CN115869458B

CN115869458B - 一种用于止血的组合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN115869458B
Application number: CN202211676742.7A
Authority: CN
Inventors: 解慧琪; 雷雄心; 邹晨宇; 胡娟娟
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-12-26
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2024-07-16
Anticipated expiration: 2042-12-26
Also published as: CN115869458A

Abstract

本发明提供了一种用于止血的组合物及其制备方法和用途，属于医用材料领域。本发明组合物由如下重量配比的组分组成：不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐1～10份，硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖1～10份。本发明组合物可制备成止血粉，具有快速自凝胶化特点，与血液接触后可以快速自凝胶化，对创面起到封闭作用，防止创面出血，止血效果优异。此外，本发明止血组合物还可以制备成止血水凝胶，该止血水凝胶兼具ESD黏膜垫作用和对术后伤口起封闭、止血、修复的“双功能”的材料，同时解决现有ESD中SFC材料衬垫效果差、术中/后并发症等问题。本发明止血组合物可一物多用，且止血效果优异，具有广阔的临床应用前景。

Description

一种用于止血的组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医用材料领域，具体涉及一种用于止血的组合物及其制备方法和用途。

背景技术

急性创伤后的不可控出血是导致伤亡的主要原因。目前，临床上常用的止血手段难以在战场、事故和院前急救等情景使用。因此，各种形式的止血材料被研发，包括粉末、海棉、纱布和水凝胶。其中，粉末类止血材料使用便捷、易储存、在不规则伤口中具有良好的适应性，此外，粉末基止血材料比表面积大和吸水率高能充分浓缩血液中凝血成分，在临床和战场中有广泛的应用。止血凝胶也是止血常用的手段，与止血粉相比，其主要具有优异的可注射性和可塑形性，可更加与创面贴合实现止血。特别适用于体内止血。

然而，传统的止血粉抗血压能力弱，在伤口大出血时使用易被血液冲刷分散，导致止血失败。目前市场上出现的止血凝胶产品多是由纤维蛋白制作而成，除此之外，明胶、透明质酸以及壳聚糖等材料也逐渐被使用，但是现有的止血凝胶也往往存在粘附能力较弱的缺点，容易被血液冲掉，降低其止血效果。

因此，如何提升现有止血粉末和止血凝胶的抗血压能力，扩展它们在大出血伤口中的应用是当期亟需解决的问题。其中，设计一种在喷洒到创面后可通过与血液后接触后快速自凝胶化，并起到快速封堵创面和浓缩血液中的凝血因子目的的自凝胶化止血材料将具有重要的使用价值和临床应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于止血的组合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种用于止血的组合物，它是由如下重量配比的组分组成：

不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐1～10份，硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖1～10份。

进一步地，前述的组合物是由如下重量配比的组分组成：

不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐3～7份，硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖3～7份。

进一步地，前述的组合物是由如下重量配比的组分组成：

不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐7份，硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖3份。

进一步地，所述不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐中海藻酸盐氧化度为14％～50％；和/或，所述不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐中不饱和碳碳双键接枝率为24％～37％；

和/或，所述硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖中硫醇接枝率为24％～52％。

进一步地，所述不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐为马来酰亚胺接枝改性的氧化海藻酸盐；和/或，所述硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖为半胱胺盐酸盐接枝改性的羧甲基壳聚糖；

优选地，所述海藻酸盐为海藻酸钠；和/或，所述羧甲基壳聚糖为取代度小于1的O-羧甲基壳聚糖。

进一步地，所述不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐为马来酰亚胺接枝改性的氧化海藻酸钠，所述马来酰亚胺接枝改性的氧化海藻酸钠的制备方法包括如下步骤：

(1)将氧化海藻酸钠溶于溶剂中，溶解得到氧化海藻酸钠溶液；

(2)在氧化海藻酸钠溶液中加入EDC和NHS，再加入马来酰亚胺盐酸盐，反应；

(3)反应后，透析，干燥，即得马来酰亚胺接枝改性的氧化海藻酸钠；

优选地，

步骤(1)中，所述溶剂为MES溶液、PBS溶液或去离子水；和/或，步骤(1)中，所述氧化海藻酸钠溶液的质量百分含量为1％～3％；

和/或，步骤(2)中，所述氧化海藻酸钠物质的量与EDC和NHS总物质的量之比为1：1.5～3；和/或，步骤(2)中，所述EDC和NHS的摩尔比或质量比是1：1～1.5；和/或，步骤(2)中，所述氧化海藻酸钠物质的量与马来酰亚胺盐酸盐物质的量之比为1:1～2；和/或，步骤(2)中，所述反应为室温反应12～24h；

和/或，步骤(3)中，所述透析时先置于0.01～0.05M HCl去离子水溶液中透析3～5天，再置于去离子水中透析12～24h；

更优选地，

步骤(2)中，所述反应时，每6h调一次反应液的pH，保持pH值在5.0～5.5；

和/或，步骤(3)中，所述透析袋截留量为3.5～8kDa；和/或，步骤(3)中，所述透析时每6～12h换一次水。

进一步地，所述硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖合成方法包括如下步骤：

1)将羧甲基壳聚糖溶于溶剂中，溶解得到羧甲基壳聚糖溶液；

2)在羧甲基壳聚糖溶液中加入EDC，再加入半胱胺盐酸盐，反应；

3)反应后，透析，冷冻干燥，醇析，即得巯基羧甲基壳聚糖；

优选地，

步骤1)中，所述溶剂为去离子水或PBS溶液；和/或，步骤1)中，所述羧甲基壳聚糖溶液的质量百分含量为2～5％；

和/或，步骤2)中，所述羧甲基壳聚糖物质的量与EDC物质的量之比为1:1.5～3；和/或，步骤2)中，所述羧甲基壳聚糖物质的量与半胱胺盐酸盐物质的量之比为1:1～2；和/或，步骤2)中，所述反应为室温反应12～24h；

和/或，步骤3)中，所述透析时置于0.005～0.05M的硼砂溶液中透析3～5天，再置于去离子水中透析12～24h；和/或，步骤3)中，所述冷冻干燥前加入DTT搅拌反应；和/或，步骤3)中，所述醇析使用无水乙醇；

更优选地，

步骤3)中，所述透析袋截留量为3.5～8kDa；和/或，步骤(3)中，所述透析时每12h换一次水。

本发明还提供了前述的组合物在制备止血粉中的用途。

本发明还提供了前述的组合物在制备止血粉水凝胶或消化道ESD用水凝胶中的用途。

本发明的术语解释：

本发明所述“接枝改性”是指：聚合物主链上通过化学键结合连接特定的支链结构或功能性侧基的反应。本发明“接枝率”是指：接枝率(％)＝(结合连接到聚合物主链上的支链结构或功能性侧基的物质的量/聚合物主链的物质的量)*100％。

本发明所述“氧化海藻酸盐”是指：对海藻盐进行氧化改性，使得海藻盐结构中的部分糖醛酸单元C2和C3位置的羟基转变为醛基，示意结构式为：其中羧酸根与带1个正电荷的阳离子(例如Na⁺、K⁺)结合。

本发明所述海藻酸盐优选为海藻酸钠，氧化海藻酸盐优选为氧化海藻酸钠，示意结构式为：

本发明所述“含有不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐”是指：海藻酸盐分子糖醛酸单元经过NaIO₄氧化生成醛基，并接枝了含有不饱和碳碳双键基团的结构，进而形成的聚合物。

本发明所述“不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐”是指氧化海藻盐分子链上接枝修饰上“含有不饱和碳碳双键”的马来酰亚胺基形成的改性氧化海藻盐(改性氧化海藻酸盐钠)的聚合物；马来酰亚胺基团的结构式为：

本发明所述“含硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖”是指：羧甲基壳聚糖的分子链上接枝了含有巯基的半胱胺盐酸盐，进而形成的聚合物。巯基基团结构式为：

本发明所述“消化道ESD”，是指：在内镜辅助下对消化道病变组织进行的内镜黏膜下剥离术。

本发明所述“一种ESD术后喷洒溶液”是指：在消化道ESD术后在创面喷洒巯基接枝改性的羧甲基壳聚糖溶液。

本发明所述“室温”是指：25±5℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的改性海藻酸钠溶液具有良好的组织匹配性，可适应任何形状的不规则创面；

2、本发明提供的改性海藻酸钠溶液在食管黏膜下能维持持久的衬垫高度；

3、本发明提供的改性海藻酸钠溶液递送方便，可通过内镜针递送到任何部位和形状的病灶部位处，并通过喷洒改性羧甲基壳聚糖溶液原位成胶，成胶时间可控制在3～10s；更优选为5s；

