CN109097319A - 一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法及番石榴叶悬浮细胞的应用 - Google Patents

一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法及番石榴叶悬浮细胞的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)采集番石榴成熟叶片，洗净后进行表面灭菌处理，切块得到外植体；(2)将外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养得到愈伤组织；(3)将愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行继代培养得到增殖愈伤组织；(4)将增殖愈伤组织接种至液体培养基中进行继代培养，培养过程中保持振荡，继代培养更换培养液时，用吸管取出单细胞或小细胞团进行下一代振荡培养；最终得到只含有单细胞或小细胞团的培养物，将这些培养物混匀即得到番石榴叶悬浮细胞。本发明还提供一种上述番石榴叶悬浮细胞的应用。本发明的方法具有生产成本低、生产周期短、生产效率高等优点。

Description

一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法及番石榴叶悬浮细胞的 应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法及应用。
背景技术
植物细胞悬浮培养是植物细胞生长的微生物化。由于其分散性好，细胞形状及细胞团的大小大致相同，而且生长迅速，重复性好，易于控制的有利因素，被广泛运用于生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及遗传学、分子生物学的研究。它可以直接用于原生质体分离、培养与杂交以及用来生产次级代谢产物，悬浮细胞培养技术已经成为植物生物技术中最为有用的手段之一。植物细胞悬浮培养已经广泛应用于育种和生产次级代谢产物，在生物工程中发挥着重要的作用。
番石榴叶中含有丰富的营养物质，新鲜成熟的番石榴叶中含有较高的蛋白质和可溶性糖。同时含有黄酮类、多酚类、三萜类、杂源萜类、挥发油、植物多糖等功能活性成分。研究表明番石榴叶提取物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗微生物、抗腹泻、抗肿瘤及保护肝脏的作用。
利用番石榴叶进行组织培养技术及植物细胞悬浮培养技术，可以实现番石榴叶次生代谢产物的工业化生产，它的产量高，生产周期短，成本低，生产过程可以人为控制，不受环境如气候，季节、土壤等因素的影响。番石榴叶的悬浮细胞的制备目前是一项空白的领域，具有很高的开发和应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种生产成本低、生产周期短、生产效率高的番石榴叶悬浮细胞的培养方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)采集番石榴成熟叶片(靠近顶芽且充分展开的叶片)，洗净后进行表面灭菌处理，切块(每块材料需带有中脉)得到外植体；
(2)将步骤(1)中得到的外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养得到愈伤组织；优选的，上述愈伤组织为经过筛选出的颜色、质地均一，疏松而无定型的愈伤组织；
(3)将步骤(2)中得到的愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行继代培养得到增殖愈伤组织；
(4)将步骤(3)中得到的增殖愈伤组织(优选为疏松的增殖愈伤组织)接种至液体培养基中进行继代培养，培养过程中保持振荡，继代培养更换培养液时，用吸管(规格为2mL)取出单细胞或小细胞团进行下一代振荡培养；最终得到只含有单细胞或小细胞团的培养物，将这些培养物混匀即得到番石榴叶悬浮细胞。
上述培养方法中，优选的，所述步骤(1)中，洗净后进行表面灭菌处理包括以下步骤：将番石榴叶片用流水冲洗，用洗衣粉溶液(优选质量浓度为0.1％)漂洗3min，再用流水反复冲洗，然后在超净工作台用75％的酒精浸泡10-15s，无菌水冲洗后，再用0.1％的升汞溶液消毒5-10min，再次用无菌水冲洗。
上述培养方法中，优选的，所述愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中加入1.0mg/L6-BA、1.0mg/L 2,4-D、1.0mg/LNAA，所述MS培养基中添加蔗糖30-40g/L，琼脂7g/L，所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8-6.0。
