的喷洒菌液的范围不大于培养皿的直径。

如上所述的单菌落自动筛分的系统，进一步地，所述分离操作单元包括箱体底座和盖体，所述盖体通过卡扣扣合在所述箱体底座上进而在两者内部形成所述分离操作区，所述枪头盒的上部设有枪头架，所述枪头架上设有规则排列的圆孔，该圆孔的外形尺寸与所述枪头的中上部外形尺寸相匹配，所述枪头为圆台形且内部为空心，所述机械臂的底端为实心的倒圆台形，所述机械臂的底端与枪头最宽处的内部尺寸相匹配。

如上所述的单菌落自动筛分的系统，进一步地，所述盖体设有观察区，所述观察区设有可观察到所述分离操作区的可视窗，所述观察区上方还设有辅助观察所述分离操作区的观察装置。

如上所述的单菌落自动筛分的系统，进一步地，所述卡口结构为向下倒立的闭合花瓣，闭合花瓣的顶端外形尺寸小于所述机械臂的底端的外形尺寸，所述快捷拆装结构与所述卡口结构之间设有第一阀门，所述快捷拆装结构与所述培养釜之间设有第二阀门，所述取样管道、所述第一阀门和所述第二阀门的内径均大于所述枪头的最宽处的外形尺寸。

如上所述的单菌落自动筛分的系统，进一步地，所述环境参数检测单元包括设置在所述分离操作区内的温度传感器和压力传感器，所述温度传感器用于实时检测分离操作单元内的温度变化情况，所述压力传感器实时检测分离操作单元内的压力变化情况。

如上所述的单菌落自动筛分的系统，进一步地，所述观察装置包括显微镜和无影灯，所述显微镜的观察镜头朝向所述可视窗，用于对所述分离操作区内的微生物进行观察和识别，所述无影灯用于防止观察和识别的过程而形成的阴影。

如上所述的单菌落自动筛分的系统，进一步地，还包括中央控制系统，所述中央控制系统与所述环境参数检测单元、所述分离操作单元、所述压力控制单元及所述注液单元的各电子部件均电性连接。

如上所述的单菌落自动筛分的系统，进一步地，所述压力控制单元包括连接有增压泵的空压机、以及连接在所述空压机的出口的储气罐，所述储气罐通过带有调压阀的进气通道连接至所述分离操作单元。

第二方面，本发明提供一种单菌落自动筛分的方法，其利用上述的单菌落自动筛分的系统进行，其包括以下步骤：

S1：对分离操作单元进行清洗灭菌，并在培养皿中装入培养基；

S2：通过压力控制单元往分离操作单元内注入气体，使得分离操作单元中的压力值与微生物富集环境的压力值一致；

S3：开启温度控制单元，使得分离操作单元获得与微生物富集环境一致的温度；

S4：由注液单元的喷酒装置向分离操作单元内的培养基表面喷洒单个微生物菌液；

S5：喷洒分离的单个微生物将在培养基上生长，通过观察区进行实时观察单菌落的形成情况；

S6：挑选单个菌落形成时，先安装好取样单元，使取样单元与分离操作单元的温度、压力保持一致；

S7：控制三轴移动机构上Z轴的机械臂卡紧枪头，再用枪头尖端蘸取培养基上的单个菌落，将菌落送入装有液体培养基的培养釜内，实现单个菌落的保温保压转移培养；

S8：重复步骤S6，并更换装有液体培养基的培养釜，获得多个单菌落的培养。

本发明与现有技术相比，其有益效果在于：

1、本发明可以在海洋原位的温度和压力环境条件下，对海洋微生物进行在人为可控条件下的多培养基自动分离和纯化培养，解决了现有室内纯培养技术方法脱离海洋微生物生存的高压与极端温度环境条件而导致大量微生物不能实现纯培养的难题。

2、相对于现有的分离培养技术，本发明可以通过设置喷洒装置的喷口的孔径大小，实现不同直径微生物单菌落的分离，同时培养适应不同营养环境的单个微生物，并获得多个单菌落微生物，另外还可进行规模化分离培养，提高难培养微生物的筛选效率，提高有特殊功能的工程菌的筛选和培育效率。

3、本发明实现全自动化的筛分单菌落，可以大幅度提高在高压环境下微生物单菌落的分选效率，同时，培养皿设有多个不同分区，分区内装有不同营养的培养基，可以实现一次喷洒筛分出数株不同类型的单菌落。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图进行简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例的深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统的结构示意图；

