CN115850371A - 一种靶向dr5的多肽类pet显像剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向DR5的多肽类PET显像剂及其制备方法，属于PET显像剂制备技术领域。本发明制备得到的PET显像剂⁶⁸Ga‑DOTA‑NYM522具有体外稳定性好、水溶性强，体内血液清除快的优点，经实验证实在DR5阳性表达的KP4荷瘤鼠中摄取明显，肿瘤病灶部位显像对比度高，且肿瘤/正常组织摄取比值高，肿瘤分辨能力强，能够用于DR5阳性肿瘤的特异性显像，本发明制备方法简单易于操作，临床应用开发前景好。

Description

一种靶向DR5的多肽类PET显像剂及其制备方法

技术领域

本发明属于PET显像剂制备领域，具体涉及一种靶向DR5的多肽类PET显像剂及其制备方法。

背景技术

¹⁸F-FDG是PET/CT最常见的用于标记的正电子放射性核素，但其并非肿瘤特异性显像剂，因此在诊断过程中会出现假阴性和假阳性的情况。在肿瘤发展进程中，某些失调或突变的基因导致相关蛋白在肿瘤组织中异常表达，靶向这些异常受体的肿瘤成像也已成为肿瘤治疗和成像的主要趋势。因此，开发示踪和监测肿瘤靶标受体的抗体显像剂应运而生。然而抗体或者其片段，均存在分子量较大，在较短时间内难以得到较高的肿瘤/非肿瘤(T/NT)比值的问题。相比较抗体，多肽的分子量小血液清除快、组织穿透力强、T/NT比值高、无免疫原性，具有灵敏度高、特异性强和准确性好，且合成成本相对低廉，并可对其结构进行化学修饰，因此多肽作为小分子配体标记探针是分子核医学最为活跃的前沿研究领域之一，探索新的生物学标记物进行高质量显像在肿瘤早期诊断过程中至关重要。

TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)是继TNF、FasL之后的第三个TNF超家族的凋亡分子，主要通过与靶细胞表面的受体特异性结合而发挥作用。例如TRAIL可通过与死亡受体DR4(death receptor 4)和DR5(death receptor 5)结合而激活下游通路而诱导细胞的凋亡，且有研究表明TRAIL与DR5结合的亲和力高于其它膜表面的TRAIL受体，即在生理条件下，TRAIL更倾向于与DR5结合。DR5激活后可选择性诱导某些肿瘤细胞凋亡，对正常细胞无毒性。研究表明DR5高表达于多种肿瘤细胞中，而在正常细胞中低表达或不表达。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的PET显像剂中采用抗体或者抗体片段时均存在分子量较大，难以得到较高的肿瘤/正常组织摄取比值(T/NT)造成检测准确度差的问题，提供了一种靶向DR5的多肽类PET显像剂及其制备方法。

本发明采用如下技术方案是：

一种靶向DR5的多肽类PET显像剂，具有如下结构：⁶⁸Ga-DOTA-NYM522，以⁶⁸Ga标记多肽前体，所述多肽前体为DOTA-NYM522，所述多肽前体由双功能螯合剂DOTA与多肽NYM522偶联得到。

进一步的，所述多肽前体DOTA-NYM522的结构为

进一步的，所述多肽NYM522的序列为YCKVILTHRCY。

进一步的，所述多肽NYM522为D型氨基酸或L型氨基酸。

一种靶向DR5的多肽类PET显像剂的制备方法：

(1)取多肽前体DOTA-NYM522冻干粉溶解，加入缓冲溶液，连续晃动使其充分混合均匀；

(2)取⁶⁸Gacl₃溶液缓慢加入至多肽前体DOTA-NYM522中，加入缓冲液调节溶液pH值为4-4.5，于反应温度70～100℃下反应10～15min；

(3)反应结束后冷却至室温，加入抗坏血酸溶液，经纯化、过滤后得到⁶⁸Ga-DOTA-NYM522。

进一步的，所述⁶⁸Gacl₃溶液为采用⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器加入0.05M盐酸溶液或0.1M盐酸溶液制备得到。

进一步的，所述多肽前体DOTA-NYM522冻干粉使用二甲基亚砜试剂溶解。

一种靶向DR5的多肽类PET显像剂，加入辅料能够用于制备检测DR5表达水平的多肽类PET探针试剂盒，辅料包括但不限于醋酸/醋酸钠缓冲溶液、抗坏血酸钠和二甲亚砜。

本发明的优点具体如下：

(1)本发明利用DOTA作为放射化学标记中间体进行⁶⁸Ga标记，得到高纯度的PET显像剂⁶⁸Ga-DOTA-NYM522，该PET显像剂体外稳定性好、水溶性强，能够经肾脏代谢，体内清除快，在肌肉、骨骼、心脏、肺、肝脏等背景脏器和组织背景摄取低，适合用作PET显像剂，在DR5阳性表达的KP4荷瘤鼠中摄取明显，T/N比值能够达到14.85％，肿瘤摄取对比度好，能清晰分辨病灶部位，具有较好的DR5阳性肿瘤特异性显像应用前景。

(2)本发明制备⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的方法，步骤简单易于操作，标记结果直观准确。