4、本发明提供的原位水凝胶具有良好的组织粘附性，不易随组织蠕动脱落；所述原位水凝胶顶破强度为9.51±1.20kPa，与纤维蛋白胶的顶破强度为10.16±0.78kPa无显著差异；

5、本发明提供的原位水凝胶具有快速封闭伤口，起快速止血的作用；所述原位水凝胶止血时间为91.33±16.65s，与纤维蛋白胶的止血时间78.00±29.21s无显著差异；

6、本发明提供的原位水凝胶良好的抗菌性能，可预防创面感染细菌，减小炎症和溃疡的发生率；所述水凝胶在犬食管ESD术后能封闭手术创面，能加快创面愈合，抑制食管纤维化形成。

7、本发明止血粉接触液体(如血液)后能基于迈克尔加成及席夫碱等反应，快速自凝胶化(≤5s)，封闭血管和创面，防止进一步出血。

8、本发明止血粉具有促进血细胞激活聚集和纤维蛋白原吸附活化的协同促凝能力，止血效果优异。

9、本发明止血粉采用粉末使用形式，使其能更好的适用于不规则创面以及深度创面止血。

10、本发明止血粉可以制备成喷雾使用形式，方便携带与使用。

不管是公开号为CN114159586A的专利申请公开的黏膜下注射材料，还是纤维蛋白胶，在用于ESD中只能起到单方面的作用；或者是黏膜下衬垫作用(公开号为CN114159586A的专利申请公开的材料)，或者是组织封闭作用(纤维蛋白胶)。本发明的“双功能”水凝胶旨在同时解决上述两个问题，水凝胶中组分a——改性海藻酸钠(AM溶液)，在ESD术前能起到黏膜下衬垫作用，ESD术后通过在伤口处喷洒组分b——改性羧甲基壳聚糖(CS溶液)，CS溶液与ESD术后暴露的AM溶液接触后快速成胶，形成的水凝胶对创面起封闭作用，能有效防止创面与腔道开放环境接触而导致感染或溃疡形成，起到止血和愈合伤口的作用。

综上，本发明提供了一种止血组合物，该止血组合物由不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐和硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖按照特定比例组合物而成。本发明组合物具有优异的止血性质，该组合物可制备成止血粉，该止血粉具有快速自凝胶化特点，与血液接触后可以快速自凝胶化，对创面起到封闭作用，防止创面出血，同时该止血粉具有促进血细胞激活聚集和纤维蛋白原吸附活化的协同促凝能力，因此该止血粉止血效果优异。此外，本发明止血粉采用粉末形式，适用于不同创面的止血，如不规则创面、深度创面以及较大血管破坏性创面。本发明止血粉可以制备成喷雾形式，携带和使用更加方便。此外，本发明止血组合物还可以制备成止血水凝胶，该止血水凝胶兼具ESD黏膜垫作用和对术后伤口起封闭、止血、修复的“双功能”的材料，同时解决现有ESD中SFC材料衬垫效果差、术中/后并发症等问题。本发明止血组合物可一物多用，且止血效果优异，具有广阔的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为ADA-Mal和CMCS-SH两种物质的合成示意图。

图2为马来酰亚胺基氧化海藻酸钠(ADA-Mal)和巯基羧甲基壳聚糖(CMCS-SH)改性前后FTIR图。

图3为马来酰亚胺基氧化海藻酸钠(ADA-Mal)和巯基羧甲基壳聚糖(CMCS-SH)改性前后的¹HNMR图(400MHz)。

图4为止血粉相关表征结果：a为止血粉的制备流程图；b为ADA-Mal(AM)粉末的粒径分布；c为CMCS-SH(CS)粉末的粒径分布；d为ADA-Mal粉末、CMCS-SH粉末及AM7-CS3止血粉的大体图；e为AM7-CS3止血粉促进血液凝固的能力。

图5为不同比例止血粉(AM7-CS3，AM5-CS5，AM3-CS7)的流变学性能评价。

图6为本发明止血粉(AM7-CS3)在PBS和抗凝全血中的凝胶化评价，以云南白药止血粉(CP)和未改性海藻酸钠-羧甲基壳聚糖混合粉末(SA-CMCS)做为对照。

图7为本发明止血粉体外促凝活性的评价结果：a为红细胞在纤维蛋白胶(FibrinGlue)、纱布(Gauze)和本发明止血粉(AM7-CS3)上粘附的扫描电镜图；b为血小板在纤维蛋白胶(Fibrin Glue)、纱布(Gauze)和本发明止血粉(AM7-CS3)自凝胶化后的胶上粘附的扫描电镜图；c为LDH检测结果；d为FIB检测结果(*p<0.05，****p<0.0001，ns：无显著性差异)。

图8为本发明止血粉在大鼠肝脏截断出血模型中的应用：a为不同处理方式的止血过程记录图；b为不同处理方式后的出血量；c为不同处理方式后的止血时间(**p<0.01，ns：无显著性差异)。

图9为本发明止血粉在比格犬肝脏穿孔出血模型中的应用效果：a为止血过程示意图；b为不同处理方式后的出血量；c为不同处理方式的止血过程记录图；d为止血后2周创面的HE染色结果(*p<0.05，**p<0.01，ns：无显著性差异)。

图10为不同质量百分含量的ADA-Mal和CMCS-SH的粘度流变学分析：A为ADA-Mal(AM)；B为CMCS-SH(CS)。

图11为不同质量百分含量的ADA-Mal溶液的皮下衬垫效果的超声检测结果：A为超声图像；B为统计结果；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。

图12为不同质量百分含量的ADA-Mal和CMCS-SH水凝胶(AxCy)的力学检测结果：A为应力应变曲线；B为压缩强度；C为杨氏模量；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。

图13为不同质量百分含量的ADA-Mal和CMCS-SH水凝胶(AxCy)的溶胀与降解性能检测结果：A为溶胀率；B为残留质量百分比。

图14为不同质量百分含量的ADA-Mal和CMCS-SH混合后的成胶时间；其中，水凝胶组合以AxCy表示，A代表ADA-Mal，C表示CMCS-SH，x和y分别表示ADA-Mal和CMCS-SH的质量百分含量；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。

图15为对水凝胶的组织粘附性进行的评价；A为A7C3水凝胶在猪皮表面粘附行为；B为模拟水凝胶对不规则伤口的粘附行为。

图16为A7C3组水凝胶(A7C3 Gel)和纤维蛋白胶组(Fibrin Glue，图中为Fib Gel)的顶破强度检测；A为水凝胶顶破强度检测装置；B为顶破强度检测装置工作原理示意图；C为纤维蛋白胶与A7C3水凝胶组顶破强度大小统计。

图17为评价A7C3组水凝胶作为组织封闭剂在兔肝脏出血模型(体外)中的止血效果；A为未经治疗的对照组和使用纤维蛋白胶和A7C3组水凝胶治疗的样本组在0～120s内的止血效果图片；B、C分别为与纤维蛋白胶组和对照组(未经任何治疗)相比，使用A7C3水凝胶干预后兔肝脏的出血量和出血时间(*p<0.05)。

图18为犬食道ESD操作流程。

图19为ESD手术操作过程及AM7溶液在犬食管黏膜下衬垫效果评价；A为便携式内镜系统及ESD手术操作；B为ESD黏膜下注射流程，包括病灶定位、电刀标记、黏膜下注射溶液；C为比较甘油果糖注射液(GFI)和AM7溶液在犬食管黏膜下垫起高度随时间变化(30min内)。

图20为水凝胶在犬食管ESD中的应用；A为内镜黏膜下注射AM7溶液垫起病灶；B为对病灶进行切除；C为清理创面暴露病灶(针对黏膜下肿瘤)；D为切除表面黏膜后暴露的AM7溶液(或切除黏膜下肿瘤后回填的AM7溶液)；E为在AM7溶液上喷洒CS3溶液后原位水凝胶形态；F为原位水凝胶在创面稳定10min后的形态；(“△”指示为AM7溶液；“→”指示为创面水凝胶)。

图21为ESD分组及术后各时间点创面愈合情况观察：A为ESD手术分组：在每只犬的食管的近心端(离心脏近的位点定义为近心端。)和远心端(离口近的手术位点定义为远心端)开展两个手术点，每个食道的两个手术点处理方式如图A中分组所示(n＝5)；B为观察每个实验组在0、3、9、14、21、28天的伤口愈合情况(黄色“△”指示处为腺体)。