图2为本发明实施例的分离操作单元的俯视图；

图3为本发明实施例的培养皿的结构示意图；

图4为图1所示的深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统的分离操作单元与取样单元连接处的局部放大图；

图5为本发明实施例的中央控制系统的模块连接示意图；

图6为本发明实施例的深海保温保压单菌落高通量自动筛分方法的流程图。

其中：1、中央控制系统；21、箱体底座；2111、培养皿；2112、卡箍；22、盖体；2211、观察装置；2212、可视窗；222、分离操作区；2221、三轴移动机构；22211、机械臂；23、枪头盒；231、枪头；232、枪头架；31、温度传感器；32、压力传感器；4、压力控制单元；41、空压机；42、增压泵；43、储气罐；44、调压阀；51、微生物富集釜；52、送液管道；53、微注泵；54、喷洒装置；541、喷口；55、过滤装置；61、培养釜；62、取样管道；621、卡口结构；7(e)、第一阀门；7(f)、第二阀门；7(d)、放空阀；7(b)、第三阀门；7(c)、第四阀门；7(a)、第五阀门；8、快捷拆装结构。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例：

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，本发明实施例的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个、三个等，除非另有明确具体的限定。此外，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

参见图1至图5，本发明提供一种深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统，其通过在高压环境下，在微生物富集釜51与分离操作单元构建微生物在海洋环境生活的高压与极端温度环境条件，提高原位微生物的生存活性。随后通过在分离操作单元内设置个性化培养基筛分单个微生物菌落，同时结合取样单元挑选单个微生物菌落并在高压与极端温度环境条件下培养单个微生物菌落，最终获得单个微生物菌落的富集液和代谢产物。并且通过更换单菌落培养釜61，可形成一定数量单个微生物菌落的高效分离工艺。本发明的装置可以包括：置于设定恒温环境的分离操作单元、注液单元、取样单元、压力控制单元4以及环境参数检测单元，其中，置于设定恒温环境的分离操作单元具有封闭的分离操作区222，在分离操作区222中设有一三轴移动机构2221和至少一枪头盒23，枪头盒23内放置有多个枪头231，三轴移动机构2221的移动Z轴设有一用于从枪头盒23中提取枪头231的机械臂22211，三轴移动机构2221的移动XY轴平面区域还放置有培养区，培养区上设置有固定的培养皿2111，培养皿2111设有多个装有不同营养配比的培养基的分区；注液单元具有微生物富集釜51和喷洒装置54，微生物富集釜51通过送液管道52连接到分离操作区222的上方的喷洒装置54，喷洒装置54的喷口541朝向培养区；取样单元具有一端连接在分离操作区222底部的取样管道62，取样管道62内设有将枪头231从机械臂22211拆分的卡口结构621，取样管道62的另一端通过快捷拆装结构8连接有设定压力的培养釜61；压力控制单元4用于给分离操作区222提供设定压力环境；环境参数检测单元用于检测分离操作区222内的各物理参数。具体地，通过将分离操作单元置于设定恒温环境中，通过压力控制单元4给分离操作区222注入气体增压，使得本发明的装置能在海洋原位的温度和压力环境条件下进行操作。菌液通过喷洒装置54的喷口541形成单个菌落，并均匀地喷洒在培养皿2111中的培养基上，再通过培养皿2111中不同营养配比的培养基进行筛选，得到纯培养菌株，再通过分离操作单元内的三轴移动机构2221成功挑选单个微生物，并保温保压培养单个微生物菌落。本发明实施例可以在海洋原位的温度和压力环境条件下，对海洋微生物进行在人为可控条件下的多培养基自动分离和纯化培养，解决了现有室内纯培养技术方法脱离海洋微生物生存的高压与极端温度环境条件而导致大量微生物不能实现纯培养的难题。另外，本实施例还可以通过设置喷洒装置54的喷口541的孔径大小，实现不同直径微生物单菌落的分离，同时培养适应不同营养环境的单个微生物，并获得多个单菌落微生物，此外还可进行规模化分离培养，提高难培养微生物的筛选效率，提高有特殊功能的工程菌的筛选和培育效率。同时，本发明实现全自动化的筛分单菌落，可以大幅度提高在高压环境下微生物单菌落的分选效率，培养皿2111采用不同分区，分区内装有不同营养的培养基，可以实现一次喷洒筛分出数株不同类型的单菌落。