上述培养方法中，优选的，所述步骤(2)中，诱导培养得到愈伤组织的培养条件为：培养温度为23-27℃，以日光灯为光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间控制为12h/d，培养30天。
上述培养方法中，优选的，所述愈伤组织增殖培养基为在MS培养基中加入0.1mg/LKT与1.0mg/L 2,4-D，所述MS培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8-6.0。
上述培养方法中，优选的，所述步骤(3)中，继代培养得到增殖愈伤组织的培养条件为：培养温度为23-27℃，以日光灯为光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间控制为12h/d，每30天继代一次，继代3-5次。
上述培养方法中，优选的，所述液体培养基为在MS培养基中加入0.1mg/L KT与1.0mg/L2,4-D，所述MS培养基中添加蔗糖30g/L，所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8-6.0。
上述培养方法中，优选的，所述步骤(4)中，继代培养的培养条件为：接种量为3g/25mL、培养温度为23-27℃，暗培养或弱光培养，摇床转速为110-120rpm，继代培养的次数为3-4次，每12天继代一次。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的培养方法得到的番石榴叶悬浮细胞的应用，将所述番石榴叶悬浮细胞用于生产次生代谢产物，生产次生代谢产物的过程在番石榴次生代谢产物培养用装置中进行，所述番石榴次生代谢产物培养用装置包括培养罐体、培养液储罐与多层培养架；所述培养罐体包括外培养罐与设于所述外培养罐内的内培养罐，所述培养液储罐包括第一培养液储罐与第二培养液储罐，所述多层培养架包括可拆卸固设于所述内培养罐内的圆形培养架和可拆卸固设于所述外培养罐内的环形培养架；所述内培养罐通过第一连接管与第一培养液储罐连通形成第一密闭空间，所述外培养罐通过第二连接管与第二培养液储罐连通形成第二密闭空间，且所述第一密闭空间与所述第二密闭空间互不连通；所述内培养罐上设有用于通过气压调节第一培养液储罐中培养液是否进入内培养罐的第一气压调节系统，所述外培养罐上设有用于通过气压调节第二培养液储罐中培养液是否进入外培养罐的第二气压调节系统。上述第一连接管、第二连接管要保证其末端靠近第一培养液储罐与第二培养液储罐的底部，以便通过压力控制培养液是否进入内、外培养罐。
上述应用中，优选的，所述内培养罐上还设有用于与所述第一气压调节系统相配合、控制所述内培养罐内气压的第三气压调节系统；所述外培养罐上还设有用于与所述第二气压调节系统相配合、控制所述外培养罐内气压的第四气压调节系统。第三气压调节系统和第四气压调节系统分别与第一气压调节系统和第二气压调节系统相配合，能起到进一步稳定罐内气压的作用，可调节培养液进入量并维持内培养罐与外培养罐气压，使培养罐内培养环境处于较稳定状态，在促进番石榴叶悬浮细胞生长的同时，使培养罐内番石榴叶悬浮细胞大小较为均一，便于后续回收处理。本发明中，一般优选使培养液的高度达到罐体装置的1/2以上，更优选培养液高度为罐体的1/2-2/3。
上述应用中，优选的，所述第一气压调节系统包括连接端口一、空气过滤器一、泵一及用于依据罐内气压控制泵一开启或关闭的控制器一，所述空气过滤器一通过连接端口一与内培养罐连接，所述泵一与空气过滤器一连接；所述第二气压调节系统包括连接端口二、空气过滤器二、泵二及用于依据罐内气压控制泵二开启或关闭的控制器二，所述空气过滤器二通过连接端口二与外培养罐连接，所述泵二与空气过滤器二连接；所述第三气压调节系统包括连接端口三、空气过滤器三与排气阀三，所述空气过滤器三通过连接端口三与内培养罐连接，所述排气阀三位于所述空气过滤器三的进气端；所述第四气压调节系统包括连接端口四、空气过滤器四与排气阀四，所述空气过滤器四通过连接端口四与外培养罐连接，所述排气阀四位于所述空气过滤器四的进气端。本发明中，所有空气过滤器的过滤孔径优选为0.22μm。所有控制器的作用在于控制相应泵的开启与关闭，以实现培养液是否进入内培养罐或外培养罐。可以通过改变控制器的程序控制，实现泵的间歇工作或连续工作，以实现间歇培养或连续培养。
上述应用中，当内培养罐(或外培养罐)内气压过高时，开启第一气压调节系统(或第二气压调节系统)的泵，将罐内气体抽出，气压降低并引入培养液。当内培养罐(或外培养罐)内气压过低时，开启第三气压调节系统(或第四气压调节系统)的排气阀，使罐内气体与空气接触，升高气压。上述应用中，优选的，排气阀三也与控制器一连接，并受控制器一控制其开启与否，用于与泵一协同作用，用于稳定内培养罐内的气压；排气阀四也与控制器二连接，并受控制器二控制其开启与否，用于与泵二协同作用，用于稳定外培养罐内的气压。
