CN115895852B - 高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及海洋微生物分离技术领域，特指高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置与方法。高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置包括有富集系统、分离操作培养器、中央控制系统、温度控制单元和压力控制单元。在本发明中，在高压环境条件下，对极端环境条件的微生物进行富集和分离培养的高压纯培养技术，解决了现有常压分离培养技术脱离高压环境微生物原位生存的温度和压力环境条件，造成绝大多数微生物生存活性差，或者表型与原位环境差异大，不能分离纯培养的问题。

Description

高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置与方法

技术领域

本发明涉及海洋微生物分离技术领域，特指高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置与方法。

背景技术

海洋是地球上面积最大的单一生态系统。海洋沉积物覆盖了地球70%的大部分区域，并且含有与海水一样多的生物量。最近几十年，随着科考技术及深海潜艇的发展和进步，科学家们有机会获取各大深海海底沉积物的样品，得以更好探明海底沉积物中微生物的分类及丰度，根据研究及估算，目前海洋沉积物中细菌占地球细菌的0.23-3.6%。据估计，海底微生物占地球总生物量的六分之五和活生物量的三分之一。这些微生物群落同时加工有机碳和无机碳，并有助于硫、氮、硫和铁等营养物质的循环。其中一些比较重要的核心类群在全球的生物地球化学循环中扮演重要角色。根据16S rRNA基因扩增子测序分析，发现很多未培养类群，这些未培养类群的显着特征之一是在深海占主导地位。鉴于这些未培养类群对整个海洋的重要性，有必要更好地了解和认识这些未培养分类群的多样性和生态作用。

对于海洋特殊生境中的微生物分离，现有技术主要在常压环境下进行，较少在高压环境下分离培养单菌落，即使在高压环境下的的单菌落分离，一般采用机械划线或释压后进行人为划线分离单菌落，且每次划线采用培养基的类型较为单一，导致其分离效率较低、操作过程较为繁琐，进而可培养微生物数量不到深海环境的1%，为我们正确认识和利用海洋资源带来一定的困难。

发明内容

本发明的发明目的在于：为了解决现有技术中所存在的问题，本发明提供了高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置与方法。

为了解决现有技术中所存在的问题，本发明采用以下技术方案：

高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置，包括有富集系统、分离操作培养器、中央控制系统、温度控制单元和压力控制单元；

所述富集系统和所述分离操作培养器相连通，且所述富集系统、所述分离操作培养室、所述温度控制单元和所述压力控制单元均与所述中央控制系统电连接；

所述富集系统用于培养微生物，所述富集系统包括有富集釜和可拆卸上盖；所述富集系统包括有进气通道或进液通道，通过所述进气通道或所述进液通道向所述富集釜中对应地注入气体或液体，向所述富集釜进行增压；

所述中央控制系统用于在高压环境进行环境数据变化的监控，并监控、实时采集、处理、存储和图像输出；所述温度控制单元用于检测和调节所述富集系统和所述分离操作培养器内的温度变化；所述压力控制单元用于检测和调节所述富集系统和所述分离操作培养器内的压力变化，并向所述分离操作培养器注入气体或液体进行增压；

所述分离操作培养器包括有培养室，所述培养室内设置有多个培养皿，多个所述培养皿竖向或横竖交错设置，每个所述培养皿形成一个通道。

作为本发明高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，多个所述培养皿上下层式设置，每层所述培养皿交错设置；

所述培养室内设置有垂直于所述培养室底部的固定杆，所述固定杆上横向设置有多根横杆；

每个所述培养皿呈长方体状，所述培养皿的两侧上开设有固定孔，所述培养皿的另外一侧上设置有斜面，所述斜面的上边形成溢流线，且所述斜面的两侧设置有挡板，所述培养皿的下面设置有穿孔，所述穿孔设置在所述培养皿的靠近所述斜面的端部，多个所述培养皿在竖直方向形成一个完整通道；

所述固定孔穿设在所述横杆上，所述穿孔中穿设有连接杆，所述连接杆用于连接上下两层设置在所述培养皿。

作为本发明高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，每个所述培养皿之间的垂直距离大于等于所述培养皿自身的高度；当所述培养皿倾斜时，所述培养皿呈“Z”字型，且上层所述培养皿倾斜的一端与下层所述培养皿非斜面的一端内部接触。