图22为ESD术后28天各实验组取材后食管形态图；A为A7C3 Gel组和AM7溶液组术后食管形态图；B为AM7溶液组和GFI组术后食管形态图；C为GFI组和GFI+CS3组术后食管形态图；D为GFI+CS3溶液组和A7C3 Gel组术后食管形态图；E为A7C3 Gel组和GFI+CS3溶液组术后食管形态图；F为正常食管的形态；(图中①表示远心端第一个实验位点；②表示第二个手术位点)。

具体实施方式

除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明所用氧化海藻酸钠(ADA)为购买市售产品或按照如下方法合成：

1、称取10g海藻酸钠(SA)分散于50mL无水乙醇中，磁力搅拌器至分散均匀，制备得到质量百分含量为20％的海藻酸钠的乙醇分散体系。

2、称取2.5g NaIO₄，避光条件环境下溶于50mL去离子水中，搅拌至完全溶解，制备得到质量百分含量为5％的NaIO₄溶液；

3、避光环境下，将NaIO₄溶液逐滴、缓慢滴加到磁力搅拌下的海藻酸钠乙醇分散溶液中；室温避光环境下，持续搅拌反应6h；

4、避光反应6h后，避光环境下往反应体系中逐滴加入10mL乙二醇，并继续搅拌反应30min，终止反应；

5、终止反应后，停止搅拌，室温静置、沉积10min，待沉淀析出；

6、小心倒出上层溶液，收集沉淀并装入截留分子量3.5kDa透析袋中，置于5L0.01M HCl去离子水溶液中透析3天，每12h换一次透析液；

7、将透析后的氧化海藻酸钠溶液收集后冷冻干燥，即得氧化海藻酸钠(ADA)。

本发明所用“含醛基和不饱和碳碳双键结构的改性的海藻酸盐”，即马来酰亚胺基氧化海藻酸钠(ADA-Mal)，按照如下方法合成：

1、称取2g ADA溶于200mL MES溶液中，搅拌至完全溶解，制备质量百分含量为1％的ADA溶液；

2、在ADA溶液中加入EDC/NHS，使得ADA与EDC/NHS物质的量之比为1:1.5(EDC和NHS的摩尔比为1:1)；往反应体系中加入马来酰亚胺盐酸盐(Mal-HCl)，使得ADA与Mal-HCl的物质的量之比为1:1，室温搅拌反应24h，每6h调一次反应液的pH，保持pH值在5.0～5.5；

3、反应24h后，将反应液转移至截留分子量3.5kDa的透析袋中，置于5L 0.01M HCl去离子水溶液中透析5天，每12h换一次透析液；待透析第5天时，将透析袋转入5L去离子水中，继续透析12h。

4、取出透析后的马来酰亚胺基氧化海藻酸钠溶液，并进行冷冻干燥，即得马来酰亚胺基氧化海藻酸钠(ADA-Mal)。

本发明所用“含有硫醇基的改性羧甲基壳聚糖”，即巯基羧甲基壳聚糖(CMCS-SH)，按照如下方法合成：

1、称取4g CMCS(羧甲基壳聚糖)溶于200mL去离子水中，搅拌至完全溶解，制备质量百分含量为2％的CMCS溶液；

2、CMCS溶液中加入EDC，使得CMCS与EDC物质的量之比为1:1.5；往反应体系中加入半胱胺盐酸盐(CSA-HCl)，使得CMCS与CSA-HCl的物质量之比为1:1.5，室温搅拌反应24h；

3、反应24h后，将反应液转移至截留量为3.5kDa中，并置于5L 0.01M的硼砂溶液中透析5天，每12h换透析液一次；

4、透析后的CMCS-SH溶液倒入烧杯中，并加入2g DTT室温继续搅拌反应1～2h后，取出并进行冷冻干燥；

5、将冷冻干燥后的CMCS-SH加入无水乙醇中，密封置于低温摇床中(4℃)60rpm振荡1h后，用抽滤瓶滤去乙醇，重复此操作5次；

6、醇析后的CMCS-SH用旋转蒸发仪除去残留乙醇，即得到巯基羧甲基壳聚糖(CMCS-SH)。

ADA-Mal和CMCS-SH两种物质的合成示意图如图1所示。

制备完成后通过傅立叶变换红外吸收光谱仪(FTIR)，核磁氢谱仪(1HNMR)对海藻酸钠和羧甲基壳聚糖改性前后产物进行表征，证实对海藻酸钠接枝改性后成功制备得到马来酰亚胺基氧化海藻酸钠(ADA-Mal)；对羧甲基壳聚糖接枝改性后成功制备得到巯基羧甲基壳聚糖(CMCS-SH)。

实施例1、本发明止血粉的制备

采用物理研磨法制备止血粉。将冻干的ADA-Mal与CMCS-SH分别放入球磨罐，液氮中冷淬15min。在50Hz下球磨3min，重复5次，每次间隔5min，制得ADA-Mal与CMCS-SH粉末。将ADA-Mal与CMCS-SH粉末按照质量比7:3混合均匀，即得止血粉(AM7-CS3粉末)，装入瓶中备用。本发明止血粉还可以装入喷雾瓶中，形成可喷雾止血粉。

实施例2、本发明止血粉的制备

采用物理研磨法制备止血粉。将冻干的ADA-Mal与CMCS-SH分别放入球磨罐，液氮中冷淬15min。在50Hz下球磨3min，重复5次，每次间隔5min，制得ADA-Mal与CMCS-SH粉末。将ADA-Mal与CMCS-SH粉末按照质量比3:7混合均匀，即得止血粉(AM3-CS7粉末)，装入瓶中备用。本发明止血粉还可以装入喷雾瓶中，形成可喷雾止血粉。

实施例3、本发明止血粉的制备

采用物理研磨法制备止血粉。将冻干的ADA-Mal与CMCS-SH分别放入球磨罐，液氮中冷淬15min。在50Hz下球磨3min，重复5次，每次间隔5min，制得ADA-Mal与CMCS-SH粉末。将ADA-Mal与CMCS-SH粉末按照质量比5:5混合均匀，即得止血粉(AM5-CS5粉末)，装入瓶中备用。本发明止血粉还可以装入喷雾瓶中，形成可喷雾止血粉。

实施例4、本发明原位水凝胶的制备

1、称取冻干后的ADA-Mal溶于PBS缓冲液中，制备质量百分含量为7％的ADA-Mal溶液；

2、称取冻干后的CMCS-SH溶于浓度为0.01M的硼砂水溶液中，制备质量百分含量为3％的CMCS-SH溶液；浓度为0.01M的硼砂水溶液的配制方法如下：称取19.05g Na₂B₄O₇·10H₂O(常温，硼砂)溶于5L去离子水中，搅拌至完全溶解；

3、将步骤(1)和(2)中的溶液按体积比为1:1均匀混合，即可制备得到A7C3水凝胶。

实施例5、本发明原位水凝胶的制备

2、称取冻干后的CMCS-SH溶于浓度为0.01M的硼砂水溶液中，制备质量百分含量为7％的CMCS-SH溶液；浓度为0.01M的硼砂水溶液的配制方法如实施例4；

3、将步骤(1)和(2)中的溶液按体积比为1:1均匀混合，即可制备得到A7C7水凝胶。

实施例6、本发明原位水凝胶的制备

1、称取冻干后的ADA-Mal溶于PBS缓冲液中，制备质量百分含量为3％的ADA-Mal溶液；

3、将步骤(1)和(2)中的溶液按体积比为1:1均匀混合，即可制备得到A3C7水凝胶。

实施例7、本发明原位水凝胶的制备

1、称取冻干后的ADA-Mal溶于PBS缓冲液中，制备质量百分含量为4％的ADA-Mal溶液；

2、称取冻干后的CMCS-SH溶于浓度为0.01M的硼砂水溶液中，制备质量百分含量为6％的CMCS-SH溶液；浓度为0.01M的硼砂水溶液的配制方法如实施例4；

3、将步骤(1)和(2)中的溶液按体积比为1:1均匀混合，即可制备得到A4C6水凝胶。

实施例8、本发明原位水凝胶的制备

1、称取冻干后的ADA-Mal溶于PBS缓冲液中，制备质量百分含量为5％的ADA-Mal溶液；

2、称取冻干后的CMCS-SH溶于浓度为0.01M的硼砂水溶液中，制备质量百分含量为5％的CMCS-SH溶液；浓度为0.01M的硼砂水溶液的配制方法如实施例4；

3、将步骤(1)和(2)中的溶液按体积比为1:1均匀混合，即可制备得到A5C5水凝胶。

实施例9、本发明原位水凝胶的制备

1、称取冻干后的ADA-Mal溶于PBS缓冲液中，制备质量百分含量为6％的ADA-Mal溶液；

2、称取冻干后的CMCS-SH溶于浓度为0.01M的硼砂水溶液中，制备质量百分含量为4％的CMCS-SH溶液；浓度为0.01M的硼砂水溶液的配制方法如实施例4；

3、将步骤(1)和(2)中的溶液按体积比为1:1均匀混合，即可制备得到A6C4水凝胶。

以下通过具体实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、ADA-Mal和CMCS-SH结构表征

1、实验方法

ADA-Mal/CMCS-SH的FTIR检测：利用溴化钾压片法检测材料红外吸收光谱，具体操作如下：分别称取5～10mg SA、ADA、ADA-Mal、CMCS及CMCS-SH 5种冻干样品，将材料剪成细小碎片状，并加入50～60mg的KBr粉末混合研磨均匀，然后将研磨好的混合粉末经压片机，在10kPa的压力下压成薄片，取出，进行红外光谱测试。测试的具体条件设定为：ATR检测模式下，检测波谱范围是400-4000cm^-1，光谱分辨率4cm^-1/次，扫描频率是0.0625Hz。

