CN114480106A - 一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，包括控制处理器、高压分离培养室、注液单元、温度控制单元、压力控制阀、环境参数监测单元和超多微孔喷口；基于该高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，本发明还提供一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养方法，通过构建海洋原位的温度和压力环境，将微生物富集液在深海原位的温度和压力环境条件下进行微细珠状态喷洒于固体培育平板的固体培养基上，使其在分散状态下实现分离和培养，最大面积地增加了微生物分离可利用的有效面积，能有效地提高海洋微生物的可培养性，为开发利用海洋生物资源这一重大国家战略性资源提供重要的基础技术。

Description

一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置及培养方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，特别是涉及一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置及培养方法。
背景技术
地球生物圈中微生物种类繁多、功能多样，它们扮演着生产者、消费者和分解者的角色，广泛参与碳、氮、硫等各种生物地化循环。据推算，大约有1011-1012种微生物存在于地球的各个生物圈中,但截至目前可培养微生物仅占总微生物的0.1％-1.0％。绝大部分微生物无法培养，这些微生物常常被称为“暗物质”。
近年来，绝迹稀释法、原位培养、共培养、流式细胞分选技术及微流控培养技术等新型培养方法陆续出现，为高效地分离筛选更多微生物带来了曙光。但对于身处高压环境的微生物而言，目前只有部分微生物经过高压培养装置等获得了富集，但是由于缺乏高压环境下的固体分离培养技术，纯培养进程难度极大，绝大多数海洋微生物尚未获得纯培养菌株。
现有技术公开了一种深海冷泉环境低温高压微生物培养系统，包括用于传送气体、液体的管道，还包括：高压底物配料单元，用于均匀混合高压气体和高压海水，获取溶解有高浓度气体的高压海水培养基；低温高压培养单元，用于在低于50℃适合于中温和低温微生物生长的温度且高压条件下培养微生物；气体供应单元，用于为高压底物配料单元和低温高压培养单元提供高压气体；流动控制单元，用于控制高压底物配料单元和低温高压培养单元内的压强，以及连续培养过程中的流速；气体监测控制单元，用于检测环境中可燃气体的浓度，判断底物配料单元和低温高压培养单元中可燃气体是否泄漏，并根据判断结果及时报警或自动切断气体供应单元供气。该方案虽然满意满足深海冷泉这一类型的低温高压长期有气相底物喷发的环境模拟，对冷泉微生物进行培养，但其仅是提供了深海冷泉环境微生物富集，并未考虑微生物分离培养的技术细节，在实际应用过程中存在培养成功率不高，无法获得纯培养菌株的问题。
发明内容
本发明为了解决以上至少一种技术缺陷，提供一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置及培养方法，实现微生物在分散状态下实现分离和培养，最大面积地增加了微生物分离可利用的有效面积，有效地提高海洋微生物的可培养性，为开发利用海洋生物资源这一重大国家战略性资源提供重要的基础技术。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，包括控制处理器、高压分离培养室、注液单元、温度控制单元、压力控制阀、环境参数监测单元和超多微孔喷口；所述高压分离培养室内部设置有固体培育平板，用于对微生物的分离培养；所述高压分离培养室置于温度控制单元中，通过温度控制单元保证高压分离培养室内的温度恒温保持与深海冷泉区海底温度一致，温度控制单元的控制端与所述控制处理器电性连接；所述压力控制阀与所述高压分离培养室连接，用于对高压分离培养室注入/排出气体，控制其内部压力；所述环境参数监测单元用于监测高压分离培养室内部的温度和压力变化情况，并将数据传输至所述控制处理器；所述超多微孔喷口设置在所述高压分离培养室内，与设置在高压分离培养室外的注液单元连接；注液单元用于向高压分离培养室注入微生物富集液，微生物富集液经过超多微孔喷口后，将分散为微球状菌液散落在所述固体培育平板上，足够小的单个微小液珠在固体培育平板上附着后，将实现分离培养的过程。
上述方案中，所述控制处理器用于在微生物富集菌在高压环境进行分离、纯化过程中各项环境数据变化的监控、以及实时采集、处理、控制、存储和图像输出等功能。
