CN115855911B - 粉末载体生物亲和性的测定方法及应用 - Google Patents
粉末载体生物亲和性的测定方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种粉末载体生物亲和性的测定方法及应用。该测定方法包括以下步骤：提供一载体混合物，并记录载体混合物中载体的挂膜情况。将载体混合物中的待测微生物进行染色形成染色微生物，得到染色混合物。获取染色混合物在荧光下的显示图像。根据显示图像得到显示图像中的载体面积以及染色微生物的微生物面积，根据二者面积比以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性。通过对待测微生物进行染色，因而在显示图像中可以较好识别染色微生物，从而获得微生物面积与粉末载体的载体面积的比值，进而结合挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性。上述测定方法不需要将载体和待测微生物进行分离称重，克服了由此带来的生物亲和性无法测定的问题。
Description
技术领域
本发明涉及粉末载体技术领域，尤其涉及一种粉末载体生物亲和性的测定方法及应用。
背景技术
高浓度复合粉末载体生物流化床（HPB）技术可在不增加现有生化单元占地面积的条件下，实现污水处理厂同步提标与扩容。该技术通过向生化池中投加复合粉末载体，提高生化池混合液浓度的同时，构建悬浮生长和附着生长“双泥”共生的微生物系统。复合粉末载体是由较大当量粒径微生物基础载体和微米级替代碳源功能材料复合而成。
填充在反应器中的粉末载体最大的作用就是为反应器内微生物的生长繁殖提供稳定的栖息场所。因此，考察粉末载体表面的生物量可直接反映载体的生物亲和性的好坏。常规载体（填料）的粒径较大（>1mm），能够较好实现与活性污泥进行分离，从而能够测量出生物量从而表征载体的生物亲和性。然而，粉末载体粒径较小（<200μm），与活性污泥絮体颗粒从粒径、密度等方面相近，粉末载体与活性污泥絮体颗粒二者分离过程困难，从而导致了无法用常规的评价方法进行其生物亲和性的评价。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种粉末载体生物亲和性的测定方法及应用，以解决粉末载体生物亲和性无法测量的技术问题。
为实现上述目的，本申请第一方面提供一种粉末载体生物亲和性的测定方法，包括以下步骤：
提供一载体混合物，并记录载体混合物的挂膜天数，载体混合物包括粉末载体和附着在载体上的待测微生物。
将载体混合物中的待测微生物进行染色形成染色微生物，得到染色混合物。
获取染色混合物在荧光下的显示图像，荧光为染色混合物中的染色微生物经激发产生。
根据显示图像得到显示图像中的粉末载体的载体面积，以及位于粉末载体范围内的染色微生物的微生物面积，并获得微生物面积和粉末载体面积的面积比。
根据面积比以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性。
可选地，将载体混合物中的待测微生物进行染色形成染色微生物的步骤包括：
将待测微生物采用细菌细胞活性测定试剂在黑暗的条件下进行染色。
可选地，染色微生物在激发波长为488 nm的条件下，产生发射波长最大值为500nm的荧光。
可选地，根据显示图像得到显示图像中的载体面积的步骤包括：
根据显示图像中的粉末载体的边缘，得到粉末载体的边缘构成的图形的面积。
可选地，根据显示图像得到位于粉末载体范围内的染色微生物的微生物面积的步骤包括：
根据显示图像中位于粉末载体的边缘构成的图形内染色微生物的染色区域，得到染色区域的面积。
可选地，载体混合物的数量为多个。
根据面积比以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性的步骤包括：
根据多个载体混合物的面积比得到面积比平均值，根据面积比平均值以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性。
可选地，载体混合物包括第一粉末载体混合物和第二粉末载体混合物。其中，第一粉末载体混合物包括第一粉末载体和附着在第一粉末载体上的第一待测微生物。第二粉末载体混合物包括第二粉末载体和附着在第二粉末载体上的第二待测微生物。第一粉末载体和第二粉末载体之间、第一待测微生物和第二待测微生物之间中仅有一者相同。
根据面积比以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性的步骤包括：