上述应用中，优选的，所述内培养罐设于所述外培养罐的中上部，其二者的竖直中心轴线相互重叠。内培养罐设于外培养罐的中上部，使外培养罐下部空间具有一定容纳培养液的空间，也使于装设混合搅拌装置。其二者的竖直中心轴线相互重叠便于环形培养架的装设。
上述应用中，优选的，所述外培养罐的底部设有桨叶搅拌装置(优选的，第一连接管为桨叶搅拌装置的转轴)。上述番石榴次生代谢产物培养用装置中，通过第二气压调节系统可以实现第二培养液储罐内的培养液与环形培养架上的培养组织接触与否，但此时，第二培养液储罐内的培养液的用量会很大。利用桨叶搅拌装置的离心力，可使进入外培养罐内的培养液与环形培养架上的培养组织接触，可通过桨叶搅拌装置的转速、转动时间等控制进入外培养罐中的培养液与环形培养架上的培养组织接触的时间，这样可以大大减小第二培养液储罐内的培养液的用量。
上述应用中，优选的，所述内培养罐的底部呈倒锥形，所述第一连接管设于所述倒锥形的尖部，所述第一连接管与内培养罐连接处设有滤网；所述第二连接管设于所述外培养罐的底部，所述第二连接管与外培养罐连接处设有滤网。滤网的存在，可以避免从培养架上掉落的培养组织进入培养液中。
上述应用中，优选的，所述圆形培养架包括多块圆形隔片和用于将圆形隔片固定的支柱，所述环形培养架包括多层块环形隔片和用于将圆形隔片固定的支柱，所述每块圆形隔片和环形隔片底部均设有用于防止培养组织从隔片上掉落的生物滤膜。生物滤膜的存在，可以减小培养组织从培养架上掉落，也可以增大培养组织的附着面积，扩大培养量。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置的尺寸可以依据需要改变，以适用培养需求。第一气压调节系统、第二气压调节系统、第三气压调节系统与第四气压调节系统与罐体的连接方式也可灵活多变，只在能实现本发明目的即可。
上述番石榴次生代谢产物培养用装置还包括有辅助装置，其包括加热装置，用以提供培养液的温度控制；光照装置，用以保证培养时的光照；CO2输入装置，可与泵进气口相连，以调整通入培养罐内的空气组分，使番石榴叶悬浮细胞生长更加健壮；传感探针，可实时监测培养液中的pH及各种成分的变化，以便于更好的控制培养环境。
以内培养罐为例，当把番石榴叶悬浮细胞接种到圆形培养架上后，开启第一气压调节系统，内培养罐内的气压在泵的作用下会降低，此时第一培养液储罐内的液体会进入内培养罐，从而与圆形培养架上的番石榴叶悬浮细胞接触达到培养的目的。当需要将培养液与番石榴叶悬浮细胞分离时，只需将内培养罐内的气压恢复至常压即可，此时培养液在重力作用下会返回第一培养液储罐。通过改变控制器的程序，可以实现连续操作或实现精准控制的间歇操作。
上述应用中，培养液提供的环境可根据番石榴叶悬浮细胞的特性进行选择，可选择合适的培养环境(便于增殖)、逆境胁迫环境或添加诱导因子等(便于生产次生代谢产物)，培养液可以在培养中途改变。
上述应用中，优选的，将所述番石榴叶悬浮细胞用于生产次生代谢产物，所述番石榴叶悬浮细胞为经过筛选(根据番石榴叶悬浮细胞的增殖速率)的高产细胞系。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、利用本发明可以获得番石榴叶悬浮细胞并用于生产次级代谢产物，可以不受自然环境条件的限制，生产成本低、生产周期短、生产效率高。
2、本发明获得的番石榴叶悬浮细胞品质较为均一，便于后续的扩大培养再利用。
3、本发明在利用番石榴叶悬浮细胞生产次生代谢产物时，所用的装置包括内培养罐与外培养罐，其分别形成两个独立的培养环境，可以很容易达到以下效果：1)利用同一装置即可实现两种番石榴叶悬浮细胞的同时培养，可大大减小培养时间，提高培养效率；2)培养同一番石榴叶悬浮细胞时，在内外培养罐中加入不同的培养液时，可以得到不同的次生代谢产物，培养环境易于控制，易于实现特定培养环境以得到特定次生代谢产物，培养效率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中番石榴次生代谢产物培养用装置的拆分结构示意图。
图2为实施例1中番石榴次生代谢产物培养用装置的结构示意图。
图3为实施例1中扩大培养时采用不同的培养时间对最终悬浮细胞的干重的影响。
图4为实施例1与对比例16-20中液体培养基中添加的激素用量对最终悬浮细胞的干重的影响。
图5为实施例1与对比例21-25采用不同的摇床转速对最终悬浮细胞的干重的影响。
图6为实施例1与对比例26-28中采用不同的接种量对最终悬浮细胞的干重的影响。
图例说明：