作为本发明高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，所述培养室内设置有至少三层所述培养皿，至少三层所述培养皿包括有第一分离层、第二分离层和第三分离层；每层所述分离层包括有至少一个所述培养皿。

作为本发明高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，所述分离操作培养器还连接有稀释瓶，所述稀释瓶向所述培养皿内注入无菌水。

作为本发明高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，所述富集系统通过送液管道和所述分离操作培养器相连通，且所述送液管道上还设置有微注泵；所述富集系统通过所述送液管道、所述微注泵和喷口把培养液注入所述分离操作培养器；所述喷口的数量和在同一平面的所述培养皿的数量相一致；

所述培养室内还设置有积液槽，所述积液槽与最底层培养皿的斜面操持接触；所述积液槽还连通过第二管道与收集装置相连通，所述第二管道上还设置有阀门。

作为本发明高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，所述富集釜包括有可拆卸上盖；所述富集釜内的顶部设置有搅拌杆；所述进气管道和所述进液管道上均安装有阀门；所述富集釜还设置有调节阀的取样口；所述富集釜放置在高温或低温的水域中，或放置在空气换热试恒温房中；所述富集系统还包括有微注泵和出液管道。

高压环境多通道自动划线分离单菌落的方法，使用如上述的高压环境多通道自动划线分离多类型单菌落的装置，包括有以下步骤：

S1、富集过程中的目标菌液浓度达到需求后，进入分离培养过程；

S2、分离操作培养器进行灭菌处理，保持无菌状态；

S3、在分离区的底部上填充灭菌后的固体培养基，并摆放培养皿的位置；

S4、开启水浴系统，保证分离操作培养器的温度与微生物在海洋环境的温度条件一致；

S5、向所述分离操作培养器中注入气体或液体，使分离操作培养器增压，使分离操作培养器内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致；

S6、通过微注泵从富集釜向分离操作培养器内注入微生物富集液，滴落在第一分离层的菌液在重力下自动向下流动，依次经过第二分离层、第三分离层，在流动的过程中初步分离成单个菌落；

S7、通过微注泵将稀释瓶内的无菌水注入至第一分离层的平板上，无菌水在重力的作用下向下流动，且无菌水在流动的过程中再次稀释原有流动在培养基表面的菌液，使微生物富集液达到最大程度的稀释；

S8、按照S6和S7的方式，依次进行多通道分离单菌落。

本发明的有益效果：

1、在本发明中，实现了在如海洋原位的温度和压力的环境条件下，微生物的富集培养以及采用多通道自动划线分离多类型单菌落的装置与方法，即本发明解决了现有室内纯培养技术方法脱离微生物生存的高压与极端温度环境条件而导致大量微生物生存活性差，并解决在高压环境下分离效率低且操作复杂的难题；

2、相对于现有的高压分离培养技术，可以实现自动多级分区域划线分离培养单个菌落并结合不同培养基的类型，实现最大程度的单菌落分离，解决在高压环境下分离效率低且操作复杂的问题；

3、相对于现有的分离培养技术，本发明可有效的减少专业人员投入，并且可进行规模化富集和分离培养，提高难培养微生物的筛选效率，提高高压环境功能菌的筛选和培育效率；

4、本发明不需要专业操作人员，可用于研究室、科考船等多培养场景，适应性较广；本发明不需要专业人员手动富集和划线分离操作，可进行规模化富集和分选，减少人力成本，实现高压环境微生物在原位压力和温度环境条件下的自动化分离培养，为高压环境下微生物在原位条件纯培养提供重要技术手段。

附图说明

图1为本发明高压环境多通道自划线分离单菌落的装置的第一种状态的结构示意图；

图2为本发明高压环境多通道自划线分离单菌落的装置的第二种状态的结构示意图；

图3为本发明高压环境多通道自划线分离单菌落的装置中多通道结构的俯视图；

图4为本发明高压环境多通道自划线分离单菌落的装置中的多通道结构的正视图；

图5为本发明高压环境多通道自划线分离单菌落的装置中的培养皿的结构示意图；

图6为本发明高压环境多通道自划线分离单菌落的装置中的中央控制系统的电路模块连接示意图；

图7为本发明高压环境多通道自划线分离单菌落的方法的流程示意图。

附图标记说明：1 - 中央控制系统；2 - 分离操作培养器；21 - 上盖；211 - 固定杆；212 - 横杆；22 - 培养室；221 - 培养皿；222 - 溢流线；223 - 斜面 - 224 - 挡板；225 - 固定孔；226 - 穿孔；227 - 连接杆；23 - 积液槽；24 - 阀门；25 - 出液口；26 -收集装置；3 - 温度控制单元；31 - 温度传感器；4 - 压力控制单元；41 - 空压机；42 -增压泵；43 - 储气罐；44 - 调压阀；45 - 进气阀；46 - 送气管道；47 - 压力传感器；5 -富集系统；51 - 富集釜；511 - 可拆卸上盖；52 - 微注泵；53 - 出液管道；54 - 喷口；6 -稀释瓶。