参见图1，图1展示了一种深海保温保压单菌落高通量自动筛分的系统，其可以包括：分离操作单元、取样单元、注液单元、中央控制系统1、分离操作单元、环境参数检测单元和压力控制单元4，其中，注液单元可以包括：微生物富集釜51、送液管道52、微注泵53、喷洒装置54和过滤装置55，微生物富集釜51用于微生物菌液的富集，过滤装置55位于微生物富集釜51和微注泵53之间的管道上，且过滤装置55内安装有一定孔径的多级滤膜，多级滤膜可以由多个不同孔径的滤膜组成，主要用于过滤水体中杂质和不同直径的微生物，进而获得需要的微生物直径。另外，微生物富集釜51与过滤装置55之间还设有第五阀门7(a)。注液单元的输出端通过送液管道52与分离操作单元连接，微注泵53设置在送液管道52上。喷洒装置54可以喷洒菌液的范围不大于培养皿2111的直径，喷洒装置54设有一定直径并规则排列的喷口541，喷口541可以为圆形孔径，且为方便单个微生物可以均匀喷洒在培养基上，该圆形孔径的直径与需要微生物的直径保持一致。本实施例中通过设置喷洒装置54的喷口541的孔径大小，可以实现不同直径微生物单菌落的分离。

参见图1-图3，在某些实施例中，分离操作单元可以包括箱体底座21和盖体22，箱体底座21和盖体22通过卡扣进行密封连接，连接后的装置可以是类似圆柱体状，也可以是多边体状，并在两者内部形成分离操作区222；箱体底座21侧壁的中下部装有取样装置的枪头盒23，枪头盒23的上部设有枪头架232，枪头架232上设有规则排列的圆孔，该圆孔的直径与枪头231中上部外形尺寸相匹配，枪头231可以是类似圆台形，且枪头231为圆台形且内部为空心。进一步地，盖体22设有观察区，观察区设有可视窗2212，可视窗2212可以是圆形的，可视窗2212设置在盖体22中央，其主要为方便对分离操作单元的分离操作区222进行观察；另外可视窗2212上部设有观察装置2211，观察装置2211用于对分离操作区222进行辅助观察。进一步地，观察装置2211可以包括无影灯和显微镜，无影灯主要为防止观察过程形成的阴影，从而阻碍单菌落观察，显微镜主要用于对微生物进行观察和识别，示例性地，利用高分辨率光学显微镜的光学观察模块作为观察装置2211，可以对微生物进行观察和识别，从而初步判定该单菌落是否为研究人员需要的目标微生物或该菌落是否为单个菌落，同时也可以用于拍摄高压环境中单菌落的形成过程(如颜色、形态、大小等)，方便后续对单个菌落进行挑选。进一步地，分离操作区222中安装有三轴移动机构2221，三轴移动机构2221有X、Y、Z三个轴，X、Y、Z三个轴均可通过中央控制系统1在分离操作单元内的六个自由度内活动；三轴移动机构2221的移动Z轴设有机械臂22211，机械臂22211的底端为实心的倒圆台形，倒圆台的底部直径和枪头231底端的内径保持一致，确保移动Z轴可以使枪头231插入Z轴的倒圆台内，最后通过移动X、Y、Z轴，使得Z轴上枪头231的顶端可以接触到单个微生物菌落，实现微生物单个菌落取样操作。进一步地，培养区中设置有培养皿2111，培养皿2111与培养区通过卡箍2112固定；培养皿2111的内部均匀设有多个不同的分区，分区内装有不同营养配比的培养基，主要用于对喷洒后单个微生物提供营养物质。本实施例中，培养皿2111设有多个不同分区，分区内装有不同营养的培养基，可以实现一次喷洒筛分出数株不同类型的单菌落，从而大幅度提高在高压环境下微生物单菌落的分选效率。