上述方案中，固体培育平板为高强度的培育平板，用于填充固体培养基，满足微生物着床生长需要；超多微孔喷口是使菌液分散的关键元件，可以为球型、喇叭型或者莲蓬型等能让微生物富集液从注液单元内出来后在高压环境中分散成均匀的微细液滴，超多微孔喷口上的孔径足够细且足够多，使得菌液配喷出来后能分离生长。超多微孔喷口与固体培育平板的安放距离要使得微球状菌液出来后刚好均匀的附着在平板上，而不会散落到培养室的内壁。
上述装置通过构建海洋原位的温度和压力环境，将微生物富集液进行微细珠状态喷洒于固体培育平板的固体培养基上，使其在分散状态下实现分离和培养，最大面积地增加了微生物分离可利用的有效面积，能有效地提高海洋微生物的可培养性，为开发利用海洋生物资源这一重大国家战略性资源提供重要的基础技术。该方案克服高压环境中的微生物只能释压后在常压环境下进行分离培养的难点，解决手工平板划线方法耗时长、具有较强专业人员操作依赖性。
其中，所述注液单元包括微生物富集液存储罐、微流泵和注液口；其中：所述微生物富集液存储罐通过所述微流泵与所述注液口连接；所述注液口与所述超多微孔喷口通过耐压管道连接。
其中，所述温度控制单元包括低/高温环境系统、制冷/热系统和水浴温度监测系统；所述高压分离培养室置于低/高温环境系统中进行水浴，低/高温环境系统与所述制冷/热系统连接，实现热量交换；所述水浴温度监测系统用于监测低/高温环境系统中的温度变化，并将监测数据传输至所述控制处理器；所述制冷/热系统控制端与所述控制处理器电性连接。
上述方案中，低/高温环境系统为包裹在高压分离培养室外壁的腔体，其内部注有载冷/热流体，并且通过将流体进行制冷/热系统进行循环制冷或者加热，保证腔体内流体的低温或者高温状态，通过热交换保证高压分离培养室内的低温或者高温状态；水浴温度监测系统用于监测水浴的实时温度，便于及时进行调整。
上述方案也可将高压分离培养室置于低温/高温的水浴/油浴环境中，来保证高压分离培养室内需要的特殊温度条件；或者将高压分离培养室放于通过空气换热保证的温度恒定的制冷/制热房间或者箱内；在一些极端的温度条件下还可同时采用上述几种温度控制方式。
其中，在所述高压分离培养室设置有快开卡箍，方便迅速地往高压分离培养室内装样。
优选的，所述超多微孔喷口、固体培育平板在所述高压分离培养室均设置有多个；所述注液单元同时与每个超多微孔喷口连接；所述固体培育平板横向设置在所述高压分离培养室底部，实现对微生物在相同温压条件的横向分离培养。
优选的，所述高压分离培养室在竖直方向上设置有多个连通隔板，将高压分离培养室分隔为多个连通的培养腔体；其中：每个连通隔板上均设置有固体培育平板，每个培养腔体内均设置有超多微孔喷口；所述注液单元同时与每个超多微孔喷口连接，实现对微生物在相同温压条件下的竖向分离培养。
优选的，高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置包括多个高压分离培养室，每个高压分离培养室设置有独立的超多微孔喷口、固体培育平板和压力控制阀；每个高压分离培养室均置于同一个温度控制单元中；所述注液单元同时与每个高压分离培养室内的超多微孔喷口连接，实现对微生物在相同温度不同压力条件下的分离培养。
优选的，高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置包括多个高压分离培养室，每个高压分离培养室设置有独立的超多微孔喷口、固体培育平板和压力控制阀；每个高压分离培养室置于对应设置的独立的温度控制单元中；所述注液单元同时与每个高压分离培养室内的超多微孔喷口连接，所有压力控制阀之间连通，实现对微生物在不同温度相同压力条件下的分离培养。
上述方案中，所有压力控制阀之间的连通切断，分别进行控制，便可实现对微生物在不同温度不同压力条件下的分离培养。
上述方案将单个高压分离培养室进行多层级组合实现相应的培养工艺，可以有效提高微生物的筛选效率。在相同的温度和压力环境条件下，为了增加培养面积和分选量，可以通过在横向培养室内布置多个固体培育平板，每个固体培育平板可以填充不同营养的培养基，每个平板设置一个超多微孔喷口，提高分离培养效率。也可以设置成塔式结构，将多个固体培育平板和超多微孔喷口组合进行竖向堆叠安放，也可以进行多组横向和竖向的同时组合，进行规模化培养。整个高压分离培养室设置成相同的温度和压力环境条件。
上述方案中，如果为了筛选不同压力和温度环境条件下的菌种，也可以将不同的高压分离培养室进行并联组合，每个高压分离培养室的温度和压力环境进行单独控制，可以按照分选目的进行梯度设置温度、压力参数条件。多个高压分离培养室通过并联组合并且与微流泵和微生物富集液储存罐相连。形成不同温度、压力环境条件下的分选工艺。
