CN115850755B - 微生物改性木质素复合胶原蛋白薄膜、制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物改性木质素复合胶原蛋白薄膜、制备与应用，属于复合膜技术领域。将生物质使用碱预处理，得到初始富含木质素复合物，并进行灭菌；然后加入能够食用的真菌进行培养，所述能够食用的真菌用于使木质素降解，培养后去沉淀取上清液；将胶原蛋白溶胀并调节pH至碱性，然后加入上清液中，充分混匀，得到混合溶液；再倒入平板中，然后干燥，即得到微生物改性碱处理木质素复合胶原蛋白薄膜。本发明的复合膜具有抗菌活性高，抗氧化能力强，表面均匀，柔韧性好等优点；其原料为胶原蛋白和改性木质素，均为生物可再生资源，对环境危害小，成本低，成膜性强。
Description
技术领域
本发明属于复合膜技术领域，更具体地，涉及微生物改性木质素复合胶原蛋白薄膜、制备与应用。
背景技术
胶原蛋白是一种从动物皮肤、肌腱和各种结缔组织中获得的蛋白质，可形成具有高表面均匀性、柔韧性的薄膜。在食品包装行业，由于对环境的危害较小，生物降解聚合物相比于化石基聚合物拥有更好的环境友好性和可持续发展性。胶原蛋白可以自组装形成具有高表面均匀性和柔韧性的薄膜，但其作为包装材料的应用受到机械强度低、抗菌性能弱、抗氧化性能弱的限制。研究表明，胶原膜的性能可以通过与其他天然聚合物(如多糖、精油和多酚)交联来改善。
木质素是一种丰富的天然聚合物，含有许多官能团(酚类和脂肪族羟基、羰基、羧基和甲氧基)。木质素作为仅次于纤维素的第二丰富的可再生和可生物降解的自然资源，具有抗氧化、抗菌和阻隔特性。其结构中含有许多不同比例的官能团，为化学改性和极性调整提供了空间，以产生与适当聚合物基质的相容性、特定的抗氧化性能和紫外线稳定效果。木质素具有芳香族和高度交联的结构，并且由于其官能团而具有很强的反应性，将生物质经过碱处理后经生物改性得到的木质素(APL)加入到复合薄膜中可以与胶原蛋白相互作用，加强胶原蛋白之间以及胶原蛋白和木质素(APL)之间的交联，从而增加其机械强度，但在实际应用中，木质素结构和分子量的异质性和顽固倾向限制了其反应活性，使其成为薄膜材料存在一定的限制。
综上所述，为了适应社会经济发展的需要以及响应国家可持续发展战略，提供一种安全环保的新型食品包装薄膜颇具意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种微生物改性木质素复合胶原蛋白膜及其制备方法与应用，以胶原蛋白网络为基体，添加生物改性后的木质素(APL)为辅料，制备出机械性能强，抗氧化性，抗菌活性高，表面均匀的绿色环保无毒害食品包装薄膜。
根据本发明第一方面，提供了一种微生物改性木质素复合胶原蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将生物质使用碱预处理，离心去除沉淀，得到富含木质素复合物，并进行灭菌；
(2)向步骤(1)得到的灭菌后的富含木质素复合物溶液加入能够食用的真菌进行培养，所述能够食用的真菌用于使木质素降解，培养后去沉淀取上清液；
(3)将胶原蛋白溶胀并调节pH至碱性，然后加入步骤(2)得到的上清液中，充分混匀，得到混合溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合溶液倒入平板中，然后干燥，即得到微生物改性木质素复合胶原蛋白薄膜。
优选地，步骤(2)中，所述能够食药用的真菌为刺孢小克银汉霉科、灵芝菌科、平菇菌科、裂褶菌科或炭角菌科。
优选地，步骤(3)中，包括向混合溶液中加入甘油。
优选地，所述甘油的质量为胶原蛋白的质量与上清液中固形物质量总和的10％-20％。
优选地，步骤(2)中，所述培养的时间为3天-10天。
优选地，步骤(3)中，所述胶原蛋白与上清液中固形物的质量比为(1-5):1。
优选地，所述木质素来源于秸秆、草或树木。
根据本发明另一方面，提供了任意一项所述方法制备得到的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜。
