CN115852010B - 一种蕙兰ssr引物组及应用该引物组构建蕙兰品种指纹图谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蕙兰SSR引物组及应用该引物组构建蕙兰品种指纹图谱的方法。该蕙兰SSR引物组包括14对SSR引物序列。本发明利用该14对SSR引物序列对蕙兰基因组DNA进行多重PCR扩增，利用毛细管荧光电泳检测PCR产物，对SSR标记数据进行分析，构建79种蕙兰SSR指纹图谱，并能够有效的鉴定出蕙兰品种。本发明构建蕙兰品种指纹图谱的方法具有高通量、高精度、成本低的优点，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蕙兰SSR引物组及应用该引物组构建蕙兰品种指纹图谱的方法。
背景技术
蕙兰(Cymbidium faberi)，是兰科兰属地生种。株型较大，叶姿优美，总状花序具5-10朵花，花型较大，花朵宽大艳丽，是我国传统名贵花卉，在国内外市场深受欢迎。尽管蕙兰拥有悠久栽培历史和文化传承，但品种鉴定大多取决于传统形态指标，在尚未开花的时候难以通过叶片和株型精准鉴定品种。近年来，随着蕙兰的推广和市场发展壮大，加之互联网技术的迅速发展，各大电商平台、社交媒体和论坛提供了更加多样化的交易渠道，兰花市场上出现的蕙兰品种超500种，然而尚无统一规范的品种鉴定标准，产品以次充好，品种混淆的现象普遍存在。为促进适应市场需求的品种选育、鉴定和推广，势必要求建立与之相适应的兰花品种鉴定标准。
兰科植物在全球分布广泛，有801属，超27500种。近年来，分子标记，主要包括RAPD、ISSR、SSR、SRAP和ScoT等广泛用于兰花种内、种间及品种间的分类鉴定、遗传多样性、亲缘关系的分析以及种质资源与种群方面的研究。然而对我国特色资源的鉴定评价受限于地域局限和品种收集难度，目前在国内还未见基于毛细管电泳技术和SSR分子标记对蕙兰品种进行高通量鉴定的相关报道。因此，开展本发明采用SSR分子标记对蕙兰品种进行鉴定，将对种质资源鉴评、种质创新利用以及商品花质量监督和市场规范等方面具有重要意义。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种蕙兰SSR引物组及利用该引物组、将毛细管电泳技术与SSR-PCR技术结合的构建蕙兰品种指纹图谱的方法，以快速高效鉴定蕙兰品种。
本发明的第一个目的是提供一种蕙兰SSR引物组，其包括以下14对SSR引物序列：
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R:5’-GTGCGTGAGAGAGAGAAAGACA-3’；
SSR_71852_c0_g2i1 F:5’-GGCACCTCTGGAATTTCTGGT-3’
R:5’-GTGCGTGAGAGAGAGAAAGACA-3’；
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R:5’-TGAGGCTTGACTAACCCGTC-3’；
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R:5’-GTCCACAGAGGCAGAGACAT-3’；
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R:5’-TCTCGTCCTTTCCCTCCCTT-3’。
本发明的第二个目的是提供上述的蕙兰SSR引物组在构建蕙兰品种指纹图谱中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述的蕙兰SSR引物组在鉴定蕙兰品种中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种蕙兰品种指纹图谱的构建方法，其包括以下步骤：
(1)提取蕙兰样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物组为扩增引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对蕙兰每个品种的样品DNA的扩增结果形成扩增片段长度数据化编码，构建得到蕙兰品种指纹图谱。
进一步的，步骤(2)中的PCR反应体系包括：10×PCR Buffer 3μL、2.5mM dNTP 2μL、MgCl2 2μL、Primer A 2μL、Primer B 2μL、Template 1μL、ddH2O 18μL、Taq酶0.2μL。
所述PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