本方案还提出一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养方法，采用一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置实现，具体包括以下步骤：
S1：对高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置进行灭菌处理，保持无菌状态并进行安装；
S2：在固体培育平板上填充好灭菌后的固体培养基；
S3：通过控制处理器开启温度控制单元，令高压分离培养室内的温度恒温保持并与深海冷泉区海底温度一致；
S4：通过压力控制阀向高压分离培养室内注入气体增压，使高压分离培养室内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致，注入的气体为微生物生长需要的气体或者其他增压气体；
S5：确保所有部件正常工作后，开启注液单元将微生物富集液注入高压分离培养室，微生物富集液经过超多微孔喷口后，将分散为微球状菌液；在重力的作用下，微球状菌液将被运移散落在固体培育平板上；
S6：微球状菌液在固体培育平板上的固体培养基内着床生长，待足够的培养周期后，长处分离后的单菌落，完成微生物的固体分离培养。
上述方案中，为了避免固体琼脂培养基在高压条件下破碎，可在培育平板内填充氧化铝粉末、微细玻璃珠/钢球、钢丝球等作为支撑，满足固体分离培养的需求。
上述方案中，通过在高压分离培养室内构建微生物分离培养与海洋环境一致的高压、低压或者高压、高温环境，保证富集的深海微生物在海洋生活的原位的温度和环境条件下进行分离，增加可培养性。
上述方案涉及的微生物自动培养工艺主要包括相同温、压条件和不同温、压条件两种。在相同温、压条件主要是为了满足大规模不同培养基同时筛选分离的需求。首先，在高压分离培养室内将若干固体培育平板和超多微孔喷口在横向或者竖向组合放置，所有超多微孔喷口的进口通过管线并联连接并且与微注泵和微生物富集液储存罐相连。不同的温、压条件主要是将不同的培养室进行并联组合，每个培养室的温度和压力环境进行单独控制，可以按照分选目的进行梯度设置参数条件。多个培养室通过并联组合并且与微流泵和微生物富集液储存罐相连。当整体工艺环节组装调试好以后，将培养工艺涉及的所有培养室和管阀件整体灭菌。然后通过温度和压力监控，保证所有培养室内的温度和压力环境条件与微生物所在海洋环境的温度和压力环境条件一致。依次打开微注泵和调节阀，微球状菌液将在固体培育平板上着床，进行分离培养，可以实现不同培养基环境下的自动分选工艺，有效的保证高压环境微生物的分离培养和纯化，为海洋微生物的高效利用和高压环境分选工艺提供关键技术。
本方案涉及一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置及培养方法，提出了在高压极端温度环境条件下，进行海洋微生物的自动喷洒式分离培养装置与自动化分离培养工艺，解决了现有室内纯培养技术方法脱离海洋微生物生存的高压与极端温度环境条件而导致大量微生物不能实现纯培养的难题，还解决了目前的纯培养技术依赖专业操作人员进行手动划线分选的问题。本方案通过不同培养室的组合，最大面积的增加了微生物分离可利用的有效面积，且通过不同培养基和不同温、压条件的组合，形成工艺操作线，有效的提高了分离培养的成功率，实现海洋微生物在原位压力和温度环境条件下的自动化分离培养，属于海洋微生物原位条件分离培养的革新技术。
本方案相对于现有的固体平板分离培养技术，解决了现有常压分离培养技术脱离海洋微生物原位生存的温度和压力环境条件，造成绝大多数微生物不能分离纯培养的问题；且相对于现有的纯培养方法，本方案提出了在高压环境的自动喷洒式微细液珠分散富集的微生物菌液，并在强化的耐压固体培养基上着床生长，实现分离培养的目的，可形成大规模连续式培养工艺。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
本发明提出了一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置及培养方法，通过构建海洋原位的温度和压力环境，将微生物富集液进行微细珠状态喷洒于固体培育平板的固体培养基上，使其在分散状态下实现分离和培养，最大面积地增加了微生物分离可利用的有效面积，能有效地提高海洋微生物的可培养性，为开发利用海洋生物资源这一重大国家战略性资源提供重要的基础技术。
附图说明