根据第一面积比与第二面积比的大小、第一粉末载体混合物的挂膜天数与第二粉末载体混合物的挂膜天数判断第一粉末载体与第二粉末载体的生物亲和性。第一面积比为在第一粉末载体混合物染色获得的显示图像中的微生物面积和第一粉末载体面积的面积比。第二面积比为在第二粉末载体混合物染色获得的显示图像中的微生物面积和第二粉末载体面积的面积比。
可选地，在第一粉末载体混合物和第二粉末载体混合物的挂膜天数相同的情形下，第一面积比与第二面积比中的数值大的一者对应的载体的生物亲和性大。
可选地，在第一面积比与第二面积比的大小相同的情形下，第一粉末载体混合物与第二粉末载体混合物的挂膜天数中的数值小的一者对应的粉末载体的生物亲和性大。
本申请第二方面提供上述的测定方法在制备粉末载体生物流化床中的应用。
上述的粉末载体生物亲和性的测定方法，对待测微生物进行染色，因而在显示图像中可以较好识别染色微生物，从而获得微生物面积与粉末载体的载体面积的比值，进而结合挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性。上述的粉末载体生物亲和性的测定方法，不需要将载体和待测微生物进行分离称重，克服了由此带来的生物亲和性无法测定的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1是本申请一实施方式的挂膜1天的微生物死活染色及成像图；其中，a为DE载体混合液的微生物死活染色及成像图；b为无机砂混合液的微生物死活染色及成像图；
图2是本申请一实施方式的挂膜2天的微生物死活染色及成像图；其中，a为DE载体混合液的微生物死活染色及成像图；b为无机砂混合液的微生物死活染色及成像图；
图3是本申请一实施方式的挂膜3天的微生物死活染色及成像图；其中，a为DE载体混合液的微生物死活染色及成像图；b为无机砂混合液的微生物死活染色及成像图；
图4是本申请一实施方式的挂膜5天的微生物死活染色及成像图；其中，a为DE载体混合液的微生物死活染色及成像图；b为无机砂混合液的微生物死活染色及成像图；
图5是本申请一实施方式的挂膜10天的微生物死活染色及成像图；其中，a为DE载体混合液的微生物死活染色及成像图；b为无机砂混合液的微生物死活染色及成像图；
图6是本申请一实施方式的挂膜15天的微生物死活染色及成像图；其中，a为DE载体混合液的微生物死活染色及成像图；b为无机砂混合液的微生物死活染色及成像图；
图7是本申请一实施方式的挂膜20天的微生物死活染色及成像图;其中，a为DE载体混合液的微生物死活染色及成像图；b为无机砂混合液的微生物死活染色及成像图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施方式中所有方向性指示（诸如上、下……）仅用于解释在某一特定姿态（如附图所示）下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
为实现上述目的，本申请第一方面提供一种粉末载体生物亲和性的测定方法，包括以下步骤：
S101:提供一载体混合物，并记录载体混合物的挂膜天数，载体混合物包括粉末载体和附着在载体上的待测微生物。
粉末载体可以填充在反应器中。微生物具有两种状态，一种为附着生长在载体上，另一种为悬浮状态，悬浮在水中。部分微生物会附着在载体上挂膜生长，通常随着挂膜天数的增加，微生物的量也会增加。附着在载体上的微生物为待测微生物。单个载体混合物为单个粉末载体和附着在载体上的待测微生物。载体混合液包括水和载体混合物。
S102:将载体混合物中的待测微生物进行染色形成染色微生物，得到染色混合物。
在该步骤中，为了染色方便以及后续观察方便，可以将载体混合物放置在载玻片上进行染色。染色所用的染料可进入微生物内，这样染料激发产生颜色，使得待测微生物呈现相应的颜色，而便于观测和获取显示图像。染色混合物包括粉末载体和附着在载体上的染色后的待测微生物。由于取样时，样品中除了载体混合物外，还可能包括悬浮状态的微生物，因此，在染色时，除了对待测微生物进行染色之外，还可能对悬浮状态的微生物也进行了染色。
在一些实施例中，将载体混合物中的待测微生物进行染色形成染色微生物的步骤包括：
将待测微生物采用细菌细胞活性测定试剂在黑暗的条件下进行染色。
在该步骤中，细菌细胞活性测定试剂进入活的微生物激发后显示颜色不同于，细菌细胞活性测定试剂进入受损或死亡微生物激发后显示颜色，如此可以区分活的微生物以及受损或死亡微生物。细菌细胞活性测定试剂对待测微生物染色，粉末载体不会染色，提高了检测结果的准确性。