进一步的，步骤(3)中将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对蕙兰每个品种的样品DNA的扩增结果形成扩增片段长度数据化编码，具体为：按照SSR_21319_c0_g2i1、SSR_71852_c0_g2i1、SSR_92040_c0_g1i7、SSR_12201_c0_g1i10、SSR_42275_c0_g1i1、SSR_52366_c0_g1i1、SSR_32581_c0_g1i1、SSR_22677_c0_g2i1、SSR_12742_c0_g7i1、SSR_62892_c1_g1i6、SSR_33144_c2_g1i2、SSR_33179_c0_g1i2、SSR_73252_c3_g1i1、SSR_53283_c0_g5i3的分子标记顺序排列，通过毛细管电泳结果，依次记录每个蕙兰品种经每对SSR引物扩增出现的片段长度，依据各个扩增片段长度进行数据化编码，即为该蕙兰品种的DNA指纹图谱。
进一步的，所述依据各个扩增片段长度进行数据化编码，具体为：将各位点扩增片段的等位基因按分子量大小排列，等位基因从小到大以阿拉伯数字1-9标注，9个以上的等位基因，以大写英文字母A-Z标注，若该位点在某个品种中无扩增则记为0，每个位点占两位。
本发明的第五个目的是提供一种蕙兰品种指纹图谱，是由上述蕙兰品种指纹图谱构建方法构建得到。
本发明的第六个目的是提供上述的蕙兰品种指纹图谱在鉴定蕙兰品种中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种鉴定蕙兰品种的试剂盒，该试剂盒含有上述的蕙兰SSR引物组。
本发明的有益效果为：
(1)本发明利用毛细管电泳技术，实现了SSR分子标记与高效、自动化毛细管电泳技术的有益结合，检测结果由分析软件自动保存，检测速度快，分离效率高，灵敏度较高，精确度达到1bp以内，有利于大批量样品的检测分析，为SSR分子标记技术在蕙兰品种鉴定中的推广和应用打下了坚实的基础。
(2)本发明鉴定方法成本低，试剂耗材市场成熟，不计人工与仪器损耗，一个样品的检测成本低于10元。
附图说明
图1为SSR标记筛选的部分代表图，样品顺序从左到右依次为老染字，大一品，南阳梅，金奥素和郑孝荷。
图2为以引物对SSR_62892_c1_g1i6对不同蕙兰品种进行扩增结果峰图，从上到下依次为老染字，大一品，南阳梅和郑孝荷四个不同蕙兰品种的扩增峰图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、蕙兰品种采集
样品来源于蕙兰主产区中国广东省、中国广西壮族自治区和中国台湾省，囊括不同花型、花色、叶色的79个品种，如下表1所示。
表1 79份蕙兰品种
2、蕙兰基因组DNA提取
对所收集的79份蕙兰种质资源，用植物基因组DNA试剂盒(天根公司)提取。首先，分批采集幼叶，每份样品分2-3份(每份2g左右)存于2mL离心管中，液氮速冻后，-80℃冰箱冻存备用。用预冷的研钵和研棒，将冻存的植物组织充分研磨，提取其基因组DNA。用1％琼脂糖胶上电泳，GV(Gold view)染色，用凝胶成像系统检测条带，判断DNA提取的质量，并用紫外分光光度计测定其DNA浓度。
3、全基因组SSR标记开发及筛选
3.1SSR引物设计
根据蕙兰全基因组参考序列，用SSR Hunter等软件，共开发出50个SSR分子标记，并用Primer 5软件设计50对扩增各SSR的上下游引物(表2)。对开发的50个SSR分子标记，以各种兰花基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增用的Mix(由Es Taq DNA Polymerase、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系，并加入蓝色染料)购自天根公司；50对SSR引物购自加拿大生工公司上海分公司。
表2 50对引物列表
3.2PCR反应体系包括10×PCR Buffer 3μL，2.5mM dNTP 2μL，MgCl2 2μL，PrimerA2μL，Primer B 2μL，Template 1μL，H2O 18μL，Taq酶0.2μL。
PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
3.3 2.0％琼脂糖凝胶电泳检测
每孔上样10μL PCR产物，100bp ladder指示，120v跑电泳60min初步筛选多态性引物(以同一引物不同样品扩增的片段大小为指标)(图1)。根据电泳检测结果，筛选出14对条带特异性强、在各样品中多态性明显的SSR分子标记，进行荧光引物设计，用于蕙兰种质资源的分子鉴定。14对SSR引物序列具体见表3。
表3 14对SSR引物序列
4、SSR-PCR及毛细管电泳检测
4.1SSR-PCR反应
PCR反应体系总体积为10μL，包括1.2μL DNA模板(50ng/μL)，1.0μL 10×BufferΙ缓冲液，0.1μL TAKARA HS Taq酶(5U/μL)，0.6μL正向引物(5μM)，0.6μL反向引物(5μM)，0.8μL 2.5mM dNTP，0.5μL TP-M13(5μM)，去离子水补足至10μL。
PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
4.2毛细管电泳检测
96孔板中每孔加入扩增产物1.0μL，ROX-500分子量内标和甲酰胺混合液(体积比0.5:8.5)9μL，95℃变性3min后，上ABI 3730XL检测仪进行检测，1kV电压进样10s，电泳15kV，30min。