参见图4，在某些实施例中，取样单元可以包括培养釜61和取样管道62，培养釜61通过取样管道62与分离操作单元连接；取样管道62内设有将枪头231从机械臂22211拆分的卡口结构621，取样管道62的另一端通过快捷拆装结构8连接有设定压力的培养釜61。进一步地，快捷拆装结构8和卡口结构621之间设有第一阀门7(e)；快捷拆装结构8与培养釜61之间设有第二阀门7(f)，第二阀门7(f)主要用于保存培养釜61内的压力。进一步地，卡口结构621为向下倒立的闭合花瓣，闭合花瓣的顶端为圆形，且该圆形的直径稍微小于移动系统Z轴的机械臂22211的倒圆台形的底部直径，主要为了保证枪头231蘸取的菌落不会接触到花瓣结构，同时，当枪头231进入取样管道62后，可以通过移动Z轴使得枪头231被花瓣结构卡住，进而枪头231自动脱落；取样管道62、第一阀门7(e)和第二阀门7(f)的内径均大于枪头盒23内枪头231最宽处的外形尺寸，主要为了枪头231可以伸入取样管道62内，将枪头231底部蘸取的单个菌落保压转移到装有液体培养基的培养釜61中。

另外，每转移完一个单菌落，即可关闭第一阀门7(e)和第二阀门7(f)，再通过快捷拆装结构8连接下一个培养釜61，通过移动系统的Z轴控制拿取位于枪头盒23内的枪头231，进行下一次单菌落挑选，以此类推就可完成在保压状态下的多个单菌落的分离培养。每次更换培养釜61所出现的压力差，均可通过压力控制单元4控制并补充相应的压力。本实施例可进行规模化单菌落筛分和保温、保压培养，减少人力成本，实现海洋微生物在原位压力和温度环境条件下的自动化分离培养，为海洋微生物原位条件纯培养提供重要技术手段。

参见图1、图5，在某些实施例中，还包括中央控制系统1，中央控制系统1与环境参数检测单元、分离操作单元、压力控制单元4及注液单元均电性连接。环境参数检测单元设置在分离操作单元内部，采用温度传感器31和压力传感器32实时检测分离操作单元内的温度、压力变化情况，并将数据传输至中央控制系统1；压力控制单元4与分离操作单元连接，压力控制单元4主要是用于向分离操作单元注入气体增压，使得分离操作单元内的压力环境与微生物在海洋原位所处的压力值一致。压力控制单元4主要包括空压机41、增压泵42、储气罐43、调压阀44及管阀件等配件组成。注液单元用于向分离操作单元内注入富集后分散的微生物菌液；取样单元用于对微生物进行保压取样；观察区的数据输出端与中央控制系统1电性连接。分离操作单元的恒温条件维持主要是通过在周围环境条件条件主动制冷/热单元。示例性地，将分离操作单元安放于温度监控的冷库中，通过与空气的热交换作用，维持分离操作单元内的恒温状态。进一步地，分离操作单元的顶部设置有进气通道，进气通道上均设置有放空阀7(d)、第三阀门7(b)和第四阀门7(c)，通过进气通道注入培养需要的气体，向密闭式分离操作单元内增压，实现分离操作单元内的压力值与深海实际情况一致。

参见图6，基于同一发明构思，本发明还提供一种深海保温保压单菌落高通量筛分的方法，其主要包括微生物富集、单菌落分离和单菌落培养三个步骤。本方法通过高压环境富集培养，得到纯度较高的菌群后，在保压情况下进入分离操作单元进行固体培养分离，并且通过不同培养基和环境条件的组合工艺同时筛选，得到纯培养菌株。本方法主要包括以下步骤：

S1：对分离操作单元进行清洗灭菌，并在培养皿2111中装入培养基。

具体地，打开分离操作单元的盖体22和箱体底座21，分别用75％酒精擦拭，待酒精完全挥发后，再置于紫外下灭菌15min。待灭菌结束，在箱体底座21内放置已经灭菌的培养皿2111和枪头231，并且培养皿2111上的每个分区装有不同营养配比的液体培养基，待液体培养基凝固后，再将培养皿2111固定在箱体底座21上，最后将箱体底座21和盖体22通过旋转的方式合并。且在过滤装置55中装入相应的滤膜。

S2：通过压力控制单元4往分离操作单元内注入气体，使得分离操作单元中的压力值与微生物富集环境的压力值一致。

具体地，将微生物富集釜51和分离操作单元相连，此时关闭第五阀门7(a)。根据微生物富集釜51内的压力值确定分离操作单元内的压力值，通过压力控制单元4往分离操作单元内注入气体，使分离操作单元内的压力值与微生物富集釜51一致。

S3：开启温度控制单元，使得分离操作单元获得与微生物富集环境一致的温度。

具体地，根据微生物富集釜51内的温度值确定分离操作单元内的温度值，通过将分离操作单元置于温度监控的冷库内获得与微生物富集釜51内一致的温度。随后调试好观察装置2211的位置，使其能清楚观测到箱体底座21内部培养基上的情况。