细菌细胞活性测定试剂（例如可以使用细菌细胞活性测定试剂盒（LIVE / DEADBac Light TM BacterialViability Kit，L-7012））在黑暗条件下对待测微生物进行染色15 min。以下以细菌细胞活性测定试剂为细菌细胞活性测定试剂盒为例进行说明。
上述的粉末载体生物亲和性的测定方法，对待测微生物进行染色，因而在显示图像中可以较好识别染色微生物，从而获得微生物面积与粉末载体的载体面积的比值，进而结合挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性。上述的粉末载体生物亲和性的测定方法，不需要将粉末载体和待测微生物进行分离称重，克服了由此带来的生物亲和性无法测定的问题。可以理解的是，上述的粉末载体生物亲和性的测定方法适用于粉末载体上的微生物未完全覆盖粉末载体时，测量粉末载体的亲和性。
S103:获取染色混合物在荧光下的显示图像，荧光为染色混合物中的染色微生物经激发产生。
染色后的染色混合物可以置于激光共聚焦扫描电子显微镜下观察。染色后的待测微生物经激光激发产生荧光。可以将染色后的染色混合物激发显示的图像保存，得到显示图像。
在一些实施例中，染色微生物在激发波长为488 nm的条件下，产生发射波长最大值为500nm的荧光。
在该条件下，试剂盒中SYTO 9染料可直接进入活微生物，使膜内微生物显示为绿色荧光；受损或死亡微生物则显示为红色荧光。绿色荧光和红色荧光的颜色区分度较大，便于分辨和识别活微生物和受损或死亡微生物。
S104:根据显示图像得到显示图像中的粉末载体的载体面积，以及位于粉末载体范围内的染色微生物的微生物面积，并获得微生物面积和载体面积的面积比。
在该步骤中，可以将显示图像导入图像处理软件（例如， ImageJ ）中处理。在一些实施例中，根据显示图像得到显示图像中的载体面积的步骤包括：
根据显示图像中的粉末载体的边缘，得到粉末载体的边缘构成的图形的面积。
示例性地，粉末载体形状相对较为规则，例如粉末载体为硅藻土，硅藻土为圆盘状，故而其边缘规则，在后续的显示图像中易于识别硅藻土边缘。图像处理软件容易识别粉末载体的边缘，粉末载体的边缘构成的图形较为清晰，可以计算得到粉末载体的面积。当粉末载体的部分边缘被遮挡时，可根据粉末载体的未被遮挡的边缘及粉末载体的整体形状确定被遮盖的部分边缘，如，硅藻土的部分边缘被遮挡时，可根据硅藻土的圆盘状轮廓以及未被遮挡的边缘位置，确定被遮盖的部分边缘的位置。
示例性地，粉末载体颜色与其他物质的颜色有较大差异，如无机砂、沸石、活性炭，以石英砂为例，在显示图像中无机砂的颜色与其他物质（如待测微生物，淤泥）的颜色有较大差异，从而识别无机砂的边缘。图像处理软件容易识别粉末载体的边缘，粉末载体的边缘构成的图形较为清晰，可以计算得到粉末载体的面积。
在一些实施例中，根据显示图像得到位于粉末载体范围内的染色微生物的微生物面积的步骤包括：
根据显示图像中位于粉末载体的边缘构成的图形内染色微生物的染色区域，得到染色区域的面积。
染色微生物因而显示特定的颜色，容易与周边环境区分，如粉末载体的边缘以及粉末载体上未附着染色微生物的区域。粉末载体范围内的染色微生物的微生物面积，即位于粉末载体的边缘构成的图形内的染色微生物的染色区域面积。
因此，也可以通过图像处理软件计算得到染色微生物的微生物面积。然后计算微生物面积和粉末载体的面积二者的面积比。
S105:根据面积比以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性。
面积比以及挂膜天数可以评价该待测微生物对该载体的亲和性，记录该数据。可以理解的是，可以以该方法获得各待测微生物对各载体的面积比以及挂膜天数，从而建立一个亲和性的数据库。
面积比大的说明该载体上附着的微生物的数量较多，因而，该微生物对该载体的亲和性较好。而达到一定面积比所需的挂膜天数小，也说明微生物对该载体的亲和性较好。
由于单个粉末载体的体积小，因而在反应中取样时，样品中可能包括单个或多个载体混合物。在一些实施中，载体混合物的数量为多个。即显示图像中包括多个粉末载体的图像、多个粉末载体上的染色微生物图像以及悬浮状态的染色微生物图像。
根据面积比以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性的步骤包括：根据多个载体混合物的面积比得到面积比平均值，根据面积比平均值以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性。这样一来，可以更为准确的判断粉末载体的生物亲和性。