具体实施方式

为使本发明的发明目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

如图1至图6所示，一种高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置，其特征在于，包括有富集系统5、分离操作培养器2、中央控制系统1、温度控制单元3和压力控制单元4；

富集系统5和分离操作培养器2相连通，且富集系统5、分离操作培养室22、温度控制单元3和压力控制单元4均与中央控制系统1电连接；

富集系统5用于培养微生物，富集系统5包括有富集釜51和可拆卸上盖511；富集系统5包括有进气通道或进液通道，通过进气通道或进液通道向富集釜51中对应地注入气体或液体，向富集釜51进行增压；

中央控制系统1用于在高压环境进行环境数据变化的监控，并监控、实时采集、处理、存储和图像输出；温度控制单元3用于检测和调节富集系统5和分离操作培养器2内的温度变化；压力控制单元4用于检测和调节富集系统5和分离操作培养器2内的压力变化，并向分离操作培养器2注入气体或液体进行增压；

分离操作培养器2包括有培养室22，培养室22内设置有多个培养皿221，多个培养皿221竖向或横竖交错设置，每个培养皿221形成一个通道。

作为本发明的第一种实施方式，多个培养皿221上下层式设置，每层培养皿221交错设置；培养室22内设置有垂直于培养室22底部的固定杆211，固定杆211上横向设置有多根横杆212；

每个培养皿221呈长方体状，培养皿221的两侧上开设有固定孔225，培养皿221的另外一侧上设置有斜面223，斜面223的上边形成溢流线222，且斜面223的两侧设置有挡板224，培养皿221的下面设置有穿孔226，穿孔226设置在培养皿221的靠近斜面223的端部，多个所述培养皿221在竖直方向形成一个完整通道；固定孔225穿设在横杆212上，穿孔226中穿设有连接杆227，连接杆227用于连接上下两层设置在培养皿221。

作为本发明的第二种实施方式，每个培养皿221之间的垂直距离大于等于培养皿221自身的高度；当培养皿221倾斜时，培养皿221呈“Z”字型，且上层培养皿221倾斜的一端与下层培养皿221非斜面223的一端内部接触。

作为本发明的第三种实施方式，培养室22内设置有至少三层培养皿221，至少三层培养皿221包括有第一分离层、第二分离层和第三分离层；每层分离层包括有至少一个培养皿221。

作为本发明的第四种实施方式，分离操作培养器2还连接有稀释瓶6，稀释瓶6向培养皿221内注入无菌水。

作为本发明的第五种实施方式，富集系统5通过送液管道和分离操作培养器2相连通，且送液管道上还设置有微注泵52；富集系统5通过送液管道、微注泵52和喷口54把培养液注入分离操作培养器2；喷口54的数量和在同一平面上的培养皿221的数量相一致；

培养室22内还设置有积液槽23，积液槽23与最底层培养皿221的斜面223操持接触；积液槽23还连通过第二管道与收集装置26相连通，第二管道上还设置有阀门24。

作为本发明的第六种实施方式，富集釜51包括有可拆卸上盖511；富集釜51内的顶部设置有搅拌杆；进气管道和进液管道上均安装有阀门24；富集釜51还设置有调节阀的取样口；富集釜51放置在高温或低温的水域中，或放置在空气换热试恒温房中；富集系统5还包括有微注泵52和出液管道53。

在本发明高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置中，通过富集系统5培养得到纯度较高的目标性微生物，同时通过自动多级划线将菌液在不同固体培养基上的分离，获得单个的微生物菌落。整个富集和分离的全过程都在微生物原位压力、温度环境条件下进行。

压力控制单元4主要是用于向微生物分离培养室22内注入气体增压，使得分离操作培养器2内的压力环境与微生物在海洋原位所处的压力值一致，同时监控分离操作培养器2内的压力变化。其中，压力控制单元4包括有压力传感器47和增压系统，通过压力传感器47实时监控培养室22内的压力变化，通过主动充气/放气进行培养室22的增压、减压，使培养室22和分离室内的压力值保持与微生物生长的海洋环境条件一致。