S4：由注液单元的喷酒装置向分离操作单元内的培养基表面喷洒单个微生物菌液。

具体地，打开微生物富集釜51和分离操作单元之间的第五阀门7(a)，将微生物富集釜51内的菌液通过过滤装置55过滤掉杂质和其他非目标直径的微生物，再由微注泵53给过滤后的菌液提供一定的动力，使菌液到达喷洒装置54时可以在喷口541内形成喷射状的单个微生物菌液，该微生物菌液完全落入培养皿2111内，最终实现单个菌落的分离。

S5：喷洒分离的单个微生物将在培养基上生长，通过观察区进行实时观察单菌落的形成情况。具体地，在整个过程中通过盖体22上的可视窗2212及观察装置2211进行观察，当培养基上有单个菌落形成时，即可以开始进行单菌落挑选工作。

S6：挑选单个菌落形成时，先安装好取样单元，使取样单元与分离操作单元的温度、压力保持一致。

具体地，在分离单个菌落之前，首先将培养釜61和液体培养基在高压灭菌锅内进行灭菌处理。每个培养釜61内的液体培养基与培养皿2111内的不同分区的固体培养基含有的营养成分一致，本质区别在于培养皿2111内的不同分区的固体培养基上加入具有凝固功能的琼脂，而液体培养基则没有。通过打开第二阀门7(f)将装入液体培养基的培养釜61与压力注入单元连接，并在培养釜61内冲入与分离操作单元一样的压力，冲压结束即可关闭第二阀门7(f)。随后将培养釜61与分离操作单元通过快捷拆装结构8连接，并打开第一阀门7(e)和第二阀门7(f)。

S7：控制三轴移动机构2221上Z轴的机械臂22211卡紧枪头231，再用枪头231尖端蘸取培养基上的单个菌落，将菌落送入装有液体培养基的培养釜61内，实现单个菌落的保温保压转移培养。

具体地，通过中央控制系统1移动三轴移动机构2221的X、Y、Z轴，使其Z轴的机械臂22211可以插入位于枪头盒23内的单个枪头231，再通过中央控制系统1移动三轴移动机构2221的X、Y、Z轴，使Z轴的机械臂22211的单个枪头231可以蘸取到位于固体培养基上的单个菌液，继续通过中央控制系统1移动三轴移动机构2221的X、Y、Z轴，使其蘸取有单菌落的枪头231可以进入取样管道62，当枪头231与Z轴底端的连接处完全通过花瓣结构后，再通过中央控制系统1移动三轴移动机构2221的X、Y、Z轴，提升三轴移动机构2221的Z轴，使得枪头231与Z轴的机械臂22211在卡口结构621的花瓣的作用下自动掉落，自动掉落的枪头231进入到培养釜61内，最后再通过中央控制系统1移动三轴移动机构2221提升三轴移动机构2221的Z轴，使得Z轴完全位于分离操作单元内，此时关闭第一阀门7(e)和第二阀门7(f)，即完成一次单菌落的保压转移，保压转移后的培养釜61放置在与分离操作单元一致温度的环境内培养。

S8：重复步骤S6，并更换装有液体培养基的培养釜61，获得多个单菌落的培养。具体地，按照上述的操作步骤，以此类推，第二次单菌落也按照上述方式进行，即可完成多类型的单菌落保温保压培养。

需要指出的是，在整个挑选和培养过程中，保持分离操作单元内的压力、温度值与微生物最初所在的高压富集系统内的压力、温度环境一致；另外，固体培养基上面不同分区的培养基的营养与培养釜61内的培养基的营养应保持一一对应，最后使得微生物在原位高压低温情况下实现单菌落的分离和培养。整个培养过程中的各项参数条件将通过数据采集与显示系统进行数据采集、集成和显示。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种单菌落自动筛分的系统，其特征在于，包括：

置于设定恒温环境的分离操作单元，其具有封闭的分离操作区，在所述分离操作区中设有一三轴移动机构和至少一枪头盒，所述枪头盒内放置有多个枪头，所述三轴移动机构的移动Z轴设有一用于从所述枪头盒中提取枪头的机械臂，所述三轴移动机构的移动XY轴平面区域还放置有培养区，所述培养区上设置有固定的培养皿，所述培养皿设有多个装有不同营养配比的培养基的分区；