图1为本发明所述高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置的结构示意图；
图2为本发明所述控制处理器的电路模块连接示意图；
图3为本发明所述高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置实现对微生物在相同温、压条件的横向分离培养的结构示意图；
图4为本发明所述高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置实现对微生物在相同温、压条件的竖向分离培养的结构示意图；
图5为本发明所述高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置实现对微生物在不同温度、相同/不同压力条件下的分离培养的结构示意图；
图6为本发明所述高压环境喷洒式微生物固体分离培养方法的流程示意图；
其中：1、控制处理器；2、高压分离培养室；21、固体培育平板；22、快开卡箍；23、连通隔板；24、培养腔体；31、微生物富集液存储罐；32、微流泵；33、注液口；4、温度控制单元；41、低/高温环境系统；42、制冷/热系统；43、水浴温度监测系统；5、压力控制阀；6、环境参数监测单元；61、温度传感器；62、压力传感器；7、超多微孔喷口；8、微球状菌液。
具体实施方式
附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；
本实施例为完整的使用示例，内容较丰富
为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；
对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
如图1、图2所示，本实施例提供了一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，包括控制处理器1、高压分离培养室2、注液单元、温度控制单元4、压力控制阀5、环境参数监测单元6和超多微孔喷口7；所述高压分离培养室2内部设置有固体培育平板21，用于对微生物的分离培养；所述高压分离培养室2置于温度控制单元4中，通过温度控制单元4保证高压分离培养室2内的温度恒温保持与深海冷泉区海底温度一致，温度控制单元4的控制端与所述控制处理器1电性连接；所述压力控制阀5与所述高压分离培养室2连接，用于向高压分离培养室2注入微生物生长需要的甲烷气体并增压至14MPa；所述环境参数监测单元6用于监测高压分离培养室2内部的温度和压力变化情况，并将数据传输至所述控制处理器1；所述超多微孔喷口7设置在所述高压分离培养室2内，与设置在高压分离培养室2外的注液单元连接；注液单元用于向高压分离培养室2注入微生物富集液，微生物富集液经过超多微孔喷口7后，将分散为微球状菌液散落在所述固体培育平板21上，足够小的单个微小液珠在固体培育平板21上附着后，将实现分离培养的过程。
在具体实施过程中，所述控制处理器1用于在微生物富集菌在高压环境进行分离、纯化过程中各项环境数据变化的监控、以及实时采集、处理、控制、存储和图像输出等功能。所述环境参数监测单元6包括温度传感器61和压力传感器62，其探头设置在高压分离培养室2内部，信号输出端与所述控制处理器1电性连接。
在具体实施过程中，固体培育平板21为高强度的培育平板，用于填充固体培养基，满足微生物着床生长需要；超多微孔喷口7是使菌液分散的关键元件，可以为球型、喇叭型或者莲蓬型等能让微生物富集液从注液单元内出来后在高压环境中分散成均匀的微细液滴，超多微孔喷口7上的孔径足够细且足够多，使得菌液配喷出来后能分离生长。超多微孔喷口7与固体培育平板21的安放距离要使得微球状菌液出来后刚好均匀的附着在平板上，而不会散落到培养室的内壁。
更具体的，所述注液单元包括微生物富集液存储罐31、微流泵32和注液口33；其中：所述微生物富集液存储罐31通过所述微流泵32与所述注液口33连接；所述注液口33与所述超多微孔喷口7连接。
更具体的，所述温度控制单元4包括低/高温环境系统41、制冷/热系统42和水浴温度监测系统43；所述高压分离培养室2置于低/高温环境系统41中进行水浴，低/高温环境系统41与所述制冷/热系统42连接，实现热量交换；所述水浴温度监测系统43用于监测低/高温环境系统41中的温度变化，并将监测数据传输至所述控制处理器1；所述制冷/热系统42控制端与所述控制处理器1电性连接。