ADA-Mal/CMCS-SH的¹HNMR检测：¹HNMR样品制备及检测如下：分别称取5mg SA、ADA、ADA-Mal、CMCS及CMCS-SH 5种冻干样品，装入核磁管中，每管加入0.55mL氘代水(D₂O)，振荡使材料充分溶解。用核磁共振仪(400MHz,Bruker AV II-400,Switzerland)测定样品化学位移在0-12ppm区间的吸收波谱，设多糖主链中¹H峰积分面积为参比峰，根据测得的得到-Mal及-SH波谱图中¹H峰面积与参比峰面积之比计算其马来酰亚胺及硫醇基团的接枝度(DS)。

2、实验结果

氧化后的海藻酸钠中FTIR图中在1734cm^-1伸缩振动吸收峰，表明有醛基生成，生成氧化海藻酸钠(ADA)；经马来酰亚胺盐酸盐改性后的ADA的FTIR图谱中在1657cm^-1和1542cm^-1振动峰为酰胺键I和酰胺II(图2)。¹HNMR谱δ＝2.88ppm，δ＝2.95ppm两个峰分别为马来酰亚胺基(-CH₂CH₂-)引入的亚甲基质子峰；δ＝6.88ppm处为引入-Mal官能团中-C＝C-的质子峰(图3)。ADA-Mal中马来酰亚胺基取代度(DS)通过马来酰亚胺基中的碳碳双键(-C＝C-)(δ＝6.88ppm)中氢原子对应的峰面积和ADA中主链(δ＝3.2～4.0ppm)上的氢原子对应的峰面积的比值计算取代度(DS)，DS约为27.29％。FTIR和¹HNMR结果表明本发明成功制得ADA-Mal。

在CMCS及CMCS-SH的FTIR光谱中可以看出，CMCS-SH中在1657和1542cm^-1处出现吸收峰，为酰胺I(-C＝O)伸缩振动峰和酰胺II(-C-N)弯曲振动峰，表明半胱胺巯基中的氨基(-NH₂)与CMCS上的羧基(-COO-)发生了反应，形成了酰胺键(图2)。从CMCS氢谱图中可见，δ＝2.02ppm为CMCS中的乙酰基中的甲基质子峰(-CO-CH₃)。与CMCS相比，CMCS-SH氢谱中出现的δ＝2.86ppm和δ＝2.91ppm归属于半胱胺巯基的亚甲基质子峰(-CH₂CH₂SH)，其中δ＝2.91ppm处的峰归属于与酰胺键邻近的亚甲基氢(图3)。根据双键δ＝2.91ppm和(δ＝2.86-2.91ppm位置处氢原子对应的峰面积和亚甲基峰(δ＝2.56ppm)处氢原子对应的峰面积，计算巯基的取代度(DS)，DS约为48.2％。FTIR和¹HNMR结果表明本发明成功制得CMCS-SH。

实验例2、本发明止血粉的表征

本发明止血粉的制备流程如图4a所示。采用动态光散射法测量实施例1制备的ADA-Mal与CMCS-SH粉末的粒径大小与分布，介质选用乙醇。止血粉的快速凝胶化用倒置试管法表征。在5mL离心管中加入1mL的PBS或者兔抗凝全血，加入30mg的止血粉后，立即倒置离心管，观察并记录PBS/血液的流动情况。以商用的云南白药止血粉(CP)以及未改性海藻酸钠-羧甲基壳聚糖混合粉末(SA-CMCS)做为对照。

未改性海藻酸钠-羧甲基壳聚糖混合粉末(SA-CMCS)的制备方法为：称取SA与CMCS粉末，按照质量比7:3混合均匀，即得SA-CMCS混合粉末，装入瓶中备用。

2、实验结果

由图4a示意图可知经过简单的改性、冻干、研磨、混合即可得到止血粉。

通过动态光散射法测量了实施例1制备的ADA-Mal(AM)粉末和CMCS-SH(CS)粉末的粒径，结果表明二者的粒径均一性良好，主要处于微米级别，AM粉末和CS粉末的d(0.5)分别为14.052μm和7.389μm(如图4b和4c所示)。从粉末的大体图(图4d)中可以看出，研磨后的粉末质地均一，无明显团聚现象，利于长期的保存。图4e左边照片的两个PE试管中均为抗凝兔全血，其倒置后血液流动到底部；在两个PE试管中的其中一个加入实施例1制备的止血粉(AM7-CS3粉末)，另一个不加入任何样品，再将PE试管倒置，结果如图4e右边照片所示，加入AM7-CS3粉末后，混合粉末接触血液立即自凝胶化，表现出快速凝血的性能，而不加入任何样品的抗凝兔全血在静置相同时间后仍然呈流动状。说明AM7-CS3粉末能够促进血液快速凝固。

分别检测实施例1～3制备得到的三组止血粉AM7-CS3、AM3-CS7、AM5-CS5的流变学性能，将30mg三组止血粉分别加入100μL PBS中，待止血粉自凝胶化稳定后，取各组凝胶块进行流变学测试。结果如图5所示：三组止血粉均表现出储能模量(G’)大于损耗模量(G”)的特点，水凝胶变现我弹性固体。此外，AM7-CS3的G’大于另外两组。说明其具有更致密，力学强度更大的交联网络，能更好的抵抗创面和/或血管出血时的血压，在创面封闭、止血中最具应用价值。故优选AM7-CS3止血粉进行后续实验。

对实施例1制备的AM7-CS3止血粉进行快速凝胶化测试，以CP和SA-CMCS作为对照，结果如图6所示：为进一步评估止血粉的快速自凝胶化，首先将粉末加入到PBS中。可以清晰地观察到，AM7-CS3止血粉在接触到液体后5s内，即可吸水快速自凝胶化，在液面形成一层凝胶层，封闭液面。止血粉自凝胶化后将试管倒置，凝胶层可抵抗液体重力，阻止液体的下流。而未改性的海藻酸钠和羧甲基壳聚糖混合粉末(SA-CMCS)在PBS中无法自凝胶化而形成稳定凝胶。进一步实验证明，即使在成分复杂的血液中，AM7-CS3止血粉依然可以在与血液接触后快速自凝胶化，阻止血液流动。而商用的云南白药止血粉(CP)缺乏自凝胶化的特性，无法形成凝胶层封闭创面，不能阻止血液流动。SA-CMCS的混合粉末同样无法实现自凝胶化而发挥止血作用。总之，相较于传统的止血粉，AM7-CS3止血粉具有独特的自凝胶机制，即基于“点击”化学原理的迈克尔加成反应和席夫碱反应，因此可在极短的时间内(≤5s)自凝胶化和一定的抗压能力，使得AM7-CS3止血粉具备快速封闭创面和止血的优势。

实验例3、本发明止血粉体外促凝活性的评价

1、实验方法

实施例1制备的止血粉(AM7-CS3)的体外促凝血活性通过血细胞的粘附、血浆纤维蛋白原(FIB)浓度和乳酸脱氢酶(LDH)浓度来评价。将新鲜兔血与3.8％柠檬酸钠(1:9,v/v)混合制备兔抗凝全血。兔抗凝全血离心(1000rpm，10min)收集红细胞沉淀，用PBS洗涤3次(1000rpm，10min)。将抗凝全血以1000rpm/min离心10min制备富血小板血浆(PRP)，3000rpm/min离心15min制备贫血小板血浆(PPP)

将制备好的红细胞悬液(50％v/v，200μL)和PRP(200μL)分别在30～50mg AM7-CS3止血粉自凝胶化形成的凝胶块表面孵育10min和60min，观察粘附的红细胞和血小板。PBS轻轻冲洗后，用4％多聚甲醛固定过夜，梯度脱水。用扫描电镜观察样品表面经临界点干燥和喷金处理后的红细胞和血小板形态。