在一些实施例中，载体混合液包括第一粉末载体混合物和第二粉末载体混合物。其中，第一粉末载体混合物包括第一粉末载体和附着在第一粉末载体上的第一待测微生物。第二粉末载体混合物包括第二粉末载体和附着在第二粉末载体上的第二待测微生物。第一粉末载体和第二粉末载体、第一待测微生物和第二待测微生物中仅有一者相同。
根据面积比以及挂膜天数判断粉末载体的生物亲和性的步骤包括：
根据第一面积比与第二面积比的大小、第一粉末载体混合物的挂膜天数与第二粉末载体混合物的挂膜天数判断第一粉末载体与第二粉末载体的生物亲和性。第一面积比为在第一粉末载体混合物染色获得的显示图像中的微生物面积和第一粉末载体面积的面积比。第二面积比为在第二粉末载体混合物染色获得的显示图像中的微生物面积和第二粉末载体面积的面积比。
也就是说在比较第一粉末载体混合物和第二粉末载体混合物时，或者两个待测微生物相同而对应的载体不同，或者两个载体相同而对应的待测微生物不同。这样在可以评价不同的待测微生物在同一载体上的亲和性，或者同一待测微生物在不同的载体上的亲和性。
在一些实施例中，在第一粉末载体混合物和第二粉末载体混合物的挂膜天数相同的情形下，第一面积比与第二面积比中的数值大的一者对应的载体的生物亲和性大。在相同挂膜天数的条件下，面积比大的说明该载体上附着的微生物的数量较多，因而，该微生物对该载体的亲和性较好。
在另一些实施例中，在第一面积比与第二面积比的大小相同的情形下，第一粉末载体混合物与第二粉末载体混合物的挂膜天数中的数值小的一者对应的载体的生物亲和性大。同样地，在相同面积比的条件下，面积比大的说明该载体上附着的微生物的数量较多。
本申请第二方面提供上述的测定方法在制备粉末载体生物流化床中的应用。
实施例1：
SBR反应器运行过程分为进水、厌氧、好氧、沉淀、排水和静置阶段，时间分别为10、120、90、30和28min，充水比为1:3，进水COD/TN=4，溶解氧控制在2.0mg/L。
按照上述运行条件进行SBR反应器运行，运行30 d，污泥采自于花桥污水处理厂，并过100目网筛，去除较大颗粒和杂质；反应器进水采用实验室配水，采用乙酸钠、氯化铵、硝酸钾和磷酸二氢钾配制进水COD、氨氮、硝酸盐氮和总磷分别为100mg/L、25 mg/L、25 mg/L和3 mg/L。载体选择硅藻土载体粉末，平均粒径为48.6微米。
（1）取硅藻土载体（也可以称为DE载体）DE载体混合液样品（运行至完全挂膜完成），将载体置于载玻片上，使用细菌细胞活性测定试剂盒（LIVE / DEAD Bac Light TMBacterial Viability Kit，L-7012）于黑暗条件下对样品进行染色15 min。
（2）染色后的DE载体置于激光共聚焦扫描电子显微镜下观察。激发波长为488nm，发射波长最大值为500 nm。试剂盒中SYTO 9染料可直接进入活微生物，使膜内微生物显示为绿色荧光强度；受损或死亡微生物则显示为红色荧光。表明载体表面富集的菌体是有较高活性的。
（3）通过软件 ImageJ 测出单个载体面积S1，另外统计出单个载体面积活微生物（绿色）面积S2，通过S2/S1的比值反应载体的生物亲和性，可以设定：在S2/S1为50%的相同挂膜天数下，天数越小表示载体生物亲和性越好，说明其挂膜速度快；或者在相同的挂膜天数条件下，S2/S1的值越大，表示载体生物亲和性越好，说明其生长的生物量大。
实验结果
载体微生物活性实验
参见图1至图7，图1至图7分别为运行1天、2天、3天、5天、10天、15天以及20天的微生物死活染色及成像图。在图1至图7中，右侧图（即采用b标识的图）为无机砂混合液样品的微生物死活染色及成像图，左侧图（即采用a标识的图）为DE载体混合液的微生物死活染色及成像图。为便于理解，在图1至图7中，用较为稀疏的虚线框标识DE载体，较为致密的虚线框标识石英砂。
通过对不同运行时间DE载体、无机砂混合液样品进行微生物活死细胞染色及成像实验，对拍摄结果进行分析可知：随着挂膜实验的进行，活细胞的数量不断增加，并且附着在生物载体上的微生物活细胞不断增加。
为便于理解，在图4中，A处所示的虚线框中，DE载体的面积为16287px（pixel，像素），载体所在范围内的微生物面积为3050px，微生物面积和DE载体面积的面积比为18.7%。B处所示的虚线框中，载体的面积为1947px，载体所在范围内的微生物面积为147px，微生物面积和DE载体面积的面积比为7.5%。