101、空气过滤器一；102、空气过滤器二；103、空气过滤器三；104、空气过滤器四；201、连接端口一；202、连接端口二；203、连接端口三；204、连接端口四；4、内培养罐；5、外培养罐；6、圆形培养架；7、环形培养架；8、第二连接管；9、第一连接管；10、搅拌装置；11、密封盖一；12、第一培养液储罐；13、密封盖二；14、第二培养液储罐；1501、泵一；1502、泵二；1601、控制器一；1602、控制器二；1703、排气阀三；1704、排气阀四；20、一体盖。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)采集靠近顶芽且充分展开的番石榴成熟叶片，用流水冲洗1h，用质量浓度为0.1％的洗衣粉溶液漂洗3min，再用流水反复冲洗，然后在超净工作台用75％的酒精浸泡15s，无菌水冲洗3次后，再用0.1％的升汞溶液消毒8min，再次用无菌水冲洗5次，将叶片切成0.5cm×0.5cm，得到外植体，切块时，每块上需带有中脉；
(2)将步骤(1)中得到的外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，筛选出颜色、质地均一，疏松而无定型的愈伤组织；其中，愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中加入1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、1.0mg/LNAA，MS培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8；培养条件为：培养温度为25℃，以日光灯为光源，光照强度为1000lx，光照时间控制为12h/d；培养30天后挑选其中颜色、质地均一、疏松而无定型的愈伤组织用于继代培养；
(3)将步骤(2)中得到的愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行继代培养得到增殖愈伤组织；其中，愈伤组织增殖培养基为在MS培养基中加入0.1mg/LKT与1.0mg/L 2,4-D，MS培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度为25℃，以日光灯为光源，光照强度为1200lx，光照时间控制为12h/d，30天继代一次，继代3次后，挑选其中颜色、质地均一、疏松而无定型的增殖愈伤组织用于悬浮培养；
(4)将步骤(3)中得到的增殖愈伤组织接种于含液体培养基的三角瓶中进行继代培养，培养过程中保持振荡，继代培养更换培养液时，先将三角瓶静置3min，用2mL吸管吸出单细胞或小细胞团和培养液于试管中，弃去大的细胞团，静止20min，用吸管吸出三角瓶大部分原液体培养基，只留下约5mL原液体培养基，把单细胞或小细胞团移置三角瓶，并加入新鲜培养基调整至25mL重新进行培养；最终得到只含有单细胞或小细胞团的培养物，将这些培养物混匀即得到番石榴叶悬浮细胞；其中，液体培养基为在MS培养基中加入0.1mg/LKT与1.0mg/L 2,4-D，MS培养基中添加蔗糖30g/L，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8；培养条件为：接种量为3g/25mL，培养温度为25℃，暗培养或弱光培养，摇床转速为120rpm，继代培养的次数为3次，12天继代一次。
本实施例的培养方法中，MS培养基的成分如下表1所示。
表1：MS培养基的成分
成分 含量(mg/L)
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 1650
KNO<sub>3</sub> 1900
CaCl·2H<sub>2</sub>O 440
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 370
KI 0.83
H<sub>2</sub>BO<sub>2</sub> 6.2
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 22.3
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.025
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 27.8
Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O 37.3
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.025
肌醇 100
烟酸 0.5
盐酸吡哆醇 0.5
盐酸硫胺素 0.1
甘氨酸 2