注液单元，其具有微生物富集釜和喷洒装置，所述微生物富集釜通过送液管道连接到所述分离操作区的上方的所述喷洒装置，所述喷洒装置的喷口朝向所述培养区；

取样单元，其具有一端连接在所述分离操作区底部的取样管道，所述取样管道内设有将所述枪头从所述机械臂拆分的卡口结构，所述取样管道的另一端通过快捷拆装结构连接有设定压力的培养釜；

压力控制单元，其用于给所述分离操作区提供与微生物在海洋原位相仿的压力环境；以及，

环境参数检测单元，其用于检测所述分离操作区内的各物理参数，其中，

所述分离操作单元包括箱体底座和盖体，所述盖体通过卡扣扣合在所述箱体底座上进而在两者内部形成所述分离操作区，所述枪头盒的上部设有枪头架，所述枪头架上设有规则排列的圆孔，该圆孔的外形尺寸与所述枪头的中上部外形尺寸相匹配，所述枪头为圆台形且内部为空心，所述机械臂的底端为实心的倒圆台形，所述机械臂的底端与枪头最宽处的内部尺寸相匹配；所述卡口结构为若干向下倒立的闭合花瓣，闭合花瓣的顶端外形尺寸小于所述机械臂的底端的外形尺寸，所述快捷拆装结构与所述卡口结构之间设有第一阀门，所述快捷拆装结构与所述培养釜之间设有第二阀门，所述取样管道、所述阀门和所述阀门的内径均大于所述枪头的最宽处的外形尺寸；

所述送液管道上设有过滤装置和微注泵，其中，所述过滤装置设置于所述微生物富集釜和所述微注泵之间的管道上，且所述过滤装置内安装有设定孔径的多级滤膜，所述多级滤膜由多个不同孔径的滤膜组成；所述喷口具有设定直径并规则排列，且所述喷口具有与喷洒菌液相匹配的圆形孔径，所述喷洒装置的喷洒菌液的范围不大于培养皿的直径。

2.根据权利要求1所述的单菌落自动筛分的系统，其特征在于，所述盖体设有观察区，所述观察区设有可观察到所述分离操作区的可视窗，所述观察区上方还设有辅助观察所述分离操作区的观察装置。

3.根据权利要求1所述的单菌落自动筛分的系统，其特征在于，所述环境参数检测单元包括设置在所述分离操作区内的温度传感器和压力传感器，所述温度传感器用于实时检测分离操作单元内的温度变化情况，所述压力传感器实时检测分离操作单元内的压力变化情况。

4.根据权利要求2所述的单菌落自动筛分的系统，其特征在于，所述观察装置包括显微镜和无影灯，所述显微镜的观察镜头朝向所述可视窗，用于对所述分离操作区内的微生物进行观察和识别，所述无影灯用于防止观察和识别的过程而形成的阴影。

5.根据权利要求1所述的单菌落自动筛分的系统，其特征在于，还包括中央控制系统，所述中央控制系统与所述环境参数检测单元、所述分离操作单元、所述压力控制单元及所述注液单元的各电子部件均电性连接。

6.根据权利要求1所述的单菌落自动筛分的系统，其特征在于，所述压力控制单元包括连接有增压泵的空压机、以及连接在所述空压机的出口的储气罐，所述储气罐通过带有调压阀的进气通道连接至所述分离操作单元。

7.一种单菌落自动筛分的方法，其利用权利要求1-6任一项所述的单菌落自动筛分的系统进行，其特征在于，包括：

S1：对分离操作单元进行清洗灭菌，并在培养皿中装入培养基；

S2：通过压力控制单元往分离操作单元内注入气体，使得分离操作单元中的压力值与微生物富集环境的压力值一致；

S3：开启温度控制单元，使得分离操作单元获得与微生物富集环境一致的温度；

S4：由注液单元的喷酒装置向分离操作单元内的培养基表面喷洒单个微生物菌液；

S5：喷洒分离的单个微生物将在培养基上生长，通过观察区进行实时观察单菌落的形成情况；

S6：挑选单个菌落形成时，先安装好取样单元，使取样单元与分离操作单元的温度、压力保持一致；

S7：控制三轴移动机构上Z轴的机械臂卡紧枪头，再用枪头尖端蘸取培养基上的单个菌落，将菌落送入装有液体培养基的培养釜内，实现单个菌落的保温保压转移培养；

S8：重复步骤S6，并更换装有液体培养基的培养釜，获得多个单菌落的培养。