5、引物扩增结果分析
用筛选出的14对多态性SSR引物，对检测合格的79份蕙兰样本进行基于毛细管电泳荧光检测的STR分型。结果显示，引物对SSR_62892_c1_g1i6能在96.87％样本中检出条带，检出率最高；平均检出率为88.60％(表4)，说明这14对多态性SSR引物可有效用于蕙兰品种的分子鉴定。以引物对SSR_62892_c1_g1i6扩增结果峰图为例进行展示(图2)，本发明所述的SSR分子标记引物扩增效果好，检出率高，且可扩增出稳定的DNA条带。
表4筛选出的14对多态性SSR引物在79份蕙兰样本中的检出情况
6、数据分析
将Data Colletion软件收集的原始数据文件导入到GeneMapper 6.0软件中进行分析，将各峰值的位置与其泳道中的分子量内标予以比较，计算目标DNA片段的准确大小。各荧光标记座位上独立进行3次重复的毛细管电泳检测，取3次重复的平均值并四舍五入取整，作为实验材料在该座位上的数据。
采用POPGENE1.31和PowerMarker软件进行以下遗传多样性参数的分析，运用PAST3等软件进行遗传多样性指标、聚类及多态信息含量(PIC)计算分析：
观测等位基因数(Na)，基因观测杂合度(Ho)，基因期望杂合度(He)，多态性信息含量(PIC)，有效等位基因数(Ne)，遗传偏离指数(D)，Shannon–Weaver diversity index(I)，聚类图谱，DNA指纹条带信息及分子身份证信息等。利用生物信息学软件(POPGENE、MEGA、Joinmap、Structure、R等)对STR分型数据进行遗传多样性和聚类分析。运用NTSYS等软件进行遗传多样性指标、聚类及多态信息含量(PIC)计算分析。结果见表5。
表5遗传多样性分析结果
7、分子身份证构建
按照二倍体标准构建，依据SSR检测结果，对指纹数据进行数据化编码(各位点扩增片段按分子量大小排列，扩增片段(等位基因)从小到大以阿拉伯数字1-9标注，9个以上的等位基因，以大写英文字母A-Z标注)，若该位点在某个品种中无扩增则记为0，每个位点占两位。其中，分子身份证SSR分子标记顺序为：SSR_21319_c0_g2i1、SSR_71852_c0_g2i1、SSR_92040_c0_g1i7、SSR_12201_c0_g1i10、SSR_42275_c0_g1i1、SSR_52366_c0_g1i1、SSR_32581_c0_g1i1、SSR_22677_c0_g2i1、SSR_12742_c0_g7i1、SSR_62892_c1_g1i6、SSR_33144_c2_g1i2、SSR_33179_c0_g1i2、SSR_73252_c3_g1i1、SSR_53283_c0_g5i3。
79份蕙兰品种的指纹图谱见表6。
表6 79份蕙兰品种的指纹图谱
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.蕙兰SSR引物组，其特征在于，包括以下13对SSR引物序列：
SSR_21319_c0_g2i1 F:5’-GGCACCTCTGGAATTTCTGGT-3’
R:5’-GTGCGTGAGAGAGAGAAAGACA-3’；SSR_92040_c0_g1i7 F:5’-AGGTTGCCAAGCTAGCTACT-3’
R:5’-TGAGGCTTGACTAACCCGTC-3’；
SSR_12201_c0_g1i10 F:5’-CACGCGAACGCAATACAGAG-3’
R:5’-ACAGAGATGCGTGCATGTGA-3’；
SSR_42275_c0_g1i1 F:5’-TTCTTGTCTGCTCGCTCCAG-3’
R:5’-CCCATTGCCTTCACCTCCTT-3’；
SSR_52366_c0_g1i1 F:5’-GGGTGAGAGGAAAAGTGGACT-3’
R:5’-TCACATCACCAGTGCTGCAT-3’；
SSR_32581_c0_g1i1 F:5’-CACGGCTGCTCATCAGAATG-3’
R:5’-GTCCACAGAGGCAGAGACAT-3’；
SSR_22677_c0_g2i1 F:5’-TTGTCATCGGCATTGACCAA-3’
R:5’-TGTGGGAAAAACATGGGAATTGG-3’；SSR_12742_c0_g7i1 F:5’-AACAGGAGCTAATCACGGGC-3’
R:5’-CAGCCCAGCGTTCAAAAGAC-3’；
SSR_62892_c1_g1i6 F:5’-GCCTCATGTAGGGGAGCTTC-3’
R:5’-ATCGTCCACCTGTTATCCGC-3’；
SSR_33144_c2_g1i2 F:5’-AGCATCTCGCAGAACTTTACTG-3’
R:5’-CTTGCTCTCTCCCTCTCCCT-3’；
SSR_33179_c0_g1i2 F:5’-CATCCACGGACCCAAATCCA-3’
R:5’-TCGACGATGAGTAATGGTGGT-3’；