在具体实施过程中，低/高温环境系统41为包裹在高压分离培养室2外壁的腔体，其内部注有载冷/热流体，并且通过将流体进行制冷/热系统42进行循环制冷或者加热，保证腔体内流体的低温或者高温状态，通过热交换保证高压分离培养室2内的低温或者高温状态；水浴温度监测系统43用于监测水浴的实时温度，便于及时进行调整。
在具体实施过程中也可将高压分离培养室2置于低温/高温的水浴/油浴环境中，来保证高压分离培养室2内需要的特殊温度条件；或者将高压分离培养室2放于通过空气换热保证的温度恒定的制冷/制热房间或者箱内；在一些极端的温度条件下还可同时采用上述几种温度控制方式。
更具体的，在所述高压分离培养室2设置有快开卡箍22，方便迅速地往高压分离培养室内装样。
在具体实施过程中，本实施例通过构建海洋原位的温度和压力环境，将微生物富集液进行微细珠状态喷洒于固体培育平板21的固体培养基上，使其在分散状态下实现分离和培养，最大面积地增加了微生物分离可利用的有效面积，能有效地提高海洋微生物的可培养性，为开发利用海洋生物资源这一重大国家战略性资源提供重要的基础技术。该方案克服高压环境中的微生物只能释压后在常压环境下进行分离培养的难点，解决手工平板划线方法耗时长、具有较强专业人员操作依赖性。
实施例2
更具体的，在实施例1的基础上，为了筛选不同压力和温度环境条件下的菌种，也可以将不同的高压分离培养室进行并联组合，每个高压分离培养室的温度和压力环境进行单独控制，可以按照分选目的进行梯度设置温度、压力参数条件。多个高压分离培养室通过并联组合并且与微流泵和微生物富集液储存罐相连。形成不同温度、压力环境条件下的分选工艺。具体优选方案如下：
优选的，如图3所示，所述超多微孔喷口7、固体培育平板21在所述高压分离培养室2均设置有多个；所述注液单元同时与每个超多微孔喷口7连接；所述固体培育平板21横向设置在所述高压分离培养室2底部，实现对微生物在相同温、压条件的横向分离培养。
优选的，如图4所示，所述高压分离培养室2在竖直方向上设置有多个连通隔板23，将高压分离培养室2分隔为多个连通的培养腔体24；其中：每个连通隔板23上均设置有固体培育平板21，每个培养腔体24内均设置有超多微孔喷口7；所述注液单元同时与每个超多微孔喷口7连接，实现对微生物在相同温、压条件下的竖向分离培养。
优选的，如图5所示，高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置包括多个高压分离培养室2，每个高压分离培养室2设置有独立的超多微孔喷口7、固体培育平板21和压力控制阀5；每个高压分离培养室2均置于同一个温度控制单元4中；所述注液单元同时与每个高压分离培养室2内的超多微孔喷口7连接，实现对微生物在相同温度不同压力条件下的分离培养。
优选的，高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置包括多个高压分离培养室2，每个高压分离培养室2设置有独立的超多微孔喷口7、固体培育平板21和压力控制阀5；每个高压分离培养室2置于对应设置的独立的温度控制单元4中；所述注液单元同时与每个高压分离培养室2内的超多微孔喷口7连接，所有压力控制阀5之间连通，实现对微生物在不同温度相同压力条件下的分离培养。
在具体实施过程中，仅需要装置在不同温度相同压力条件下的分离培养时，将所有压力控制阀5之间的连通切断，分别进行控制，便可实现对微生物在不同温度不同压力条件下的分离培养。
在具体实施过程中，本实施例将单个高压分离培养室2进行多层级组合实现相应的培养工艺，可以有效提高微生物的筛选效率。在相同的温度和压力环境条件下，为了增加培养面积和分选量，可以通过在横向培养室内布置多个固体培育平板21，每个固体培育平板21可以填充不同营养的培养基，每个平板设置一个超多微孔喷口7，提高分离培养效率。也可以设置成塔式结构，将多个固体培育平板21和超多微孔喷口7组合进行竖向堆叠安放，也可以进行多组横向和竖向的同时组合，进行规模化培养。整个高压分离培养室2设置成相同的温度和压力环境条件。
实施例3
更具体的，本实施例提出一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养方法，采用一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置实现，如图6所示，具体包括以下步骤：
S1：对高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置进行灭菌处理，保持无菌状态并进行安装；
S2：在固体培育平板21上填充好灭菌后的固体培养基；
S3：通过控制处理器1开启温度控制单元4，令高压分离培养室2内的温度恒温保持并与深海冷泉区海底温度一致；