增压系统主要包括空压机41、增压泵42、储气罐43、调压阀44、进气阀45、送气管道46及管阀件等配件组成。本发明涉及的温度控制系统主要是监控富集釜51和分离操作培养器2内的温度变化。本发明涉及的中央控制系统1包括数据采集器、数据中央处理器、操作电脑等实现微生物富集菌在高压环境进行富集、分离、纯化过程中各项环境数据信息变化的监控、以及实时采集、处理、存储和图像输出等功能。

详细地说，在本发明中，通过富集系统5培养目标微生物，得到纯度较高的目标菌群后，在保压情况下进入分离操作培养器2进行固体培养分离，并且通过不同培养基和环境条件的组合工艺同时筛选，得到纯培养菌株。

富集系统5包括有富集釜51，富集釜51为可拆卸上盖511式结构设计，方便放入培养底物和灭菌操作处理。富集釜51顶部设计有搅拌杆，可通过手动或者机械搅拌增强传质，增强培养过程中基质的反应过程，增加微生物的能量和营养利用效率。富集釜51本体安装有压力、温度传感器31，实时监测富集釜51内的温度和压力变化。富集釜51的恒温条件维持主要是将富集釜51安放于温度监控的高/低温水浴中，通过与水浴系统的热交换作用，维持富集釜51内的恒温状态。或者将培富集釜51放置于空气换热式恒温房中，富集釜51的顶部设置有进气通道和进液通道，通道上均设置有调节阀，通过进气和进液通道内注入培养需要的气体（或惰性气体）和液体来向密闭式富集釜51内增压，实现富集釜51内的压力值与其原位实际高压环境一致。富集釜51设置有调节阀的取样口，用于对富集过程中取样进行分析检测，以便进行相应的环境参数调整，优化富集培养的流程。

进一步的，富集系统5包括富集釜51、送液管道、微注泵52、阀门24、出液管道53、喷口54，需要在分离操作培养器2分离的菌液来自富集釜51，并通过送液管道和微注泵52进入喷口54；喷口54的数量与多通道的数量保持一致，且喷口54位于多通道最左边的正上方，其目的在于每个通道均可获得相同的菌液。为了保证整个装置的压力稳定，该管道上均设置有阀门24。分离操作培养器2包括上部设有的盖体和下部设有的分离区以及底部的支脚，分离区设置在培养室22中，盖体与分离区通过卡扣连接。

通过前期室内长期富集培养，并在定向营养条件供给胁迫下，获得高度纯化的目标微生物。目标微生物的分离转移可以通过微注泵52将富集釜51中的富集液通过取样口取出泵入分离操作培养器2中。在整个富集与分离纯化培养的过程中，培养釜内的温度、压力环境条件都与微生物在深海的环境条件一致，保证富集培养的有效性。

分离操作培养器2是利用多通道自动划线将菌液在固体培养基上分离的原理，将富集系统5的微生物富集培养液通过微注泵52注入分离操作培养器2的最上层培养皿221内，通过菌液自身具有的重力初步分离出单个菌落，再结合稀释瓶6往培养皿221内注入无菌水，使得在培养皿221上未分开的单菌落被冲分开，菌液逐渐再培养皿221内形成单个菌落。

本发明还包括有分离支架，为了有效的利用空间，本发明采用圆台或圆柱式微生物分离支架，这样在有限的空间内最大程度的增加了能够供微生物分离培养的面积。分离区内设有有培养皿221，培养皿221的穿孔226与固定杆211上的横杆212通过紧固装置连接，连接后的培养皿221可以在横杆212上自由左右移动，培养皿221在横杆212上的位置并非对称放置，其中，培养皿221具有斜面223的一端比另一端距离横杆212近，这样可以保证培养皿221在重力的作用下在水平方向出现倾斜。培养皿221的数量根据实验需要大于等于一个，为了保证培皿内的菌液具有较好的流动性，每个培养皿221之间的垂直距离大于等于培养皿221自身的高度，每层的培养皿221交错放置，保证培养皿221在重力的作用下可以呈现“Z”字型，且上层培养皿221有倾斜的一端与下层非斜面223一端内部接触。