本实施例中，愈伤组织诱导培养基配制方法如下：以配置1L培养基为例，将先配置好的MS培养基母液按照比例称取，放于5L的烧杯中，按照1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D，+1.0mg/L NAA的浓度添加激素，30g/L的比例添加蔗糖，7.0/L添加琼脂，加入至煮沸纯水中搅拌均匀后，倒入5L烧杯中至刻度1L，并搅拌均匀后，用1mol/LNaOH调节pH至5.8，然后分装在组培瓶子中，116℃高压灭菌20min，充分冷却凝固，备用。
本实施例中，愈伤组织增殖培养基配制方法如下：以配置1L培养基为例，将先配置好的MS培养基母液按照比例称取，放于5L的烧杯中，按照0.1mg/L KT+1.0mg/L 2,4-D的浓度添加激素，30g/L的比例添加蔗糖，7.0/L添加琼脂，加入至煮沸纯水中搅拌均匀后，倒入5L烧杯中至刻度1L，并搅拌均匀后，用1mol/LNaOH调节pH至5.8，然后分装在组培瓶子中，116℃高压灭菌20min，充分冷却凝固，备用。
本实施例中，液体培养基配制方法如下：以配置1L培养基为例，将先配置好的MS培养基母液按照比例称取，放于5L的烧杯中，按照1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/LKT的浓度添加激素，30g/L的比例添加蔗糖，不加琼脂，加入至煮沸纯水中搅拌均匀后，倒入5L烧杯中至刻度1L，并搅拌均匀后，用1mol/LNaOH调节pH至5.8，然后分装在组培瓶子中，116℃高压灭菌20min，充分冷却凝固，备用。
利用本实施例中制备得到的番石榴悬浮细胞可用于生产次生代谢产物时，生产过程中所用到的番石榴次生代谢产物培养用装置，如图1、2所示，包括培养罐体(采用耐高温高压、透明的材料)、培养液储罐与多层培养架；培养罐体包括外培养罐5与设于外培养罐5内的内培养罐4(内培养罐4设于外培养罐5的中上部，其二者的竖直中心轴线相互重叠)，培养液储罐包括第一培养液储罐12与第二培养液储罐14，多层培养架包括可拆卸固设于内培养罐4内的圆形培养架6和可拆卸固设于外培养罐5内的环形培养架7(通过铁丝钩接于内培养罐4或外培养罐5的内壁，以免培养液的上升或下降导致培养架晃动)；内培养罐4通过第一连接管9与第一培养液储罐12连通形成第一密闭空间，外培养罐5通过第二连接管8与第二培养液储罐14连通形成第二密闭空间，且第一密闭空间与第二密闭空间互不连通；内培养罐4上设有用于通过气压调节第一培养液储罐12中培养液是否进入内培养罐4的第一气压调节系统，外培养罐5上设有用于通过气压调节第二培养液储罐14中培养液是否进入外培养罐5的第二气压调节系统。
本实施例的装置中，第一连接管9、第二连接管8要保证其末端靠近第一培养液储罐12与第二培养液储罐14的底部。
本实施例的装置中，内培养罐4上还设有用于与第一气压调节系统相配合、控制内培养罐4内气压的第三气压调节系统；外培养罐5上还设有用于与第二气压调节系统相配合、控制外培养罐5内气压的第四气压调节系统。
本实施例的装置中，第一气压调节系统包括连接端口一201、空气过滤器一101、泵一1501及用于依据罐内气压控制泵一1501开启或关闭的控制器一1601，空气过滤器一101通过连接端口一201与内培养罐4连接，泵一1501与空气过滤器一101连接；第二气压调节系统包括连接端口二202、空气过滤器二102、泵二1502及用于依据罐内气压控制泵二1502开启或关闭的控制器二1602，空气过滤器二102通过连接端口二202与外培养罐5连接，泵二1502与空气过滤器二102连接；第三气压调节系统包括连接端口三203、空气过滤器三103与排气阀三1703，空气过滤器三103通过连接端口三203与内培养罐4连接，排气阀三1703位于空气过滤器三103的进气端；第四气压调节系统包括连接端口四204、空气过滤器四104与排气阀四1704，空气过滤器四104通过连接端口四204与外培养罐5连接，排气阀四1704位于空气过滤器四104的进气端。
本实施例的装置中，外培养罐5与内培养罐4的顶部为带盖子的敞口结构。外培养罐5与内培养罐4的顶部平齐，其二者的盖子为一体结构，即一个一体盖20可以实现外培养罐5与内培养罐4的密封。第三气压调节系统的连接端口2设于盖子的顶部，第四气压调节系统的连接端口2设于外培养罐5的中上部，高于环形培养架7的顶部。第一气压调节系统与第二气压调节系统的连接端口2分别位于内培养罐4与外培养罐5的侧面。
本实施例的装置中，第一培养液储罐12与第二培养液储罐14上分别设有密封盖一11与密封盖二13，密封盖一11与密封盖二13的存在便于更换培养液，密封盖一11与密封盖二13上开有可供第一连接管9与第二连接管8通过的孔。