S4：通过压力控制阀5向高压分离培养室2内注入气体增压，使高压分离培养室2内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致，注入的气体为微生物生长需要的气体或者其他惰性气体满足增压需求；
S5：确保所有部件正常工作后，开启注液单元将微生物富集液注入高压分离培养室2，微生物富集液经过超多微孔喷口7后，将分散为微球状菌液；在重力的作用下，微球状菌液将被运移散落在固体培育平板21上；
S6：微球状菌液在固体培育平板21上的固体培养基内着床生长，待足够的培养周期后，长处分离后的单菌落，完成微生物的固体分离培养。
在具体实施过程中，为了避免固体琼脂培养基在高压条件下破碎，可在培育平板内填充氧化铝粉末、微细玻璃珠/钢球、钢丝球等作为支撑，满足固体分离培养的需求。
在具体实施过程中，通过在高压分离培养室2内构建微生物分离培养与海洋环境一致的高压、低压或者高压、高温环境，保证富集的深海微生物在海洋生活的原位的温度和压力环境条件下进行分离，增加可培养性。
在具体实施过程中，本实施例涉及的微生物自动培养工艺主要包括相同温、压条件和不同温、压条件两种。在相同稳压条件主要是为了满足大规模不同培养基同时筛选分离的需求。首先，在高压分离培养室2内将若干固体培育平板21和超多微孔喷口7在横向或者竖向组合放置，所有超多微孔喷口7的进口通过管线并联连接并且与微注泵32和微生物富集液储存罐31相连。不同的温、压条件主要是将不同的培养室进行并联组合，每个培养室的温度和压力环境进行单独控制，可以按照分选目的进行梯度设置参数条件。多个培养室通过并联组合并且与微流泵32和微生物富集液储存罐31相连。当整体工艺环节组装调试好以后，将培养工艺涉及的所有培养室和管阀件整体灭菌。然后通过温度和压力监控，保证所有培养室内的温度和压力环境条件与微生物所在海洋环境的温度和压力环境条件一致。依次打开微注泵32和调节阀，微球状菌液将在固体培育平板21上着床，进行分离培养，可以实现不同培养基环境下的自动分选工艺，有效的保证高压环境微生物的分离培养和纯化，为海洋微生物的高效利用和高压环境分选工艺提供关键技术。
本实施例相对于现有的固体平板分离培养技术，解决了现有常压分离培养技术脱离海洋微生物原位生存的温度和压力环境条件，造成绝大多数微生物不能分离纯培养的问题；且相对于现有的纯培养方法，本实施例提出了在高压环境的自动喷洒式微细液珠分散富集的微生物菌液，并在强化的耐压固体培养基上着床生长，实现分离培养的目的，可形成大规模连续式培养工艺。
实施例4
为了进一步说明本方案的技术实现过程及技术效果，本实施例以培养嗜甲烷菌为例，提供一种在高压环境下分离深海冷泉区嗜甲烷菌的微细珠喷洒式固体平板分离培养装置与技术。高压分离培养室2是本实例的核心，其它辅助系统包括微生物富集液存储罐31和控制处理器1。通过在高压分离培养室2里面构建微生物分离培养的与海洋环境一致的高压低温环境，保证富集的深海嗜甲烷菌在海洋生活的原位的高压环境下进行分离，增加可培养性。高压分离培养室2的上部设计有快开卡箍22，方便迅速地往高压分离培养室2内装样。
本实施例将固体培育平板21放置于高压分离培养室2内，将微生物富集液存储罐31内的深海冷泉区嗜甲烷菌富集培养液通过微流泵32注入高压分离培养室2，经过超多微孔喷口7，使其分散成微球状菌液8，散落在固体培育平板21内的固体培养基上，将实现分离培养的过程。本实施例涉及的高压分离培养室2设置有注液口33，用于往高压分离培养室2内注入嗜甲烷菌富集液；压力控制阀5用于往高压分离培养室2内通入嗜甲烷菌生长需要的甲烷气体并增压至14MPa；高压分离培养室2内安放有高强度固体培育平板21用于填充固体培养基，满足嗜甲烷菌着床生长需要；高压分离培养室2内安放有使菌液分散的关键元件是超多微孔喷口7，能让嗜甲烷菌富集液从注液口33内出来后在高压环境中分散成均匀的微球状菌液8，喷头上的孔径足够细且足够多，使得菌液喷出后能分离生长。超多微孔喷口7与固体培育平板21的安放距离为离开超多微孔喷口7的微球状菌液8出来后刚好全部均匀的附着在固体培育平板21上，而不会散落到其他地方。本实施例涉及的高压分离培养室2内的温度条件控制主要是低/高温环境系统41，来保证培养室内的温度恒温保持与深海冷泉区海底温度一致。本实施例涉及的控制处理器1实现微生物富集菌在高压环境进行分离、纯化过程中各项环境数据信息变化的监控、以及实时采集、处理、存储和图像输出等功能。