培养室22由培养皿221、溢流线222、斜面223、挡板224、固定孔225、穿孔226和连接杆227组成，穿孔226为圆形，其目的是与固定杆211上的横杆212匹配，使得培养皿221可以在固定杆211上；溢流线222低于培养皿221的高度，目的是使得在倾倒培养基的过程中，多余的培养基可以通过溢流线222进入下一个培养基；挡板224位于斜面223上，主要用于培养基通过斜面223流入下一个培养皿221时不会流出；穿孔226位于培养皿221侧面的上下各一个，与连接杆227相互配对，其目的是在倾倒培养基时，可以保证培养皿221位于水平方向，培养皿221内的培养基可以保持水平，多余的培养基可以通过斜面223流入下一个培养皿221内，最后多余的培养基则进入积液槽23。分离操作培养器2内还包括积液槽23、阀门24、出液口25和收集装置26，积液槽23主要用于收集多余的培养基和菌液，积液槽23与多通道最底层培养皿221的斜面223操持接触，这样使得多余的培养基和菌液可以流入到积液槽23内；通过控制出液口25的双阀门24，可以使得多余的菌液通过出液口25流出至收集装置26。

本发明涉及的培养皿221属于多通道放置，每个通道为垂直放置，多个通道则水平放置，每个培养室22的固定方式均与固定杆211连接，其目的是可以在分离操做培养器内进行多个分离培养通道，提高单个微生物的分离效率，同时，每个通道内可以填充有不同营养配比培养基质的固体培养基。分离通道的数目应与进液口的数目保持一致。

在本发明中所采用的高压环境自动多级划线分离多类型单菌落技术。首先是将富集釜51及其附带管阀件进行灭菌处理，然后依次装入待培养的底物如深海沉积物、与微生物共生的宏生物组织及提取液等，然后从注液口装入培养需要的营养液，然后从注气口注入培养需要的气体（若不需要可注入惰性气体）使得培养腔内的压力值增加至与深海实际环境条件一致。在培养的过程中，通过顶部的搅拌装置进行搅拌，增加传质作用，优化培养进程。

作为本实施方式的一个实施例，在分离操作培养器2中设置有至少三层培养皿221，分别为第一分离层、第二分离层、第三分离层，分离层的数量可以自行根据实验需求决定，此处不做限制。

当富集过程的目标菌液浓度经鉴定达到需求后，进入分离培养过程。分离培养过程主要包括，首先，将分离操作培养器2及其内部所有器件及相关的管阀件进行灭菌处理，保持无菌状态。安装好培养皿221在固定杆211上的位置，并采用连接杆227连接培养皿221侧面的穿孔226，使得培养皿221位于水平位置，然后，在培养室22的上层培养皿221上缓慢填充好灭菌后的固体培养基，第一分离层多余的培养基则流入下一层，以此类推，每个培养皿221内均装入等量的培养基。倾倒过程多余的培养基则流入积液槽23。待培养基凝固后，取掉连接装置，使得培养皿221在重力的重用下出现倾斜，以此类推，最后每个通道均形成“Z”字型。然后，合上上盖21，开启高/低温水浴系统，保证分离操作培养器2的温度与微生物在海洋环境的温度条件一致。然后通过注气口注入气体增压，使分离操作培养器2内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致。确保所有系统部件工作正常后，再开启微注泵52通过从富集釜51内向分离操作培养器2内注入微生物富集液，微生物富集液滴落在第一分离层的左边的培养基表面。

微生物富集液体的单菌落分离一共分为三次，第一次在第一分离层内进行，滴落在第一分离层的菌液在重力的作用下自动向下流动，依次经过第二分离层、第三分离层，流动的过程中逐渐初步分离成单个菌落。当经过一段时间后（时间可以自己掌控），通过微注泵52将稀释瓶6内的无菌水，缓慢注入分离操作器内的第一分离层的平板上，无菌水在重力作用下（无菌水的注入量可以根据富集液中的菌落数自行设置体积），逐渐向下流动，无菌水在流动的过程中将再次稀释原有流动在培养基表面的菌液，使得微生物富集液达到最大程度的稀释。为防止培养基表面的菌液全部被洗掉，无菌水的注入量不宜过多，注入的无菌水体积应小于流出到积液槽23无菌水的体积。每个通道均按照上述方式操作，这样就逐步完成在高压环境下，通过重力作用自动多级分离出单菌落。每个通道通过逐步稀释培养基表面的菌液，使得微生物富集液体被分离成单个菌落的概率得到提高，而不是只有一次分离，且随着每个通道内的培养基类型差异，可获得多类型的单菌落。