用上述方法制备PPP，将200μL PPP与30～50mg AM7-CS3止血粉自凝胶化形成的凝胶在37℃孵育30min后，取上清用全自动凝血分析仪检测血浆中的FIB。用LDH检测试剂盒检测样本表面粘附血小板的数量。首先，将PRP梯度稀释后，按照制造商的说明，用LDH测定试剂盒测定450nm处的吸光度，建立标准曲线。材料置于24孔板中，加入200μL PRP。孵育30min后，吸去上清，用PBS洗去材料表面游离的血小板。用1％ Triton X-100(1mL)溶解材料表面的血小板，按照制造商的说明用LDH检测试剂盒进行检测。最终，通过标曲确定AM7-CS3止血粉自凝胶化后的凝胶块表面的粘附血小板数量(n＝3)。

2、实验结果

红细胞在凝血中具有重要地位，在血小板激活和增加纤维蛋白凝块稳定性等方面具有重要意义。因此，红细胞在材料上的粘附性首先被评估。选择临床常用的纱布和纤维蛋白胶作为对照。从图7a中可以看出，相较于纤维蛋白胶和纱布，大量红细胞粘附在AM7-CS3止血粉自凝胶化的凝胶块表面，且红细胞发生了聚集。此外，在红细胞表面明显地形成了纤维蛋白网络。

进一步地，血小板是一期止血的核心，也是是二期止血中重要的参与者，在整个凝血过程中具有举足轻重的地位，所以材料对于血小板的影响显著影响着止血效果。从图7b中可以看出，纱布上的仅附着有少量的血小板，且散在分布，无明显聚集。而纤维蛋白胶具有促凝活性，表现出促血小板粘附与激活能力，血小板相互连接成网。在AM7-CS3止血粉上，可以观察到明显的纤维网络，这说明材料可以显著地激活凝血过程，促进纤维蛋白的形成。血小板并未明显被观察到是因为其作为纤维蛋白网络重要的组成物参与到了蛋白网络中。

此外，通过LDH检测定量地检测了血小板在材料上粘附的数量(图7c)。AM7-CS3止血粉和纤维蛋白胶粘附的血小板数量分别为7.42×10⁷个和6.08×10⁷个，分别是纱布的3.1和2.5倍，但二者无统计学差异。进一步检测了经过不同材料处理血浆中FIB的含量，图7d显示，AM7-CS3止血粉处理过的血浆中FIB浓度仅为2.29g/L，显著低于其他两组，表明止血粉能显著地吸附并激活血浆中的纤维蛋白原。这种现象在纤维蛋白胶中并未观察到。

分析认为，AM7-CS3止血粉对于红细胞和血小板的捕获能力归因于CMCS带正电的氨基可以显著促进带负电的红细胞粘附和聚集。此外，SA可以激活内源性凝血途径。止血粉对于纤维蛋白原吸附及活化的原因可能是多方面的，包括SA对于内源凝血途径的激活，巯基促进组织因子和血小板的激活，醛基通过席夫碱反应促进纤维蛋白原等蛋白的粘附。血小板的激活会加速二期止血过程，纤维蛋白原的粘附又促进了血小板的聚集。总之，AM7-CS3止血粉具有促进血细胞激活聚集和纤维蛋白原吸附活化的促凝能力，且二者相辅相成，相互促进。

实验例4、止血粉在大鼠肝脏截断出血模型中的应用

1、实验方法

采用大鼠肝脏截断出血模型评价实施例1止血粉(AM7-CS3)的止血性能，云南白药止血粉(CP)作为对照，同时设置造模后不进行止血处理的空白对照组(Blank)。SD大鼠麻醉后呈仰卧位，备皮，在剑突下1cm处开约3cm的切口，将肝脏拉出放在事先称重的滤纸上，用纱布小心吸去肝脏表面的渗液，在距离末端1cm处截断肝叶，待血液从创面处流出，立即将备好的止血粉敷在创面，并轻轻按压，直到创面完全止血。取出滤纸并再次称量滤纸的重量，前后两次滤纸重量差记作出血量(Blood Loss)。滤纸上血液所占的面积不在扩大的时间被认为是止血时间(Bleeding Time)。用电子设备记录全部止血的全过程(n＝3)。

2、实验结果

如图8a所示：肝脏截断后，血液迅速流出。用云南白药止血粉(CP)和AM7-CS3止血粉处理的创面可以明显地阻止血液的流失。从图8b的出血量统计可以看出空白对照组的平均出血量为1.06g，而CP和AM7-CS3止血粉出血量为0.51g和0.31g，仅为对照组的48％和29％。止血时间也由未经处理的120s显著性缩短到75s(CP组)和72s(AM7-CS3止血粉组)(图8c)。以上结果说明了AM7-CS3止血粉止血效果好，在大鼠肝脏截断出血模型的止血效果与云南白药止血粉相比无显著差异。大鼠肝脏出血量低，出血速度慢，进一步比较CP和AM7-CS3止血粉在较大出血模型中止血效果。

实验例5、本发明止血粉在比格犬肝脏穿孔出血模型中的应用

1、实验方法

采用比格犬肝脏穿孔出血模型评价止血粉在大型动物肝脏出血模型中的应用效果。比格犬麻醉后呈仰卧位，备皮，将肝脏拉出放在滤纸上，用纱布小心吸去肝脏表面的渗液，在肝叶上用活检器制造一个直径15mm，深10mm的不可压缩性深出血创面，分别将云南白药止血粉(CP)和实施例1制备的止血粉(AM7-CS3)覆盖在创面上进行紧急止血处理，止血过程示意图如图9a所示。数据采集方式同试验例4(n＝3)。设置造模后不进行止血处理的空白对照组(Blank)。同时，止血2周后对创面进行HE染色。

2、实验结果

从出血量统计(图9b)可以看出：空白对照组的平均出血量为3.70g，CP组出血量2.95g，无显著统计学差异，这表明在比格犬肝脏穿孔出血模型中，CP并无明显的止血效果。而AM7-CS3止血粉的出血量为1.89g，相较于空白对照组出血量减少了49％，具有显著地止血效果。

从图9c可以看出，空白组的肝脏出血严重，血流速度快，出血量大。用CP进行止血时，由于缺乏自凝胶化性能，CP被血流明显地冲散，无法汇聚在出血部位，导致止血效果差。而AM7-CS3止血粉很好地粘附在创面上，封闭创面，快速止血，因此相比于CP表现出更好的止血效果。

从止血2周后肝脏的组织切片(HE染色)可以明显地看出AM7-CS3止血粉喷洒在创面后在创面表面形成一层凝胶成，凝胶层与组织之间只有少量的血细胞；而空白对照组和CP组创面中充满血细胞，尤其空白对照中，血细胞含量最多；组织染色结果进一步证实了AM7-CS3止血粉快速快速凝胶化能力以及创面封闭能力，特别是对于较大出血的止血效果优异。

实验例6、ADA-Mal和CMCS-SH溶液粘度检测

1、实验方法

对不同质量百分含量的ADA-Mal和CMCS-SH溶液的粘度进行检测，其中：ADA-Mal简写为AMx，x＝3,4,5,6,7,8，分别表示ADA-Mal的质量百分含量为3％、4％、5％、6％、7％、8％；CMCS-SH简写为CSy，y＝3,4,5,6,7，分别表示CMCS-SH的质量百分含量为3％、4％、5％、6％、7％。具体操作如下：分别配制不同质量百分比(w/v％)的AMx溶液和CSy溶液，以临床ESD常用的黏膜注射液甘油果糖注射液(GFI)作为对照。使用旋转流变仪(MCR302)，50mm的平板转子(PP50)作为测试部件，仪器测试参数设置为：测量的上下平板间隙设为0.25mm，平台温度设置为37℃。初试剪切速率初始值设置为0.1rad/s，终值为100rad/s，在旋转模式下分别检测GFI、AM3、AM4、AM5、AM6、AM7、AM8，及CS3、CS4、CS5、CS6、CS7共12种液体的黏度曲线。

2、实验结果

对AMx、CSy两种改性溶液粘度曲线如图10A和图10B。图10A为GFI和不同浓度AMx溶液的粘度测试曲线；图10B为不同浓度CSy溶液的粘度测试曲线，图10A和10B反应的是各不同浓度溶液的粘度随剪切速率变化的趋势。图10A和10B与纵标相交的是横坐标为0.1s时的粘度值。而检测得到GFI、AM3、AM4、AM5、AM6、AM7、AM8的各组溶液的静态粘度值分别约为13.409、3783.7、21663、52487、69562、88476、168940mPs；CS3、CS4、CS5、CS6、CS7各组溶液静态粘度值分别约为136、137.07、148.44、148.28、184.96mPs。两种溶液粘度随着流变仪转子剪切速率增大，粘度降低，表现出剪切稀化特性，为典型的非牛顿流体。可见ADA-Mal溶液与CMCS-SH溶液均具有可注射性。