根据本发明另一方面，提供了所述的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜用于食品包装膜的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明对生物质进行碱处理得到富含木质素复合物，并对其进行生物改性得到的木质素(APL)。根据木质素(APL)中丰富的功能性组分，如：酚羟基，甲氧基，羧基等这一特点，利用微生物菌群对其进行发酵改性，提升了木质素(APL)的抗氧化性、抗菌性等，为获得优质食品薄膜提供了良好的材料。本发明的复合食品包装薄膜具有抗菌活性高，抗氧化能力强，表面均匀，柔韧性好等优点。其原料为胶原蛋白和改性木质素(APL)，均为生物可再生资源，对环境危害小，成本低，成膜性强，其合成的食品薄膜在应用前景上能与以化石基聚合物为原料制备的薄膜相媲美，在市场上占有一席之地。
(2)本发明中木质素(APL)由于碱预处理通常含有多糖和单糖，这些多糖的含量会对后续膜的力学性能产生不同的影响。经过生物修饰后，真菌利用木质素(APL)中的糖，使其木质素(APL)中的总糖减少。根据成分分析，由于真菌对糖的消耗，所有真菌处理过的木质素(APL)中纤维素和半纤维素含量均有所降低，不同真菌处理过的木质素(APL)中组分的变化以及通过GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)测得芳香族化合物含量，进一步证实了该真菌对木质素(APL)的降解作用。并随之与胶原蛋白结合制备薄膜，实现抗菌性、抗氧化性和机械强度的同时提高。因此，生物改性碱处理木质素，将复杂的大分子部分降解成有功能性的小分子单元，改善了胶原蛋白薄膜本身存在的低机械强度，低抗菌性与低抗氧化性等问题。本发明相比于改善胶原蛋白性能的传统方法，该方法操作简单，成本较低，产量可观，不会产生有毒有害的化学物质，是一种绿色简便的改善薄膜保鲜性能的手段。
(3)本发明优选地，还包括加入甘油作为增塑剂，提升薄膜柔韧性。
附图说明
图1是本发明的生产工艺流程图。
图2是根据本发明中生物改性碱处理木质素糖含量与可溶性固含量变化图。
图3是根据本发明中不同生物改性碱处理木质素经GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)测得芳香族化合物差异。
图4是根据本发明制备的APL/胶原蛋白复合薄膜测得的表面SEM显微图；其中：A/a:纯胶原蛋白薄膜；B/b:胶原蛋白/未改性APL复合薄膜；C/c:胶原蛋白/FR3改性APL复合薄膜；D/d:胶原蛋白/EN2改性APL复合薄膜；E/e:胶原蛋白/BP3改性APL复合薄膜；F/f:胶原蛋白/DS1改性APL复合薄膜；G/g:胶原蛋白/XY改性APL复合薄膜。
图5是根据本发明中不同生物改性碱处理木质素APL与胶原蛋白制备复合薄膜抗菌性测试图。
图6是根据本发明中不同生物改性碱处理木质素APL与胶原蛋白制备复合薄膜抗氧化性测试图。
图7是根据本发明中不同生物改性碱处理木质素APL与胶原蛋白制备复合薄膜机械强度测试图。
图8是根据本发明中不同生物改性碱处理木质素APL与胶原蛋白制备复合薄膜展示图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中木质素(APL)由于碱预处理通常含有多糖和单糖，这些多糖的含量会对后续膜的力学性能产生不同的影响。经过生物修饰后，真菌利用木质素(APL)中的糖，使其木质素(APL)中的总糖减少。同时，P.ostreatusBP3、S.commune DS1和Xylariaceae sp.XY处理的木质素(APL)可溶性固形物含量显著降低。根据成分分析，由于真菌对糖的消耗，所有真菌处理过的木质素(APL)中纤维素和半纤维素含量均有所降低(表1)，不同真菌处理过的木质素(APL)中组分的变化以及通过GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)测得芳香族化合物含量，进一步证实了该真菌对木质素(APL)的降解作用。并随之与胶原蛋白结合制备薄膜，实现抗菌性、抗氧化性和机械强度的同时提高。
表1相同固含量下改性前后碱处理木质素APL组分测定