其他天数的图片中，载体的面积、载体所在范围内的微生物面积可以参照上述方法进行测量。
结论
从载体微生物活性实验结果说明DE载体相较于无机砂具有更好的生物亲和性。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。
Claims (9)
1.一种粉末载体生物亲和性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供一载体混合物，并记录所述载体混合物的挂膜天数，所述载体混合物包括粉末载体和附着在所述载体上的待测微生物；
将所述载体混合物中的所述待测微生物进行染色形成染色微生物，得到染色混合物；
获取所述染色混合物在荧光下的显示图像，所述荧光为所述染色混合物中的染色微生物经激发产生；
根据所述显示图像得到所述显示图像中的所述粉末载体的载体面积，以及位于所述粉末载体范围内的所述染色微生物的微生物面积，并获得所述微生物面积和所述粉末载体面积的面积比；所述根据所述显示图像得到位于所述粉末载体范围内的所述染色微生物的微生物面积的步骤包括：
根据所述显示图像中位于所述粉末载体的边缘构成的图形内染色微生物的染色区域，得到所述染色区域的面积；
根据所述面积比以及所述挂膜天数判断所述粉末载体的生物亲和性;其中，在相同挂膜天数的条件下，面积比大一者对应的粉末载体的生物亲和性大；在相同面积比的条件下，挂膜天数小一者对应的粉末载体的生物亲和性大的粉末载体的生物亲和性好。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述将所述载体混合物中的所述待测微生物进行染色形成染色微生物的步骤包括：
将所述待测微生物采用细菌细胞活性测定试剂在黑暗的条件下进行染色。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述染色微生物在激发波长为488 nm的条件下，产生发射波长最大值为500nm的荧光。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述根据所述显示图像得到所述显示图像中的载体面积的步骤包括：
根据所述显示图像中的所述粉末载体的边缘，得到所述粉末载体的边缘构成的图形的面积。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述载体混合物的数量为多个；
所述根据所述面积比以及所述挂膜天数判断所述粉末载体的生物亲和性的步骤包括：
根据多个所述载体混合物的面积比得到面积比平均值，根据所述面积比平均值以及所述挂膜天数判断所述粉末载体的生物亲和性。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述载体混合物包括第一粉末载体混合物和第二粉末载体混合物；其中，第一粉末载体混合物包括第一粉末载体和附着在所述第一粉末载体上的第一待测微生物；第二粉末载体混合物包括第二粉末载体和附着在所述第二粉末载体上的第二待测微生物；所述第一粉末载体和所述第二粉末载体之间、所述第一待测微生物和所述第二待测微生物之间中仅有一者相同；
所述根据所述面积比以及所述挂膜天数判断所述粉末载体的生物亲和性的步骤包括：
根据第一面积比与第二面积比的大小、所述第一粉末载体混合物的挂膜天数与所述第二粉末载体混合物的挂膜天数判断所述第一粉末载体与第二粉末载体的生物亲和性；所述第一面积比为在所述第一粉末载体混合物染色获得的显示图像中的所述微生物面积和所述第一粉末载体面积的面积比；所述第二面积比为在所述第二粉末载体混合物染色获得的显示图像中的所述微生物面积和所述第二粉末载体面积的面积比。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，在所述第一粉末载体混合物和所述第二粉末载体混合物的挂膜天数相同的情形下，所述第一面积比与第二面积比中的数值大的一者对应的载体的生物亲和性大。
8.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，在所述第一面积比与第二面积比的大小相同的情形下，所述第一粉末载体混合物与所述第二粉末载体混合物的挂膜天数中的数值小的一者对应的粉末载体的生物亲和性大。
9.一种权利要求1~8中任一项所述的测定方法在制备粉末载体生物流化床中的应用。
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