附图说明

图1为实施例1的⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的放射性HPLC图谱。

图2为实施例1的⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的体外稳定性实验结果。

图3为实施例1的⁶⁸Ga-DOTA-NYM522在Balb/c小鼠体内的生物分布图。

图4为⁶⁸Ga-DOTA-NYM522和¹⁸F-FDG在KP4荷瘤鼠模型中的PET/CT显像图。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。

本发明实施例中使用的⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器外购于Isotopen Technologien München同位素生物技术公司。

⁶⁸Gacl₃溶液的制备：配制低金属杂质含量的高纯度的0.05M的HCl溶液，使用带有鲁尔螺纹接口的注射器吸取5ml的HCl溶液，将注射器接头接至⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器的进口管位置，出口管置于废液瓶中，推动注射器使得HCl溶液流经⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器内部并经出口管流出，弃初始1.5mL流出液将出口管至于核素接收瓶内，继续收集2mL，⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器内⁶⁸Ga核素被洗脱出来收集至接收瓶中，即得到⁶⁸Gacl₃溶液，其中放射性核纯度＞99.9％，其他杂质＜0.1％，pH＜2.0；

实施例1

⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的制备步骤如下：

(1)取40μg多肽前体DOTA-NYM522冻干粉，使用40μL的二甲基亚砜试剂溶解，再加入0.4mL醋酸或醋酸钠缓冲溶液至含有溶解多肽前体DOTA-NYM522的反应瓶中；

(2)取10mCi ⁶⁸Gacl₃溶液至反应瓶中，加入醋酸钠溶液调节溶液pH值至4.5，将反应瓶至于加热器内，100℃下反应12min；

(3)纯化：选Sep-Pak C-18柱进行纯化，依次使用10mL无水乙醇、20mL灭菌注射用水活化；将反应后的溶液使用注射器加入至C-18固相萃取小柱中，使用20mL灭菌注射用水冲洗后使用1.2mL 70％无水乙醇溶液淋洗C-18柱，得到目标产物⁶⁸Ga-DOTA-NYM522；

(4)过滤除菌：选0.22μm无菌滤膜进行过滤除菌，得到

⁶⁸Ga-DOTA-NYM522。

⁶⁸Ga-DOTA-NYM522放射性HPLC图谱如图1所示，产品的放射性化学纯度>95％，该产物放射性化学收率为60％。合成所需总时间为22min，以每次投入68Ga核素活度计算未经衰变校准产率为75±2％(n＝10)。

实施例2

⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的制备步骤如下：

(1)取40μg多肽前体DOTA-NYM522冻干粉，使用40μL的二甲基亚砜试剂溶解，再加入0.4mL醋酸或醋酸钠缓冲溶液至含有溶解多肽前体DOTA-NYM522的反应瓶中；

(2)取20mCi ⁶⁸Gacl₃溶液至反应瓶中，加入2mol/L醋酸钠溶液调节溶液pH值至4，将反应瓶至于加热器内，在70℃条件下反应15min；

(3)纯化：选Sep-Pak C-18柱进行纯化，依次使用10mL无水乙醇、20mL灭菌注射用水活化；将反应后的溶液使用注射器加入至C-18固相萃取小柱中，使用20mL灭菌注射用水冲洗后使用1.2mL 70％无水乙醇溶液淋洗C-18柱，得到目标产物⁶⁸Ga-DOTA-NYM522；

(4)过滤除菌：选0.22μm无菌滤膜进行过滤除菌，得到⁶⁸Ga-DOTA-NYM522。

合成所需总时间为22min，以每次投入⁶⁸Ga核素活度计算未经衰变校准产率为75±2％(n＝10)。

实施例3

1、⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的体外稳定性测试：

对⁶⁸Ga-DOTA-NYM522在PBS缓冲液和小鼠血清中的稳定性进行测试。

取2mLpH为7.4的PBS缓冲液与50μCi ⁶⁸Ga-DOTA-NYM522充分混合，在孵箱中37℃孵育2h，取少量溶液，通过HPLC检测显像剂的稳定性，以上实验重复3次。

Babl/c小鼠摘眼取血1.5mL离心取上层血清，加入100μCi

⁶⁸Ga-DOTA-NYM522充分混合，在孵箱中37℃孵育2h，用高速离心机在转速12000转/分下离心5min，取上清液进行HPLC分析显像剂的体外稳定性，以上实验重复3次。

测试结果如图2所示。由图2可知：⁶⁸Ga-DOTA-NYM522在PBS缓冲液和小鼠血清中100％以原型稳定存在，这表明⁶⁸Ga-DOTA-NYM522具有较好的体外稳定性。

2、⁶⁸Ga-DOTA-522的脂水分配系数测定：

脂水分配系数(Log P)是化合物的一项基本物理化学性质，尤其是药物化学中非常重要的研究参数，是一个影响药物在体内的吸收、分布、代谢和消除的重要因素。

取实施例1制备的50μCi ⁶⁸Ga-DOTA-NYM522装于有1mL正辛醇与1mL水的2.5mL离心管中，密闭置于干式恒温器中常温震荡10min后，离心使两相分层(4000r，5min)，用移液器从两相中分别各取500μL置于γ计数管中，用γ计数器测定计数，并根据计算公式Log P＝Log(counts in n-octyl alcohol/counts in water)计算Log P值。重新补加500μL正辛醇和500μL水，重复上述过程至连续三次Log P值相接近。