图3是根据本发明中不同生物改性碱处理木质素经GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)测得芳香族化合物差异；为改性前后木质素(APL)中芳香族化合物经GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)测得丰度，由该图可知五种真菌改性木质素(APL)后的芳香族化合物丰度降低，说明含量变少，进一步可以验证真菌对于木质素的利用降解从而改性的能力。
图1是本发明的生产工艺流程图。本发明提供一种微生物改性碱处理木质素APL复合胶原蛋白膜的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将玉米秸秆使用碱预处理，离心去除沉淀，得到初始富含木质素复合物溶液，并进行121℃，20min灭菌；
(2)28℃，将五种食药用菌分别在灭菌后的初始富含木质素复合物溶液中培养培养一周，后离心去除沉淀，得到木质素(APL)溶液；
(3)将胶原蛋白在冷藏条件下加入蒸馏水使其溶胀，得胶原蛋白溶液，并将pH调至碱性；
(4)将步骤(2)的木质素(APL)溶液与步骤(3)的胶原蛋白溶液混合搅拌均匀，优选地加入甘油，持续搅拌均匀成混合液；
(5)将(4)中搅拌完的混合液置于37℃干燥箱，静置干燥，得到的微生物改性木质素APL/胶原蛋白复合薄膜。
一些实施例中，所述步骤(2)中使用的菌种为：刺孢小克银汉霉科Cunninghamellaechinulata FR3、灵芝菌科Ganoderma lucidum EN2、平菇菌科Pleurotus ostreatus BP3、裂褶菌科Schizophyllum commune DS1、炭角菌科Xylariaceae sp.XY。
一些实施例中，所述步骤(2)中菌种在初始富含木质素复合物溶液中培养时间为3-7天。
一些实施例中，所述步骤(3)中胶原蛋白溶胀浓度为0.01-0.1g/mL。
一些实施例中，所述步骤(3)中胶原蛋白溶胀条件为4℃静置溶胀12h-48h。
一些实施例中，所述步骤(4)中甘油的量为体系固含量的10-20％，其中固含量为薄膜中加入的胶原蛋白固体含量(mg)与碱处理木质素固形物含量(mg)。
一些实施例中，所述步骤(5)中烘干条件为37℃鼓风干燥箱。
本发明制备得到的微生物改性碱处理木质素APL复合胶原蛋白食品包装薄膜，所述薄膜的配方包括重量百分数20％-70％的胶原蛋白，20％-40％的APL，10％-20％的甘油。
以下为具体实施例
实施例1
(1)将菌种刺孢小克银汉霉科Cunninghamella echinulata FR3、灵芝菌科Ganoderma lucidum EN2、平菇菌科Pleurotus ostreatus BP3、裂褶菌科Schizophyllumcommune DS1、炭角菌科Xylariaceae sp.XY分别接入初始富含木质素复合物溶液的培养基中，恒温摇床培养7天后，离心去除沉淀，得到上清APL(碱处理木质素)溶液；其中固形物含量如图2中的B所示，未改性的APL溶液(AC):25.92mg/mL；FR3改性APL(AF)溶液：25.5mg/mL；BP3改性APL(AB)溶液：23.12mg/mL；EN2改性APL(AE)溶液：25.9mg/mL；DS1改性APL(AD)溶液：22.42mg/mL；XY改性APL(AX)溶液：20.15mg/mL。
(2)称取40g(6.5mg/mL)的胶原蛋白溶液，缓慢滴加1mL 1.5M的氢氧化钠溶液，低温搅拌1h。随后加入同样固含量不同体积的APL溶液，其中加入4mL AC溶液，4.07mL AF溶液，4.48mL AB溶液，4mL AE溶液，4.62mL AD溶液和5.15mL AX溶液，低温搅拌5min，然后加入12.31％固含量的甘油，低温搅拌5min，得到制备薄膜溶液。
(3)将制备薄膜溶液超声2min后静置2h除去气泡，随后倒入平板中，放入37℃恒温干燥箱中干燥24h，最终得到高抗菌性、高抗氧化性的APL/胶原蛋白复合薄膜。