本实施例的装置中，外培养罐5的底部设有桨叶搅拌装置10，以便于进入外培养罐5内的培养液在离心力的作用下与环形培养架7接触。桨叶搅拌装置10以第一连接管9为转轴，驱动方式为常规驱动方式。
本实施例的装置中，内培养罐4的底部呈倒锥形，第一连接管9设于倒锥形的尖部，第一连接管9与内培养罐4连接处设有滤网；第二连接管8设于外培养罐5的底部，第二连接管8与外培养罐5连接处设有滤网。
本实施例的装置中，圆形培养架6包括多块圆形隔片和用于将圆形隔片固定的支柱，环形培养架7包括多层块环形隔片和用于将圆形隔片固定的支柱，每块圆形隔片和环形隔片底部均设有用于防止番石榴悬浮细胞从隔片上掉落的生物滤膜。圆形培养架6各层间距为5.0-8.0cm；环形培养架各层间距为5.0-8.0cm。
本实施例的装置中，上述番石榴次生代谢产物培养用装置还包括有辅助装置，其包括加热装置，用以提供培养液的温度控制；光照装置，用以保证培养时的光照；CO2输入装置，可与泵进气口相连，以调整通入培养罐内的空气组分，使番石榴悬浮细胞生长更加健壮；传感探针，可实时监测培养液中的pH及各种成分的变化，以便于更好的控制培养环境。
本实施例的装置中，装置的尺寸可根据实际需求改变，此处给出一组尺寸数据如下：内培养罐的主体直径为20cm，装置主体高度(含椎体部分)为30cm；外培养罐主体直径为35cm，装置主体高度为60cm；培养储液罐罐体主体直径为35cm，装置主体高度为40cm；各连接装置口径均φ25mm；装置中的搅拌装置直径18cm。
利用本实施例中制备得到的番石榴悬浮细胞可用于生产次生代谢产物时，可将不同的番石榴悬浮细胞放置分别放置于圆形培养架6和环形培养架7上，先加入培养液进行扩大培养(扩大培养的时间优选为21h，此时得到的细胞干重最大，各培养时间得到的细胞干重如图3所示)，再更换培养液以使其产生次生代谢产物，利用上述同一装置即可得到多种次生代谢产物。或者本实施例中可将同一番石榴悬浮细胞放置于圆形培养架6和环形培养架7上，先加入培养液进行扩大培养，再在第一培养液储罐12与第二培养液储罐14中加入不同的培养液进行培养使其产生次生代谢产物，也可得到不同的次生代谢产物。
对比例1-3：
对比例1-3与实施例1相比，不同之处在于表面灭菌的方法有所不同。具体参见下表2。
表2：实施例1与对比例1-3中表面灭菌条件及效果
由上表2可知，用不同的灭菌条件，在同一培养基配方的情况下进行处理，数据显示用75％乙醇和0.1％的升汞配合的灭菌方式的污染率最低，仅12.4％，说明其灭菌效果最好。70％乙醇和0.1％的升汞的组合的污染率稍高，为14.5％，但是死亡率较前者要低，说明高浓度酒精对外植体有一定的伤害作用。单独使用次氯酸钠的污染率较大，结合升汞后死亡率较大，达53.5％，说明次氯酸钠不适合于番石榴叶外植体的消毒，它对细菌的杀灭效果低。
对比例4-7：
对比例4-7与实施例1相比，不同之处在于愈伤组织诱导培养基中添加的激素有所不同。具体参见下表3。
表3：实施例1与对比例4-7中愈伤组织诱导培养基中添加的激素量及诱导效果
对比例8-9：
对比例8-9与实施例1相比，不同之处在于愈伤组织诱导培养基中添加的蔗糖量有所不同。具体参见下表4。
表4：实施例1与对比例8-9中愈伤组织诱导培养基中添加的蔗糖量及诱导效果
对比例10-12：
对比例10-12与实施例1相比，不同之处在于愈伤组织诱导培养基的pH有所不同。具体参见下表5。
表5：实施例1与对比例10-12中愈伤组织诱导培养基的pH及诱导效果
对比例13-15：
对比例13-15与实施例1相比，不同之处在于愈伤组织增殖培养基中添加的激素种类及其用量有所不同。具体参见下表6。
表6：实施例1与对比例13-15中愈伤组织增殖培养基中激素种类、用量及效果
对比例16-20：
对比例16-20与实施例1相比，不同之处在于液体培养基中添加的激素用量有所不同。具体不同参见下表7。
表7：实施例1与对比例16-20中液体培养基中添加的激素用量
对比例16-20中添加不同的激素用量对最终悬浮细胞的干重的影响结果图4所示，由图可知，采用实施例1中的激素配比，最终得到的悬浮细胞的干重最大。
对比例21-25：
对比例21-25与实施例1相比，不同之处在于步骤(4)中摇床转速有所不同。具体不同参见下表8。
表8：实施例1与对比例20-25中摇床转速
对比例21-25中采用不同的摇床转速对最终悬浮细胞的干重的影响结果图5所示，由图可知，采用实施例1中的摇床转速，最终得到的悬浮细胞的干重最大。
对比例26-28：
对比例26-28与实施例1相比，不同之处在于步骤(4)中接种量有所不同。具体不同参见下表9。
表9：实施例1与对比例26-28中接种量
对比例26-28中采用不同的接种量对最终悬浮细胞的干重的影响结果图6所示，由图可知，采用实施例1中的接种量，最终得到的悬浮细胞的干重最大。
实施例2：