SSR_73252_c3_g1i1 F:5’-AGCCATCAATCACTGTGCGA-3’
R:5’-TGGATATGCCTACTGCCCTG-3’；
SSR_53283_c0_g5i3 F:5’-TCTGTTGCTAGCCTTCTCCAC-3’
R:5’-TCTCGTCCTTTCCCTCCCTT-3’。
2.权利要求1所述的蕙兰SSR引物组在构建蕙兰品种指纹图谱中的应用。
3.权利要求1所述的蕙兰SSR引物组在鉴定蕙兰品种中的应用；所述的蕙兰品种包括老染字、荡字、程梅、南阳梅、郑孝荷、长寿梅、翠萼、解佩梅、老极品、金奥素、江南新极品、端蕙梅、适园、卢氏雄狮、紫砂星、鼎红蕊蝶、秀香锦、杂交蕙兰虎斑、关顶、金边蕙兰、绿牡丹、银边蕙兰、大陈字、大叠彩、远东麒麟、远东奇蝶、仙绿、元字、绿峰巧、温州素、翠定荷素、庆华梅、刘梅、潘绿、水晶龙、上海梅、染字、楼梅、极品、端梅、荣梅、天娇牡丹、四喜牡丹、绿云牡丹、陆壹奇蝶、楼台蝶、英蝶、步步高、群英荟萃、仙荷极品、鉴湖之美、泉州梅、翠桃献寿、狮蝶、岭南白鹤、金铃、蕙兰水晶花、紫鹃、越王梅、聚花素、朵云、浙顶、端秀梅、叠翠、春蕙千手观音、贵妃、粉梦露、楠茜、梦幻、碧玉、幻影、华尔兹、玉禅、黎明、夕阳。
4.一种蕙兰品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取蕙兰样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物组为扩增引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对蕙兰每个品种的样品DNA的扩增结果形成扩增片段长度数据化编码，构建得到蕙兰品种指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的蕙兰品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR反应体系包括：10×PCR Buffer 3μL、2.5mM dNTP 2μL、MgCl2 2μL、Primer A 2μL、PrimerB 2μL、Template 1μL、ddH2O 18μL、Taq酶0.2μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；
95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
6.根据权利要求4所述的蕙兰品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)中将扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果对蕙兰每个品种的样品DNA的扩增结果形成扩增片段长度数据化编码，具体为：按照SSR_21319_c0_g2i1、SSR_92040_c0_g1i7、SSR_12201_c0_g1i10、SSR_42275_c0_g1i1、SSR_52366_c0_g1i1、SSR_32581_c0_g1i1、SSR_22677_c0_g2i1、SSR_12742_c0_g7i1、SSR_62892_c1_g1i6、SSR_33144_c2_g1i2、SSR_33179_c0_g1i2、SSR_73252_c3_g1i1、SSR_53283_c0_g5i3的分子标记顺序排列，通过毛细管电泳结果，依次记录每个蕙兰品种经每对SSR引物扩增出现的片段长度，依据各个扩增片段长度进行数据化编码，即为该蕙兰品种的DNA指纹图谱。
7.根据权利要求6所述的蕙兰品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述依据各个扩增片段长度进行数据化编码，具体为：将各位点扩增片段的等位基因按分子量大小排列，等位基因从小到大以阿拉伯数字1-9标注，9个以上的等位基因，以大写英文字母A-Z标注，若该位点在某个品种中无扩增则记为0，每个位点占两位。
8.根据权利要求4-7任一项所述的构建方法构建得到的蕙兰品种指纹图谱在鉴定蕙兰品种中的应用；所述的蕙兰品种包括老染字、荡字、程梅、南阳梅、郑孝荷、长寿梅、翠萼、解佩梅、老极品、金奥素、江南新极品、端蕙梅、适园、卢氏雄狮、紫砂星、鼎红蕊蝶、秀香锦、杂交蕙兰虎斑、关顶、金边蕙兰、绿牡丹、银边蕙兰、大陈字、大叠彩、远东麒麟、远东奇蝶、仙绿、元字、绿峰巧、温州素、翠定荷素、庆华梅、刘梅、潘绿、水晶龙、上海梅、染字、楼梅、极品、端梅、荣梅、天娇牡丹、四喜牡丹、绿云牡丹、陆壹奇蝶、楼台蝶、英蝶、步步高、群英荟萃、仙荷极品、鉴湖之美、泉州梅、翠桃献寿、狮蝶、岭南白鹤、金铃、蕙兰水晶花、紫鹃、越王梅、聚花素、朵云、浙顶、端秀梅、叠翠、春蕙千手观音、贵妃、粉梦露、楠茜、梦幻、碧玉、幻影、华尔兹、玉禅、黎明、夕阳。
9.一种鉴定蕙兰品种的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的蕙兰SSR引物组。
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