在实施例1中，APL/胶原蛋白复合薄膜由重量百分数为64.04％的胶原蛋白，23.65％的APL，12.31％的甘油组成。如图2中的A所示，不同微生物改性后的APL中多糖的变化可以看出，五种真菌均能利用APL中的大分子量(大于200D)的糖与小分子量(小于200D)的多糖，其中XY对于多糖的利用最佳。同时，通过GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)对五种真菌改性后的APL(碱处理木质素)芳香类化合物进行表征，芳香类化合物经真菌改性后均降低，进一步说明这五种真菌对木质素的降解利用。
实施例2
(1)将菌种刺孢小克银汉霉科Cunninghamella echinulata FR3、灵芝菌科Ganoderma lucidum EN2、平菇菌科Pleurotus ostreatus BP3、裂褶菌科Schizophyllumcommune DS1、炭角菌科Xylariaceae sp.XY分别接入初始富含木质素复合物溶液的培养基中，恒温摇床培养7天后，离心去除沉淀，得到上清APL(碱处理木质素)溶液；其中固形物含量如图2中的B所示，未改性的APL溶液(AC):25.92mg/mL；FR3改性APL(AF)溶液：25.5mg/mL；BP3改性APL(AB)溶液：23.12mg/mL；EN2改性APL(AE)溶液：25.9mg/mL；DS1改性APL(AD)溶液：22.42mg/mL；XY改性APL(AX)溶液：20.15mg/mL。
(2)称取30g胶原蛋白溶液，缓慢滴加1mL 1M的氢氧化钠溶液，低温搅拌1h。随后加入同样固含量不同体积的APL(碱处理木质素)溶液，其中加入4mL AC溶液，4.07mL AF溶液，4.48mL AB溶液，4mL AE溶液，4.62mL AD溶液和5.15mL AX溶液，低温搅拌5min，然后加入14.66％固含量的甘油，低温搅拌5min，得到制备薄膜溶液。
(3)将制备薄膜溶液超声2min后静置2h除去气泡，随后倒入平板中，放入37℃恒温干燥箱中干燥24h，最终得到高抗菌性、高抗氧化性的APL/胶原蛋白复合薄膜。
在实施例2中，APL/胶原蛋白复合薄膜由重量百分数为57.18％的胶原蛋白，28.16％的APL，14.66％的甘油组成。并对制备的复合薄膜表面与截面进行SEM扫描电镜表征(如图4)，加入APL(碱处理木质素)后的复合薄膜表面形貌相对于纯胶原蛋白薄膜更均匀；比较截面变化，加入真菌改性后的木质素(APL)制备的复合薄膜，包括AF,AB,AE,AD与AF,截面更加紧密。说明。进而对复合薄膜的性能：抗菌性，抗氧化性与机械性能分别通过大肠杆菌抑制生长(图5)，ABTS自由基清除率(图6)与拉伸强度(TS),断裂伸长率(EAB)(图8)进行表征。从图5中观察大肠杆菌生长情况，纯菌液，胶原蛋白薄膜以及添加未改性APL的复合薄膜均为明显变化，其原因为胶原蛋白本身对大肠杆菌未存在抑制作用，同时未改性的木质素(APL)中含有大量的糖提供大肠杆菌生长能量；添加真菌改性后的木质素(APL)，对大肠杆菌均体现较明显的抑制作用，不仅是因为糖含量减少，还有真菌改性木质素暴露更多功能基团造成的。从图6中对ABTS自由基清除率的变化，明显看出相对于纯胶原蛋白薄膜的抗氧化性，添加未改性与改性APL(碱处理木质素)均有较高的抗氧化性，根据研究可知木质素本身具有较好的抗氧化性。最后，从图7中研究机械性能的变化，对比纯胶原蛋白薄膜的拉伸强度(TS)与断裂伸长率(EAB)，添加APL(其中包括未改性与真菌改性后)均相应提升。以上，这些结果表明，由于真菌发酵过程中APL(碱处理木质素)的组分和结构发生了变化，真菌修饰木质素(APL)会改变其对复合膜力学性能的影响，同时提高抗菌性能与抗氧化性。
实施例3
(1)将菌种刺孢小克银汉霉科Cunninghamella echinulata FR3、灵芝菌科Ganoderma lucidum EN2、平菇菌科Pleurotus ostreatus BP3、裂褶菌科Schizophyllumcommune DS1、炭角菌科Xylariaceae sp.XY分别接入初始富含木质素复合物溶液的培养基中，恒温摇床培养7天后，离心去除沉淀，得到上清APL(碱处理木质素)溶液；其中固形物含量如图2中的B所示，未改性的APL溶液(AC):25.92mg/mL；FR3改性APL(AF)溶液：25.5mg/mL；BP3改性APL(AB)溶液：23.12mg/mL；EN2改性APL(AE)溶液：25.9mg/mL；DS1改性APL(AD)溶液：22.42mg/mL；XY改性APL(AX)溶液：20.15mg/mL。