从两种溶液的静态粘度检测结果可以发现，AMx溶液粘度远高于CSy溶液及GFI溶液粘度，溶液粘性对于维持衬垫高度至关重要，因此为实现持久的黏膜下衬垫效果，优选AMx溶液作为黏膜下注射液。从AMx静态粘度曲线可以看出，随着AM溶液质量百分含量增大，溶液静态粘度增大，且当x＝8时，粘度突增，可能原因是由于随着AM百分含量增大，溶液粘度增大，高粘度阻止水分子进入材料内部与未溶解的AM中的糖链结合，导致溶质中糖链不能充分展开，以卷曲的形式存在于溶液中，进一步增大了溶液体系的粘度。在行内镜黏膜下注射时，会因粘度过大而堵塞针管，影响手术质量，因此在选择作为黏膜下注射液的AMx浓度时，不考虑x＝8组的AM溶液。

实验例7、ADA-Mal溶液的皮下衬垫效果的超声检测结果

1、实验方法

如实验例6所述，制备AM3、AM4、AM5、AM6、AM7五种不同浓度AM溶液。水合氯醛麻醉SD大鼠(300g/mL)，背部备皮，暴露背部两侧皮肤，并标记注射点。用1mL注射器吸取100μL上述各浓度AM溶液，将注射器与背部呈小角度将AM溶液从标记点注入到大鼠皮下，观察到隆起后立即进行超声检测，以该检测点检测高度作为初始高度，以该检测点时间作为初始时间(T₀＝0min)。生理盐水和GFI作为对照组，每组注射液设置三个平行注射点(n＝3)。分别在0min、15min、30min三个时间点检测各组溶液在皮下的垫起高度，记录、统计各组AM溶液在皮下垫起高度随时间的变化情况。

2、实验结果

图11为将生理盐水(NS)、甘油果糖注射液(GFI)和质量百分含量分别为3％、4％、5％、6％、7％的AM溶液注入大鼠皮下后超声检测到的溶液在大鼠皮下垫起高度随时间变化的形态图。从图中可以清楚的看到，在注射相同体积的注射液的前提下，随着AM百分含量增大，检测到的初始(T₀＝0min)垫起高度增大，且当浓度大于4％时(垫起高度为0.48±0.08cm)，AM溶液在皮下垫起高度已显著高于NS和GFI组(分别为0.32±0.05cm，0.34±0.05cm)(图11B)。在注射30min后，AM6和AM7两组依然保持明显的垫起高度，分别为0.36±0.03cm、0.42±0.06cm，均高于NS和GFI初始检测高度。通过超声检测AM溶液的皮下衬垫效果表明，相对于临床常用的NS和GFI，一定浓度的AM溶液在大鼠皮下能维持较好的衬垫高度和衬垫时间，且衬垫效果随浓度可调。超声检测AM溶液在大鼠皮下衬垫效果评价结果表明，AM溶液可作为ESD黏膜下注射潜在替代产品。从AMx溶液的大鼠皮下衬垫效果来看，浓度越高，初始衬垫高度越高，相同时间内皮下维持高度越高，因此，为了维持稳定的黏膜下衬垫效果，拟选用AM7溶液作为食管黏膜下注射材料。

实验例8、AxCy水凝胶力学性能检测

1、实验方法

用电子万能材料试验机(Instron5967)测试实施例4～9制备的A3C7、A4C6、A5C5、A6C4、A7C3、A7C7，6组水凝的压缩强度和杨氏模量。具体操作如下：将水凝胶制备成直径0.8cm，高1.0cm的两头平整的圆柱状，将水凝胶柱竖立放置在测试机压头的中心位置。试验机压头连接有量程为30kN的传感器，试验机参数设置为，运行速度5mm/min，压缩应变设置为测试物体长度的80％。运行试验机，记录水凝胶应力-应变曲线(n＝5)，并记录凝胶压缩应力的最大值，及最大值对应的最大压缩应变。压缩模量取测试物体应变发生在15％～25％压缩阶段的斜率(n＝5)。

水凝胶的杨氏模量可通过下面公式计算：

式中Δδ为水凝胶的杨氏模量；ΔF为应力，其物理意义是单位截面积所受到的力；ΔL应变，其物理意义是单位长度所对应的伸长量；F为水凝胶承受的压力；S为水凝胶的横截面积；L水凝胶的高度；ΔL'水凝胶的压缩高度，r水凝胶圆柱体的半径。

2、实验结果

图12为六组水凝胶的压缩应力与应变的关系曲线。从图中可以看出水凝胶在最大压缩应力时坍塌，此时对应的压缩距离为应变，不同水凝胶的压缩应力及对应的应变各不相同，A7C7水凝胶发生坍塌的应变最小，A3C7水凝胶发生坍塌的应变最大。从压缩应力大小来看，A5C5组水凝胶所能承受的最大应力为50.30±5.54kPa，A7C3组能承受的最大应力为76.82±4.93kPa，两组能承受的最大应力之间差异显著(P<0.01)；A7C7组水凝胶能承受的最大压缩应力为54.57±4.72kPa，显著小于A7C3组(P<0.05)。六组水凝胶中A7C7组水凝胶压缩模量最大，其次是A7C3组，最小的是A3C7组。其中A4C6、A5C5、A6C4三组压缩模量差异不显著(P＞0.05)。从力学结果来看，A7C3水凝胶有较大的压缩强度和杨氏模量，同时A7C3水凝胶成胶时间较短。

实验例9、AxCy水凝胶溶胀与降解性能评价

1、实验方法

(1)水凝胶溶胀：实施例4～9制备的六组柱状水凝胶，每组分别取一定量的水凝胶，滤纸吸干表面的水分，称重(W₀)；将每组称重后的柱状水凝胶浸入10mL PBS缓冲液中，并置于37℃，60rpm恒温摇床中。一定时间后取出水凝胶，用滤纸吸干表面水分后称重(Wt)。重复上述过程直至各组水凝胶重量保持不变为止。每组水凝胶设置3个平行(n＝3)。水凝胶溶胀率计算公式：

溶胀率(％)＝(Wf-Wo)/Wo×100％

式中：Wt为t时刻水凝胶块溶胀后的质量，W₀为水凝胶块初始的质量。

(2)水凝胶降解：取实施例4～9制备的水凝胶，冻干，得冻干水凝胶，称重(W₀)，并分别置于10mL PBS缓冲液中，放置于37℃，60rpm恒温摇床中，一定时间后取出，去离子水冲洗掉表面，经冷冻干燥后称重(Wt)，每组水凝胶设置3个平行(n＝3)。计算残留质量百分比。水凝胶的降解性能表示方法可以用公式计算：

残留质量百分比(％)＝Wt/Wo×100％

式中：Wt，W₀分别为t时刻和初始水凝胶冻干支架的重量。

2、实验结果

对六组水凝胶的溶胀及降解性能检的测结果如图13A和13B所示。图13A为水凝胶的溶胀曲线，从溶胀曲线可以看出六组不同水凝胶在PBS缓冲液中在30h左右几乎趋于溶胀平衡。其中A7C3和A3C7组溶胀率分别达到101.9±14.63％和94.34±10.75％；A7C7组最小为55.77±6.39％；A4C6、A5C5、A6C4组水凝胶溶胀率接近，分别为85.38±6.94％、81.28±9.06％、82.87±4.10％。30h后，在水分子和离子作用下，水凝胶开始降解，其中A3C7组降解最明显。

六组冻干水凝胶在PBS缓冲液中的降解如图13B所示，从图中可以看出，水凝胶在降解前3天时，降解曲线斜率最大，降解速率最大；随后降解速率减缓，并趋于平衡。其中，A3C7组水凝胶降解最快，其次是A4C6、A5C5、A6C4和A7C7，A7C3组降解最慢。

A7C3组水凝胶相比于其他组水凝胶具更大的溶胀率，溶胀率为100％左右。A7C3水凝胶中含有丰富的亲水性基团(如-CHO、-CONH、-C＝C-等)增加了水凝胶的亲水性，导致水凝胶的平衡溶胀率增大(图13A)。此外，A7C3水凝胶内亲水基团能与水通过氢键发生水合作用，形成大的分子网络，可减缓A7C3水凝胶的降解速率(图13B)。因此，A7C3组水凝胶相对于其他组水凝胶有更大的溶胀率和更小的降解速率。