为了提高嗜甲烷菌的筛选效率，本实施例可以将单个高压分离培养室2进行多层级组合培养形成培养工艺。在相同的温度和压力环境条件下，为了增加培养面积和分选量，如图3所示，可以通过在横向培养室内布置多个固体培育平板21，每个固体培育平板21可以填充不同营养的培养基，每个固体培育平板21设置一个超多微孔喷口7，提高分离培养效率。如图4所示，也可以设置成塔式结构，将多个固体培育平板21和超多微孔喷口7组合进行竖向堆叠安放，也可以进行多组横向和竖向的同时组合，进行规模化培养。整个高压分离培养室2设置成相同的温度和压力环境条件。
如果为了筛选不同压力和温度环境条件下的菌种，如图5所示，也可以将不同的高压分离培养室2进行并联组合，每个高压分离培养室2的温度和压力环境进行单独控制，可以按照分选目的进行梯度设置参数条件。多个高压分离培养室2通过并联组合并且与微流泵32和微生物富集液存储罐31相连。形成不同温度、压力环境条件下的分选工艺。
本实施例涉及的高压环境喷洒式深海是嗜甲烷菌固体分离培养技术方法主要包括，首先，将高压分离培养室2及其内部所有器件及相关的管阀件进行灭菌处理，保持无菌状态。然后在固体培育平板21上填充好灭菌后的固体培养基。为了避免固体琼脂培养基在高压条件下破碎，可在固体培育平板21内填充微细玻璃珠作为支撑，满足固体分离培养的需求。然后，开启低/高温环境系统41，保证高压分离培养室2内的温度与嗜甲烷菌在深海冷泉区海底温度条件一致。然后通过压力控制阀5往高压分离培养室2内注入甲烷气体增压至14MPa。确保所有装置部件工作正常后，开启微流泵32通过从微生物富集液存储罐31内向高压分离培养室2内注入嗜甲烷菌富集液，嗜甲烷菌富集液通过超多微孔喷口7后，将被分割成微球状菌液8，微球状菌液8将在重力作用下，运移至高压分离培养室2底部的固体培育平板21上。微球状菌液8在固体培养基内着床生长，长出分离后的单菌落。
本实施例涉及的嗜甲烷菌自动培养工艺主要包括相同温压条件和不同温压条件两种。在相同温压条件主要是为了满足大规模不同培养基同时筛选分离的需求。首先，在高压分离培养室2内将若干固体培育平板21和超多微孔喷口7在横向或者竖向组合放置，超多微孔喷口7的进口通过管线并联连接并且与微流泵32和微生物富集液存储罐31相连，整个工艺筛选过程所有的固体培育平板21都处于14MPa和4℃温度环境条件中。不同的温压条件主要是将不同的高压分离培养室2进行并联组合，每个高压分离培养室2的温度和压力环境进行单独控制，可以按照分选目的进行梯度设置参数条件。如根据不同水深环境发现的嗜甲烷菌，将多个高压分离培养室2内的压力条件从6MPa至20MPa进行梯度设施，温度环境响应的设置为该深度环境的海底温度。且多个高压分离培养室2通过并联组合并且与微流泵32和嗜甲烷菌富集液储存罐相连。当整体工艺环节组装调试好以后，将培养工艺涉及的所有培养室和管阀件整体灭菌。然后通过温度和压力监控，保证所有培养室内的温度和压力环境条件与嗜甲烷菌所在海洋环境的温度和压力环境条件一致。依次打开微流泵32和注液口33，微球状菌液8将在固体培育平板21上着床，进行分离培养，可以实现不同培养基环境下的自动分选工艺，有效的保证高压环境嗜甲烷菌的分离培养和纯化，为深海嗜甲烷菌的高效利用和高压环境分选工艺提供关键技术。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，包括控制处理器(1)，其特征在于，还包括高压分离培养室(2)、注液单元、温度控制单元(4)、压力控制阀(5)、环境参数监测单元(6)和超多微孔喷口(7)；其中：
所述高压分离培养室(2)内部设置有固体培育平板(21)，用于对微生物的分离培养；
所述高压分离培养室(2)置于温度控制单元(4)中，通过温度控制单元(4)保证高压分离培养室(2)内的温度恒温保持与深海冷泉区海底温度一致，温度控制单元(4)的控制端与所述控制处理器(1)电性连接；
所述压力控制阀(5)与所述高压分离培养室(2)连接，用于对高压分离培养室(2)注入/排出气体，控制其内部压力；
所述环境参数监测单元(6)用于监测高压分离培养室(2)内部的温度和压力变化情况，并将数据传输至所述控制处理器(1)；
所述超多微孔喷口(7)设置在所述高压分离培养室(2)内，与设置在高压分离培养室(2)外的注液单元连接；注液单元用于向高压分离培养室(2)注入微生物富集液，微生物富集液经过超多微孔喷口(7)后，将分散为微球状菌液散落在所述固体培育平板(21)上。
2.根据权利要求1所述的一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，其特征在于，所述注液单元包括微生物富集液存储罐(31)、微流泵(32)和注液口(33)；其中：所述微生物富集液存储罐(31)通过所述微流泵(32)与所述注液口(33)连接；所述注液口(33)与所述超多微孔喷口(7)连接。