(2)称取20g胶原蛋白溶液，缓慢滴加1mL 0.5M的氢氧化钠溶液，低温搅拌1h。随后加入同样固含量不同体积的APL溶液，其中加入4mL AC溶液，4.07mL AF溶液，4.48mL AB溶液，4mL AE溶液，4.62mL AD溶液和5.15mL AX溶液，低温搅拌5min，然后加入13.61％固含量的甘油，低温搅拌5min，得到制备薄膜溶液。
(3)将制备薄膜溶液超声2min后静置2h除去气泡，随后倒入平板中，放入37℃恒温干燥箱中干燥24h，最终得到高抗菌性、高抗氧化性的APL/胶原蛋白复合薄膜。
在实施例3中，APL/胶原蛋白复合薄膜由重量百分数为49.69％的胶原蛋白，36.7％的APL(碱处理木质素)，13.61％的甘油组成。由图8薄膜展示图看出，添加APL(碱处理木质素)的复合薄膜呈半透明状，主要因为APL(碱处理木质素)中木质素本身的颜色作用。
本研究选用了5种常见的食药用真菌，对碱预处理得到的木质素(APL)进行生物改性。同时，食药用真菌通过发酵产生的活性物质，对薄膜抗菌抗氧化能力有潜在提升作用，有助于制备得到的复合薄膜在食品上的应用。研究了真菌改性前后木质素(APL)的总糖，可溶性固含量的变化，组成成分变化，包括木质素，纤维素，半纤维素以及小分子芳香类化合物的变化的研究分析，制得的生物改性APL-胶原复合膜，不仅表面均匀透明，同时复合薄膜力学性能、抗菌性能和抗氧化性能得到显著提升。本发明相比于改善胶原蛋白性能的传统方法，该方法操作简单，成本较低，产量可观，不会产生有毒有害的化学物质。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种微生物改性木质素复合胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生物质使用碱预处理，得到富含木质素复合物，并进行灭菌；
(2)向步骤(1)得到的灭菌后的富含木质素复合物溶液加入能够食药用的真菌进行培养，所述能够食药用的真菌用于使木质素降解，培养后去沉淀取上清液；所述能够食药用的真菌为刺孢小克银汉霉科、灵芝菌科、平菇菌科、裂褶菌科或炭角菌科；
(3)将胶原蛋白液调节pH至碱性，然后加入步骤(2)得到的上清液中，充分混匀，得到混合溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合溶液倒入平板中，然后干燥，即得到微生物改性木质素复合胶原蛋白薄膜。
2.如权利要求1所述的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，包括向混合溶液中加入甘油。
3.如权利要求2所述的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，所述甘油的质量为胶原蛋白的质量与上清液中固形物质量总和的10％-20％。
4.如权利要求1所述的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养的时间为3天-30天。
5.如权利要求1所述的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述胶原蛋白与上清液中固形物的质量比为(1-5):1。
6.如权利要求1所述的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于，所述木质素来源于秸秆、草或树木。
7.如权利要求1-6任意一项所述方法制备得到的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜。
8.如权利要求7所述的微生物改性木质素复合胶原蛋白膜用于食品包装膜的应用。
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