如图7所示，本发明还提供了高压环境多通道自动划线分离多类型单菌落的方法，使用如上述的高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置，包括有以下步骤：

S1、富集过程中的目标菌液浓度达到需求后，进入分离培养过程；

S2、分离操作培养器2进行灭菌处理，保持无菌状态；

S3、在分离区的底部上填充灭菌后的固体培养基，并摆放培养皿221的位置；

S4、开启水浴系统，保证分离操作培养器2的温度与微生物在海洋环境的温度条件一致；

S5、向分离操作培养器2中注入气体或液体，使分离操作培养器2增压，使分离操作培养器2内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致；

S6、通过微注泵52从富集釜51向分离操作培养器2内注入微生物富集液，滴落在第一分离层的菌液在重力下自动向下流动，依次经过第二分离层、第三分离层，在流动的过程中初步分离成单个菌落；

S7、通过微注泵52将稀释瓶6内的无菌水注入至第一分离层的平板上，无菌水在重力的作用下向下流动，且无菌水在流动的过程中再次稀释原有流动在培养基表面的菌液，使微生物富集液达到最大程度的稀释；

S8、按照S6和S7的方式，依次进行多通道分离单菌落。

详细地说，首先是将富集釜51及其附带管阀件进行灭菌处理，然后依次装入待培养的底物如深海沉积物、与微生物共生的宏生物组织及提取液等，然后从注液口装入培养需要的营养液，然后从注气口注入培养需要的气体（若不需要可注入惰性气体）使得培养腔内的压力值增加至与深海实际环境条件一致。在培养的过程中，通过顶部的搅拌装置进行搅拌，增加传质作用，优化培养进程。

当富集过程的目标菌液浓度经鉴定达到需求后，进入分离培养过程。分离培养过程主要包括，首先，将分离操作培养器2及其内部所有器件及相关的管阀件进行灭菌处理，保持无菌状态。安装好培养皿221在固定杆211上的位置，并采用连接杆227连接培养皿221侧面的穿孔226，使得培养皿221位于水平位置，然后，在培养室22的上层培养皿221上缓慢填充好灭菌后的固体培养基，第一分离层多余的培养基则流入下一层，以此类推，每个培养皿221内均装入等量的培养基。倾倒过程多余的培养基则流入积液槽23。待培养基凝固后，取掉连接装置，使得培养皿221在重力的重用下出现倾斜，以此类推，最后每个通道均形成“Z”字型。然后，合上上盖21，开启高/低温水浴系统，保证分离操作培养器2的温度与微生物在海洋环境的温度条件一致。然后通过注气口往培养室22内注入气体增压，使分离操作培养器2内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致。确保所有系统部件工作正常后，再开启微注泵52通过从富集釜51内向分离操作培养器2内注入微生物富集液，微生物富集液滴落在第一分离层的左边的培养基表面。

微生物富集液体的单菌落分离一共分为三次，第一次在第一分离层内进行，滴落在第一分离层的菌液在重力的作用下自动向下流动，依次经过第二分离层、第三分离层，流动的过程中逐渐初步分离成单个菌落。当经过一段时间后（时间可以自己掌控），通过微注泵52将稀释瓶6内的无菌水，缓慢注入分离操作器内的第一分离层的平板上，无菌水在重力作用下，逐渐向下流动，无菌水在流动的过程中将再次稀释原有的流动在培养基表面的菌液，使得微生物富集液到达最大程度的稀释。为防止培养基表面的菌液全部被洗掉，无菌水的注入量不宜过多，注入的无菌水体积应小于流出到积液槽23无菌水的体积。多余的菌液和无菌水则进入积液槽23。每个通道均按照上述方式操作，这样就逐步完成在高压环境下，通过重力作用自动多级分离出单菌落。每个通道通过两次在重力作用下，微生物富集液体被分离成单个菌落的概率得到提高，而不是只有一次分离，且随着分离培养区内的培养基类型差异，可获得不同营养状态的单菌落。

基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (5)

1.高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置，其特征在于，包括有富集系统、分离操作培养器、中央控制系统、温度控制单元和压力控制单元；