从各组水凝胶力学性能，溶胀及降解性能等各物理性能综合来看，A7C3水凝胶都具有更优的性能；因此，后续实验拟选用A7C3组水凝胶进行进一步研究。

实验例10、AxCy水凝胶成胶时间

1、实验方法

成胶时间检测操作如下：吸取500μL AMx(x＝3,4,5,6,7)溶液，加入到5mL EP管中，加入磁力搅拌子(C型，0.5cm，橄榄型)，置于磁力搅拌器上，120rpm；待搅拌子转速稳定后，吸取500μL CSy(y＝3,4,5,6,7)溶液加入到EP管中，同时秒表计时。每3s倒置EP管，同时停止计时，当观察到混合液在EP底部稳定成胶，并且不会从EP管底部滑落时，记录时间；若有凝胶不能在底部稳定停留，倒置时往下滑落，则继续磁力搅拌反应，直至倒置EP管凝胶不会滑落，记录最终成胶时间。每组重复5次(n＝5)，统计每组凝胶最终成胶时间。水凝胶组合以AxCy表示，A代表ADA-Mal，B表示CMCS-SH，x和y分别表示ADA-Mal和CMCS-SH的质量百分含量。同时，以7wt％氧化海藻酸钠的(ADA)分别与3wt％的CMCS-SHCS(巯基羧甲基壳聚糖)和3wt％的CMCS(羧甲基壳聚糖)，混合制备ADA-CS及ADA-CMCS水凝胶，记录两组水凝胶的成胶时间。

2、实验结果

图14为A3C7、A4C6、A5C5、A6C4、A7C3、A7C7六组凝胶通过搅拌-倒置法测得的各组凝胶的成胶时间统计结果。从图中可以看出，本研究制备的凝胶成胶时间短，3～10s内即可成胶。六组凝胶中，成胶时间最长的是A3C7组，平均8.3±1.5s成胶；A7C7组成胶时间最快，平均3.7±0.56s成胶。而ADA-CS及ADA-CMCS水凝胶两组水凝胶稳定成胶时间均大于30min，不符合缩短手术操作时间的要求。

实验例11、A7C3水凝胶组织粘附性能

1、实验方法

取真皮层厚约0.3cm的新鲜猪皮，剥离掉皮下脂肪层，并清洗掉表皮层的油脂。将猪皮裁剪为5cm×3cm大小的条状。吸取100μL AM7溶液(事先滴加少量红色组织标记液，经实验证明该红色组织标记液不会影响成胶)滴加在猪皮中心位置，再吸取100μL CS3溶液，均匀滴加在AM7溶液上，并用枪头轻轻搅拌、混匀，室温静置30min，让凝胶成胶稳定。待凝胶稳定后，用镊子夹取猪皮两端，依次反复进行拉伸、弯曲、挤压、扭曲，观察凝胶与猪皮粘附情况。

取去油脂新鲜猪皮，裁剪为10cm×6cm大小片状，并在猪皮表皮层雕刻一个深约0.1～0.15cm深的“☆”，吸取60μL AM7溶液加入到“☆”凹槽中，使AM7溶液填满凹槽。吸取60μL CS3溶液滴加入凹槽中，用枪尖轻轻搅拌使两种溶液充分混匀，并铺满整个凹槽。室温静置30min，让水凝胶成胶稳定。待成胶稳定后用洗瓶往凝胶周边冲水，观察凝胶是否脱落。

2、实验结果

图15A为在猪皮表面原位成胶后对猪皮进行反复拉伸、弯曲、挤压、扭曲，以模拟凝胶用于体表皮肤、体内软组织(如消化道)蠕动情况下凝胶是否依然能牢固粘附。从图15A中可以看出，经反复作用后水凝胶依然能与猪皮牢固粘附。图15B为将在猪皮上不规则伤口表面进行的原位成胶，评价凝胶在不规则伤口上的粘附情况。原位成胶并稳定后，用流水冲洗不规则伤口边缘，可见凝胶依然牢固粘附，未出现脱落情况。上述结果说明本发明制备的水凝胶粘附性能良好。

实验例12、A7C3水凝胶顶破强度

1、实验方法

装置有一个三通阀连接，三通阀的一段连接有50mL注射器，一段连接有电子压力阀(16kPa，MD-S280)，另一端连接一个圆柱形储水小槽小槽下端连接进水管，上端开口，小槽上均匀分布有四个螺丝孔，用于储水和固定猪皮(图16A、16B)。将去油脂的新鲜猪皮裁剪成直径约为5cm圆片状，并通过螺丝固定在装置的上方，以密封直径为3cm的储水槽。在猪皮的中心处有一个直径为0.2cm×0.1cm的孔。吸取100μL AM7溶液滴加在猪皮中心孔的周围，同时滴加100μL CS3溶液，并用枪尖轻轻将两种溶液混合，室温静置30min，让凝胶稳定成胶。待水凝胶稳定成胶后，将压力表数值调零，待压力表稳定时，缓慢推动注射器，水通过三通阀同时流向压力表和水槽，持续缓慢推动注射器，同时观察压力表头的读数，记录凝胶顶破时压力表读数。相同方法重复测试3次(n＝3)。以商品化猪源纤维蛋白胶作为对照(n＝3)，压力表读数即为凝胶的顶破强度(单位：kPa)。

2、实验结果

对水凝胶进行了顶破强度检测以模拟伤口中出血情况对封闭剂的破坏，以商品化猪源纤维蛋白胶作为对照。图16A为设计的顶破强度检测装置；图16B为顶破强度检测装置工作原理图；图16C中分别为纤维蛋白胶(Fibrin Glue，图中为Fib Gel)和A7C3组水凝胶的顶破强度，大小分别为10.16±0.78kPa、9.51±1.20kPa，两组凝胶顶破强度对比，差异不显著(P＞0.05)。该实验结果说明A7C3水凝胶与商用纤维蛋白胶具有相似的组织粘附能力，证明水凝胶在ESD术后能够对创面起封闭作用，进而起到预防ESD术后创面感染或溃疡形成的作用。

实验例13、A7C3水凝胶封闭止血性能

1、实验方法

构建肝出血模型：取15只新西兰雄兔，随机分为三组，每组五只(n＝5)：空白对照组(Blank)、纤维蛋白胶组(Fibrin glue)、A7C3水凝胶组。用3％戊巴比妥钠从耳缘静脉注射麻醉(3mL/kg)，仰卧固定于手术台上，腹部备皮，消毒后逐层打开腹腔，以纱布吸干腹腔、腹壁上的组织液和血液，充分暴露右肝叶，并将肝叶托出腹腔，用纱布吸干肝叶表面组织液及血液，并在肝叶下方垫两层无菌滤纸(直径10cm)。用手术刀在右肝叶同一部位切开长1cm，深0.5cm的“1”字型切口，建立出血模型；

肝脏止血：空白组不处理，直至自然止血；纤维蛋白胶组在出血点滴加猪纤维蛋白胶封住出血位点；实验组首先在出血口滴加AM7溶液，然后在AM7溶液上滴加CS3溶液，原位成胶。空白组在损伤后记录出血时间；纤维蛋白胶组及实验组在干预后记录出血时间；滤纸吸取流出的血液，直到血液停止流出。称量吸血后滤纸的总质量，计算出血量。

2、实验结果

图17A为兔肝出血模型，从图中可以看出肝脏造模后出血明显。将A7C3水凝胶在伤口处原位成胶，水凝胶覆盖在出血口处能起到物理屏障的作用，可防止血液继续渗出。以未处理组和市售纤维蛋白胶作为对照。从图17A中可以看出，未处理组的滤纸上出现较大的血迹面积，失血量为0.945±0.161g(图17B)。在纤维蛋白胶组的滤纸上血迹面积较小，出血量为0.603±0.040g。A7C3水凝胶组血迹面积略大于纤维蛋白胶组，出血量为0.658±0.075g。A7C3水凝胶组出血量小于未处理组(P＜0.05)；略大于纤维蛋白胶组，但无明显统计学差异(P＞0.05)。说明本发明水凝胶具有良好的组织粘附力。从止血过程的直观图可以看出，在出血口使用纤维蛋白胶和水凝胶治疗后，能在伤口表面形成一层水凝胶膜，对伤口封闭起作用，可以阻止伤口渗血。兔肝脏体外止血实验表明A7C3原位水凝胶具有良好的伤口封闭和止血性能。