一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)采集靠近顶芽且充分展开的番石榴成熟叶片，用流水冲洗1h，用质量浓度为0.1％的洗衣粉溶液漂洗3min，再用流水反复冲洗，然后在超净工作台用75％的酒精浸泡10s，无菌水冲洗3次后，再用0.1％的升汞溶液消毒10min，再次用无菌水冲洗5次，将叶片切成0.5cm×0.5cm，得到外植体，切块时，每块上需带有中脉；
(2)将步骤(1)中得到的外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，筛选出颜色、质地均一，疏松而无定型的愈伤组织；其中，愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中加入1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、1.0mg/LNAA，MS培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8；培养条件为：培养温度为23℃，以日光灯为光源，光照强度为1300lx，光照时间控制为12h/d；培养30天后挑选其中颜色、质地均一、疏松而无定型的愈伤组织用于继代培养；
(3)将步骤(2)中得到的愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行继代培养得到增殖愈伤组织；其中，愈伤组织增殖培养基为在MS培养基中加入0.1mg/LKT与1.0mg/L 2,4-D，MS培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值为5.8；培养条件为：培养温度为27℃，以日光灯为光源，光照强度为1500lx，光照时间控制为12h/d，30天继代一次，继代3次后，挑选其中颜色、质地均一、疏松而无定型的增殖愈伤组织用于悬浮培养；
(4)将步骤(3)中得到的增殖愈伤组织接种于含液体培养基的三角瓶中进行继代培养，培养过程中保持振荡，继代培养更换培养液时，先将三角瓶静置3min，用2mL吸管吸出单细胞或小细胞团和培养液于试管中，弃去大的细胞团，静止20min，用吸管吸出三角瓶大部分原液体培养基，只留下约5mL原液体培养基，把单细胞或小细胞团移置三角瓶，并加入新鲜培养基调整至25mL重新进行培养；最终得到只含有单细胞或小细胞团的培养物，将这些培养物混匀即得到番石榴叶悬浮细胞；其中，液体培养基为在MS培养基中加入0.1mg/LKT与1.0mg/L 2,4-D，MS培养基中添加蔗糖30g/L，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8；培养条件为：接种量为3g/25mL，培养温度为24℃，暗培养或弱光培养，摇床转速为120rpm，继代培养的次数为3次，12天继代一次。
本实施例中MS培养基的成分、愈伤组织诱导培养基配制方法、愈伤组织增殖培养基配制方法、液体培养基配制方法均与实施例1相同。
利用本实施例中制备得到的番石榴悬浮细胞可用于生产次生代谢产物时，生产过程中所用到的番石榴次生代谢产物培养用装置与实施例1相同。

Claims (10)

1.一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集番石榴成熟叶片，洗净后进行表面灭菌处理，切块得到外植体；
(2)将步骤(1)中得到的外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养得到愈伤组织；
(3)将步骤(2)中得到的愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行继代培养得到增殖愈伤组织；
(4)将步骤(3)中得到的增殖愈伤组织接种至液体培养基中进行继代培养，培养过程中保持振荡，继代培养更换培养液时，用吸管取出单细胞或小细胞团进行下一代振荡培养；最终得到只含有单细胞或小细胞团的培养物，将这些培养物混匀即得到番石榴叶悬浮细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中加入1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L NAA，所述MS培养基中添加蔗糖30-40g/L，琼脂7g/L，所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8-6.0。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，诱导培养得到愈伤组织的培养条件为：培养温度为23-27℃，以日光灯为光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间控制为12h/d，培养30天。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述愈伤组织增殖培养基为在MS培养基中加入0.1mg/LKT与1.0mg/L 2,4-D，所述MS培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8-6.0。