所述富集系统和所述分离操作培养器相连通，且所述富集系统、所述分离操作培养器、所述温度控制单元和所述压力控制单元均与所述中央控制系统电连接；

所述富集系统用于培养微生物，所述富集系统包括有富集釜和可拆卸上盖；所述富集系统包括有进气通道或进液通道，通过所述进气通道或所述进液通道向所述富集釜中对应地注入气体或液体，向所述富集釜进行增压；

所述分离操作培养器包括有培养室，所述培养室内设置有多个培养皿，多个所述培养皿竖向或横竖交错设置，每个所述培养皿形成一个通道；

所述中央控制系统用于在高压环境进行环境数据变化的监控，并监控、实时采集、处理、存储和图像输出；所述温度控制单元用于检测和调节所述富集系统和所述分离操作培养器内的温度变化；所述压力控制单元用于检测和调节所述富集系统和所述分离操作培养器内的压力变化，并向所述分离操作培养器注入气体或液体进行增压；

多个所述培养皿上下层式设置，每层所述培养皿交错设置；

所述培养室内设置有垂直于所述培养室底部的固定杆，所述固定杆上横向设置有多根横杆；

每个所述培养皿呈长方体状，所述培养皿的两侧上开设有固定孔，所述培养皿的另外一侧上设置有斜面，所述斜面的上边形成溢流线，且所述斜面的两侧设置有挡板，所述培养皿的下面设置有穿孔，所述穿孔设置在所述培养皿的靠近所述斜面的端部，多个所述培养皿在竖直方向形成一个完整通道；

所述固定孔穿设在所述横杆上，所述穿孔中穿设有连接杆，所述连接杆用于连接上下两层设置在所述培养皿；每个所述培养皿之间的垂直距离大于等于所述培养皿自身的高度；

当上下两层培养皿通过连接杆连接时，培养皿为水平状态；当上下两层培养皿未通过连接杆连接时，培养皿为倾斜状态，多个上下层设的培养皿在重力的作用下呈现“Z”字型，且上层所述培养皿倾斜的一端与下层所述培养皿非斜面的一端内部接触；

所述分离操作培养器还连接有稀释瓶，所述稀释瓶向所述培养皿内注入无菌水。

2.根据权利要求1所述的高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置，其特征在于，所述培养室内设置有至少三层所述培养皿，至少三层所述培养皿包括有第一分离层、第二分离层和第三分离层；每层所述分离层包括有至少一个所述培养皿。

3.根据权利要求1所述的高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置，其特征在于，所述富集系统通过送液管道和所述分离操作培养器相连通，且所述送液管道上还设置有微注泵；所述富集系统通过所述送液管道、所述微注泵和喷口把培养液注入所述分离操作培养器；所述喷口的数量和在同一平面上的所述培养皿的数量相一致；

所述培养室内还设置有积液槽，所述积液槽与最底层培养皿的斜面操持接触；所述积液槽还连通过第二管道与收集装置相连通，所述第二管道上还设置有阀门。

4.根据权利要求1所述的高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置，其特征在于，所述富集釜包括有可拆卸上盖；所述富集釜内的顶部设置有搅拌杆；所述进气通道和所述进液通道上均安装有阀门；所述富集釜还设置有调节阀的取样口；所述富集釜放置在高温或低温的水域中，或放置在空气换热试恒温房中；所述富集系统还包括有微注泵和出液管道。

5.高压环境多通道自动划线分离单菌落的方法，其特征在于，使用如权利要求1-4任意一项所述的高压环境多通道自动划线分离单菌落的装置，包括有以下步骤：

S1、富集过程中的目标菌液浓度达到需求后，进入分离培养过程；

S2、分离操作培养器进行灭菌处理，保持无菌状态；

S3、在分离区的底部上填充灭菌后的固体培养基，并摆放培养皿的位置；

S4、开启水浴系统，保证分离操作培养器的温度与微生物在海洋环境的温度条件一致；

S5、向所述分离操作培养器中注入气体或液体，使分离操作培养器增压，使分离操作培养器内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致；

S6、通过富集系统中的微注泵从富集釜向分离操作培养器内注入微生物富集液，滴落在最上方的分离层的菌液在重力下自动向下流动，依次经过其他分离层，在流动的过程中初步分离成单个菌落；

S7、通过微注泵将稀释瓶内的无菌水注入至第一分离层的平板上，无菌水在重力的作用下向下流动，且无菌水在流动的过程中再次稀释原有流动在培养基表面的菌液，使微生物富集液达到最大程度的稀释；

S8、按照S6和S7的方式，依次进行多通道分离单菌落。