测定得到⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的脂水分配系数log P为-3.138±0.019，这表明⁶⁸Ga-DOTA-NYM522为水溶性物质，具有较好的亲水特性，在体内清除快，适用于PET显像研究应用。

3、⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的体内分布测试实验

取3只正常Balb/c小鼠分别经尾静脉注射30μCi的⁶⁸Ga-DOTA-NYM522，正常饲养摄取正常饲养摄取2h，处死小鼠，取血及脑、心、肺、肝脏、肾脏等主要脏器与组织称重并进行γ计数，研究

⁶⁸Ga-DOTA-NYM522在小鼠体内的生物分布情况。

实施例1的⁶⁸Ga-DOTA-NYM522在Balb/c小鼠体内的生物分布如图3所示，由图3结果可知，⁶⁸Ga-DOTA-NYM522主要经肾脏代谢，血液清除速度快，骨中放射性不高。表明⁶⁸Ga-DOTA-NYM522经肾脏代谢，体内清除快，肌肉、骨骼、心脏、肺、肝脏等背景脏器和组织背景摄取低，适合用作PET显像剂。

4、荷瘤鼠⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的Micro PET/CT显像测试：

取DR5阳性表达人胰腺癌KP4细胞以5×10⁶/只的密度进行裸鼠皮下接种，待肿瘤直径生长至5～10mm时，进行显像剂⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的Micro PET/CT显像研究，并以同一只模型鼠同一时间的¹⁸F-FDG PET/CT显像效果为对照。

实施例1的⁶⁸Ga-DOTA-NYM522在KP4荷瘤鼠模型中的PET/CT显像图如图4所示，由图4可知，¹⁸F-FDG也同样能对肿瘤进行显像，但其在心脏、肝、脾、肾、膀胱等器官中也有聚集；⁶⁸Ga-DOTA-NYM522仅聚集在肿瘤部位，肿瘤部位的摄取量明显高于肌肉、骨骼、肺、脑等器脏或组织，且其主要聚集在肿瘤以及代谢器官肾脏和膀胱中，在心脏和肝脾中几乎没有摄取。此外，¹⁸F-FDG的T/N值(肿瘤/肌肉比值)为8.86±1.23，⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的T/N值(肿瘤/肌肉比值)为13.21±1.64，由此可知⁶⁸Ga-DOTA-NYM522的T/N值显著优于传统PET/CT显像剂¹⁸F-FDG。以上结果表明⁶⁸Ga-DOTA-NYM522能靶向特异性摄取于肿瘤部位，肿瘤摄取对比度好，能清晰分辨病灶部位，⁶⁸Ga-DOTA-NYM522具有较好的DR5阳性肿瘤特异性显像应用前景。

Claims (9)

1.一种靶向DR5的多肽类PET显像剂，其特征在于：具有如下结构：⁶⁸Ga-DOTA-NYM522，以⁶⁸Ga标记多肽前体，所述多肽前体为DOTA-NYM522，所述多肽前体由双功能螯合剂DOTA与多肽NYM522偶联得到。

2.如权利要求1所述的靶向DR5的多肽类PET显像剂，其特征在于：所述多肽前体DOTA-NYM522的结构为

3.如权利要求1所述的靶向DR5的多肽类PET显像剂，其特征在于：所述多肽NYM522的序列为YCKVILTHRCY。

4.如权利要求3所述的靶向DR5的多肽类PET显像剂，其特征在于：所述多肽NYM522为D型氨基酸或L型氨基酸。

5.一种靶向DR5的多肽类PET显像剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤

(1)取多肽前体DOTA-NYM522冻干粉完全溶解，加入缓冲溶液，连续晃动使其充分混合均匀；

(2)取⁶⁸Gacl₃溶液缓慢加入至多肽前体DOTA-NYM522中，加入缓冲液调节溶液pH值为4-4.5，于70～100℃下反应10～15min；

(3)反应结束后冷却至室温，加入抗坏血酸溶液，经纯化、过滤后得到⁶⁸Ga-DOTA-NYM522。

6.根据权利要求5所述的靶向DR5的多肽类PET显像剂的制备方法，其特征在于：所述⁶⁸Gacl₃溶液为在⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器中加入0.05M盐酸溶液或0.1M盐酸溶液制备得到。

7.根据权利要求5所述的靶向DR5的多肽类PET显像剂的制备方法，其特征在于：所述多肽前体DOTA-NYM522冻干粉使用二甲基亚砜试剂完全溶解。

8.根据权利要求5所述的靶向DR5的多肽类PET显像剂的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为醋酸溶液或醋酸钠溶液。

9.根据权利要求1所述的靶向DR5的多肽类PET显像剂，其特征在于：所述⁶⁸Ga-DOTA-NYM522能够用于制备检测DR5表达水平的多肽类PET探针试剂盒。

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