实验例14、犬食管ESD及术后护理与检查

1、实验方法

(1)术前准备：选取健康成年Beagle犬，术前禁食、禁水6h；

(2)实验分组：实验分为四组：①以AM7作为黏膜下注射液，术后创面加CS3溶液封闭(A7C3 Gel组)；②以AM7作为黏膜下注射液，术后创面不干预(AM7组)；③以甘油果糖注射液(GFI)作为黏膜下注射液，术后创面加CS3溶液封闭(GFI+CS3组)；④以GFI作为黏膜下注射液，术后创面不干预(GFI组)；

(2)麻醉、固定：3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1mL/kg)，待犬完全麻醉后，肌肉注射1mL速眠新。将犬仰卧位固定在手术台上，后颈垫高，调整头部位置使口腔、咽喉及气管处于同一纵轴方向；

(3)气管插管：手持喉镜，沿舌背弯度徐徐插入，至舌根部轻轻挑起会厌软骨，露出声门。待吸气声门开放，将气管导管迅速插入气管内。拔出管芯，放置牙垫，退出喉镜，并将气管插管和牙垫固定；

(4)黏膜下注射：使用可视内镜系统(4.0-mm，VLS2-01)经口沿会厌、梨状窝进入食管，在内镜引导下用吸引器，吸掉口腔、食管中残留的多余分泌液。用活检钳夹取外径约为1.5cm的灭菌橡皮圈送入食管，并分别放置在距离食管入口1.5cm、4cm位置处(模拟病灶定位)，使用电凝刀在橡皮圈周围组织进行标记，构建一个直径约为1.5cm大小的模拟病灶区，如图18中“标记”过程。使用一次性内镜用注射针(1650mm，23G)在标记黏膜下注射400～500μL AM7溶液，内镜下可见明显隆起。对照组注射GFI；

(5)环切、剥离：使用电凝钩沿着隆起部位基底的标记点进行切割，并剥离掉隆起部位的黏膜上层，构建一个直径约为1.5cm的缺损区。对黏膜下肿瘤的切除，需要使用生理盐水将渗出的血液和残留的黏膜表注射液冲洗掉，以获得清洗的视野；

(6)封闭：将一次性内镜用注射针，更换为一次性使用内窥镜给药管(1200mm，)，并将CS3溶液喷洒在伤口上，CS3溶液与伤口中残留或黏膜下肿瘤切除后补充的AM7溶液接触后成胶，并对伤口起封闭作用；

(7)插胃管：术后，在内镜辅助下，经鼻置入胃管。

犬食道ESD操作流程如图18。

术后前三天，鼻饲饮食，三天后拔出胃管正常喂食。术后观察指标：a.一般情况观察：观察犬进食、体重变化等情况；b.食管内镜检查：分别于术后第3、9、14、21、28天，麻醉后(舒泰，肌肉注射，0.1mg/kg)行食管内镜检查，观察食管局部缺损区域黏膜炎症、肉芽生长、闭合情况。

2、实验结果

(1)衬垫效果：以AM溶液作为犬食管ESD的黏膜下衬垫材料，评价其在黏膜下的衬垫效果。图19A为犬食管ESD术的内镜系统以及手术过程的实操图。图19B为犬食道ESD的标记与黏膜下注射过程，分为病灶(模拟)定位、病灶标记，黏膜下注射。图中橡皮圈的位置为模拟病灶区。定位后使用电凝刀对病灶周围进行标定。在标定区域黏膜下层注射AM7溶液，将正常或病变(如息肉)的黏膜层与黏膜下肌层隔离，便于电刀剥离黏膜层(切除息肉或暴露黏膜下肿瘤)。图19C为AM7溶液和GFI在食管黏膜下衬垫效果评价。从图中可以看出，GFI注射后在黏膜下呈宽基峰状隆起，而AM7溶液注射后呈尖峰状隆起。15min后，GFI组峰面趋于平坦，并伴有黏膜褶皱出现；而AM7组隆起形态基本没有变化；30min后，GFI组隆起峰面基本消失，隆起部位黏膜出现明显的褶皱，说明GFI在黏膜下30min内不能很好的维持衬垫作用；而AM7组30min后隆起高度与注射初始高度没有明显差异。食管黏膜下注射效果评价结果说明，AM7溶液作为黏膜下注射液具有维持较高的衬垫高度，衬垫时间长，不易流失的特点。

(2)A7C3水凝胶术后封闭效果：图20为本发明开发的用于黏膜下衬垫和术后伤口封闭的“双功能”原位水凝胶的使用过程的操作图。图20A为AM7溶液在内镜辅助下的黏膜下注射过程，图中白色“△”指示为内镜针退针后回流的AM7溶液。图20B为黏膜剥离后的大体图，图中白色“△”所示为剥离后暴露出的AM7残留液。图20C为针对黏膜下肿瘤的术后处理，用生理盐水冲洗掉术后伤口残留的血液和黏膜下注射液，有利于提供清晰的黏膜下视野，便于肿瘤的定位。图20D为黏膜剥离后或肿瘤切除后伤口处回填AM7溶液，同时在创面喷洒CS3溶液。图20E为喷洒CS3溶液后，AM7和CS3溶液在创面接触后成胶形态(0min)。图20F为原位水凝胶成胶10min后的形态，从图中可以看出，水凝胶与伤口的不规则形态完全匹配，很好的将黏膜下肌层与外界环境隔离。

(3)A7C3水凝胶对ESD术后修复效果：

分别用GFI和AM7溶液进行食管黏膜下注射，并对术后伤口进行不同方式的处理(如图21A所示)，观察术后28天各组创面黏膜炎症、肉芽生长、闭合情况情况，如图21B所示。从愈合过程图(图21B)中可以看出，GFI组、GFI+CS3组和AM7组术后创面未封闭，术后3天创面有明显的红肿和炎症，肉芽组织未完全填充伤口；在术后9～28天的愈合过程中，创面形成明显的疤痕组织，且在28天时疤痕依然明显。A7C3 Gel组在创面形成原位水凝胶后，对伤口起到封闭作用，将伤口与消化道管腔环境隔离。镜下检查发现，术后3天伤口无明显红肿，可见明显的肉芽组织填充；术后第9天时，肉芽缩小；第14天时，肉芽成熟，创面趋于平坦；第21天时，创面基本愈合；第28天时，创面平坦，形态与正常组织无显著差异。图22为ESD术后28天取材后食管形态图，从图22中可以看出，与正常食管组织相比(图22F)，A7C3水凝胶组(图22A-①、22D-②、22E-①)创面平整，无明显疤痕，而其它组都有不同程度的疤痕形成。犬食管ESD术后愈合效果表明，本发明水凝胶术后对伤口封闭有利于伤口愈合。

Claims

1.一种用于止血的组合物，其特征在于：它是由如下重量配比的组分组成：

不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐3～7份，硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖3～7份；

所述不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐中海藻酸盐氧化度为14％～50％；

所述不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐中不饱和碳碳双键接枝率为24％～37％；

所述硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖中硫醇接枝率为24％～52％；

所述不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐为马来酰亚胺接枝改性的氧化海藻酸盐；

所述硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖为半胱胺盐酸盐接枝改性的羧甲基壳聚糖。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：它是由如下重量配比的组分组成：

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：

所述海藻酸盐为海藻酸钠；和/或，所述羧甲基壳聚糖为取代度小于1的O-羧甲基壳聚糖。

4.根据权利要求1～3任一项所述的组合物，其特征在于：所述不饱和碳碳双键接枝改性的氧化海藻酸盐为马来酰亚胺接枝改性的氧化海藻酸钠，所述马来酰亚胺接枝改性的氧化海藻酸钠的制备方法包括如下步骤：

(3)反应后，透析，干燥，即得马来酰亚胺接枝改性的氧化海藻酸钠。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：

和/或，步骤(3)中，所述透析时先置于0.01～0.05M HCl去离子水溶液中透析3～5天，再置于去离子水中透析12～24h。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：

7.根据权利要求1～3任一项所述的组合物，其特征在于：所述硫醇基接枝改性的羧甲基壳聚糖合成方法包括如下步骤：

3)反应后，透析，冷冻干燥，醇析，即得巯基羧甲基壳聚糖。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于：

和/或，步骤3)中，所述透析时置于0.005～0.05M的硼砂溶液中透析3～5天，再置于去离子水中透析12～24h；和/或，步骤3)中，所述冷冻干燥前加入DTT搅拌反应；和/或，步骤3)中，所述醇析使用无水乙醇。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于：

10.权利要求1～9任一项所述的组合物在制备止血粉中的用途。

11.权利要求1～9任一项所述的组合物在制备止血粉水凝胶或消化道ESD用水凝胶中的用途。