5.根据权利要求1或4所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，继代培养得到增殖愈伤组织的培养条件为：培养温度为23-27℃，以日光灯为光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间控制为12h/d，每30天继代一次，继代3-5次。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基为在MS培养基中加入0.1mg/L KT与1.0mg/L 2,4-D，所述MS培养基中添加蔗糖30g/L，所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8-6.0。
7.根据权利要求1或6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中，继代培养的培养条件为：接种量为3g/25mL、培养温度为23-27℃，暗培养或弱光培养，摇床转速为110-120rpm，继代培养的次数为3-4次，每12天继代一次。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述的培养方法得到的番石榴叶悬浮细胞的应用，将所述番石榴叶悬浮细胞用于生产次生代谢产物，其特征在于，生产次生代谢产物的过程在番石榴次生代谢产物培养用装置中进行，所述番石榴次生代谢产物培养用装置包括培养罐体、培养液储罐与用于放置所述番石榴叶悬浮细胞的多层培养架；所述培养罐体包括外培养罐(5)与设于所述外培养罐(5)内的内培养罐(4)，所述培养液储罐包括第一培养液储罐(12)与第二培养液储罐(14)，所述多层培养架包括可拆卸固设于所述内培养罐(4)内的圆形培养架(6)和可拆卸固设于所述外培养罐(5)内的环形培养架(7)；所述内培养罐(4)通过第一连接管(9)与第一培养液储罐(12)连通形成第一密闭空间，所述外培养罐(5)通过第二连接管(8)与第二培养液储罐(14)连通形成第二密闭空间，且所述第一密闭空间与所述第二密闭空间互不连通；所述内培养罐(4)上设有用于通过气压调节第一培养液储罐(12)中培养液是否进入内培养罐(4)的第一气压调节系统，所述外培养罐(5)上设有用于通过气压调节第二培养液储罐(14)中培养液是否进入外培养罐(5)的第二气压调节系统。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述内培养罐(4)上还设有用于与所述第一气压调节系统相配合、控制所述内培养罐(4)内气压的第三气压调节系统；所述外培养罐(5)上还设有用于与所述第二气压调节系统相配合、控制所述外培养罐(5)内气压的第四气压调节系统；所述第一气压调节系统包括连接端口一(201)、空气过滤器一(101)、泵一(1501)及用于依据罐内气压控制泵一(1501)开启或关闭的控制器一(1601)，所述空气过滤器一(101)通过连接端口一(201)与内培养罐(4)连接，所述泵一(1501)与空气过滤器一(101)连接；所述第二气压调节系统包括连接端口二(202)、空气过滤器二(102)、泵二(1502)及用于依据罐内气压控制泵二(1502)开启或关闭的控制器二(1602)，所述空气过滤器二(102)通过连接端口二(202)与外培养罐(5)连接，所述泵二(1502)与空气过滤器二(102)连接；所述第三气压调节系统包括连接端口三(203)、空气过滤器三(103)与排气阀三(1703)，所述空气过滤器三(103)通过连接端口三(203)与内培养罐(4)连接，所述排气阀三(1703)位于所述空气过滤器三(103)的进气端；所述第四气压调节系统包括连接端口四(204)、空气过滤器四(104)与排气阀四(1704)，所述空气过滤器四(104)通过连接端口四(204)与外培养罐(5)连接，所述排气阀四(1704)位于所述空气过滤器四(104)的进气端。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，将所述番石榴叶悬浮细胞用于生产次生代谢产物，所述番石榴叶悬浮细胞为经过筛选的高产细胞系。
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