3.根据权利要求1所述的一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，其特征在于，所述温度控制单元(4)包括低/高温环境系统(41)、制冷/热系统(42)和水浴温度监测系统(43)；所述高压分离培养室(2)置于低/高温环境系统(41)中进行水浴，低/高温环境系统(41)与所述制冷/热系统(42)连接，实现热量交换；所述水浴温度监测系统(43)用于监测低/高温环境系统(41)中的温度变化，并将监测数据传输至所述控制处理器(1)；所述制冷/热系统(42)控制端与所述控制处理器(1)电性连接。
4.根据权利要求1所述的一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，其特征在于，在所述高压分离培养室(2)设置有快开卡箍(22)。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，其特征在于，所述超多微孔喷口(7)、固体培育平板(21)在所述高压分离培养室(2)均设置有多个；所述注液单元同时与每个超多微孔喷口(7)连接；所述固体培育平板(21)横向设置在所述高压分离培养室(2)底部，实现对微生物在相同温、压条件的横向分离培养。
6.根据权利要求1～4任一项所述的一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，其特征在于，所述高压分离培养室(2)在竖直方向上设置有多个连通隔板(23)，将高压分离培养室(2)分隔为多个连通的培养腔体(24)；其中：每个连通隔板(23)上均设置有固体培育平板(21)，每个培养腔体(24)内均设置有超多微孔喷口(7)；所述注液单元同时与每个超多微孔喷口(7)连接，实现对微生物在相同温、压条件下的竖向分离培养。
7.根据权利要求1～4任一项所述的一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，其特征在于，包括多个高压分离培养室(2)，每个高压分离培养室(2)设置有独立的超多微孔喷口(7)、固体培育平板(21)和压力控制阀(5)；每个高压分离培养室(2)均置于同一个温度控制单元(4)中；所述注液单元同时与每个高压分离培养室(2)内的超多微孔喷口(7)连接，实现对微生物在相同温度不同压力条件下的分离培养。
8.根据权利要求1～4任一项所述一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，其特征在于，包括多个高压分离培养室(2)，每个高压分离培养室(2)设置有独立的超多微孔喷口(7)、固体培育平板(21)和压力控制阀(5)；每个高压分离培养室(2)置于对应设置的独立的温度控制单元(4)中；所述注液单元同时与每个高压分离培养室(2)内的超多微孔喷口(7)连接，所有压力控制阀(5)之间连通，实现对微生物在不同温度相同压力条件下的分离培养。
9.根据权利要求7所述的一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置，其特征在于，所有压力控制阀(5)之间的连通切断，分别进行控制，便可实现对微生物在不同温度不同压力条件下的分离培养。
10.一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养方法，其特征在于，采用如权利要求1～9所述的一种高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置实现，具体包括以下步骤：
S1：对高压环境喷洒式微生物固体分离培养装置进行灭菌处理并进行安装；
S2：在固体培育平板(21)上填充好灭菌后的固体培养基；
S3：通过控制处理器(1)开启温度控制单元(4)，令高压分离培养室(2)内的温度恒温保持并与深海冷泉区海底温度一致；
S4：通过压力控制阀(5)向高压分离培养室(2)内注入气体增压，使高压分离培养室(2)内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致；
S5：开启注液单元将微生物富集液注入高压分离培养室(2)，微生物富集液经过超多微孔喷口(7)后，将分散为微球状菌液散落在固体培育平板(21)上；
S6：微球状菌液在固体培育平板(21)上的固体培养基内着床生长，待足够的培养周期后，长处分离后的单菌落，完成微生物的固体分离培养。
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