CN115845000A - 七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用,其中所述过敏性哮喘是体内TGF‑β1和IL‑17升高所致，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，由以下中药原料药制备而成：冬青叶、丹参，北沙参、沙棘、甘草、苦杏仁，天竺黄。

Description

七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及本发明属于医药领域，涉及七味冬青叶颗粒剂在治疗TGF-β1和IL-17升高所致过敏性哮喘中的应用，有且不限于过敏性哮喘等。

背景技术

哮喘是全球性广泛的慢性疾病之一，给患者的心理上和经济上都带来了沉重的负担，已是社会健康问题的存在。目前，全球约3亿的哮喘病患者，其发病率约为5-20％，我国哮喘发病率约2-4％，其中儿童的发病率比成年人发病率高。近些年研究统计，全球哮喘总发病率和死亡率呈升高趋势，其中儿童和成人哮喘的发病率和死亡率持续增加。哮喘的发病受多重因素的影响，个体差异，环境因素，遗传病史，心理因素，年龄，肥胖，饮食等。随着社会进步，经济高速发展，环境污染也愈发严重，空气质量与哮喘发病率息息相关。研究数据统计，城市发病率高于农村发病率，专家预测到2025年城市的发病率将升高到59％。生活节奏的高频率以及工作上的压力使当代社会产生了许多负面心理，越来越多研究证实焦虑，抑郁等负面心理问题与心脏病，肺部疾病，糖尿病以及哮喘存在密切的关联。其中哮喘患者中产生这类负面情绪尤为普遍，焦虑抑郁也是哮喘发病的危险因素之一，它们之间存在双向的关系。哮喘发病与年龄也息息相关，儿童时期的发病率要高于成年后，因此哮喘也是儿童主要的慢性疾病，对儿童的健康和生长带来极大的影响。已有相关研究证实，肥胖也与哮喘发病相关，肥胖可促使哮喘严重程度增加，同时也会影响β2激动剂、糖皮质激素等治疗药物的吸收，降低药物作用。哮喘较高的发病情况以及其严重性不仅降低人们的生活质量也影响了社会经济的发展。支气管哮喘如果不能有效控制，长期发作将促发严重并发症，逐渐发展成慢性支气管炎、肺源性心脏病等，使治疗的途径更加复杂艰难。因此，明确其发病的机制，寻找有效的治疗办法以及开发有效的药物对哮喘的防治有着非常重要的现实意义和较高的经济价值。

哮喘是受遗传和环境影响的多基因相关的疾病，遗传率占70％-80％。研究发现约161个基因与哮喘发病相关联，并且有16种基因得到验证(IL4、IL13、CD14、ADAM33、HLA-DRB1、ORMDL3、TNF、IL17F等)。其中基因ORMDL3与哮喘有较强关联性，并且参与儿童易感性哮喘，基因YKL-40与哮喘的发作及反应的恶化相关。随着基因组学的研究发展，转录组学也越来越受关注，RNA的转录也参与哮喘的调控。Williams等人发现mi R-26a、mi R-92和miR-30家族等micro RNA在哮喘患者中高表达。随着基因与哮喘关系研究的不断进步，越来越多的新靶点为哮喘的研究提供条件。

鉴于TGF-β1和IL-17升高，对过敏性哮喘具有重要的影响，我们制造了TGF-β1和IL-17升高的动物模型，并且大量筛选了中药复方。发现七味冬青叶颗粒剂可以抑制TGF-β1和IL-17升高所致的过敏性哮喘。七味冬青叶颗粒剂是一种蒙药复方，为内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室配制，其原料药成分为冬青叶60份、丹参40份，北沙参40份、沙棘20份、甘草20份、苦杏仁20份，天竺黄10份的七味药材组成，其最佳比例为6:4:4:2:2:2:1。

发明内容

本发明提供七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用，其中，所述过敏性哮喘是由TGF-β1升高所导致。

本发明提供七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用，其中，所述过敏性哮喘是由IL-17升高所导致。

本发明提供七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用，其中，所述过敏性哮喘是由TGF-β1升高和IL-17升高所导致。

本发明所述的应用，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，由以下中药原料药制备而成：冬青叶、丹参，北沙参、沙棘、甘草、苦杏仁，天竺黄。

本发明所述的应用，优选的，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，由以下重量比例的中药原料药制备而成：冬青叶50-70份、丹参30-50份，北沙参30-50份、沙棘10-30份、甘草10-30份、苦杏仁10-30份，天竺黄5-15份。

本发明所述的应用，最优选的，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，由以下重量比例的中药原料药制备而成：冬青叶60份、丹参40份，北沙参40份、沙棘20份、甘草20份、苦杏仁20份，天竺黄10份。

本发明所述的应用，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，制备方法如下：

(1)加入各原料质量之和的5～20倍的50～100％的乙醇提取1～4次，每次1-3h，合并提取液。

(2)将上步得到的提取液进行减压浓缩，浓缩至30℃时相对密度为1.10～1.30，然后干燥得到干粉。

(3)将步骤(2)制备的干粉与糊精、微晶纤维素混合后加入0.5％阿斯巴甜，然后以体积分数为70-80％乙醇为润湿剂制备成软材，过筛制粒，置于60-70℃烘箱中干燥1～2h，控制环境湿度60％以下，整粒，即得到一种预防和治疗治疗过敏性哮喘的颗粒剂成品。

本发明首次揭示：七味冬青叶颗粒剂可以抑制TGF-β1和IL-17表达，从而可以治疗相关疾病，如：过敏性哮喘。该发现在国内外未见报道，其成果对开发TGF-β1和IL-17升高引起的疾病治疗药物具有重大的现实意义。

附图说明

图1OVA雾化激发时小鼠的行为状态。(a)挠鼻的时间；(b)腹部呼吸时间；#,P<0.05,##,P<0.01，与正常组对比；*,P<0.05,**,P<0.01，与模型组对比(values are mean±SD.,n＝8)。

图2各组小鼠BALF中细胞瑞氏-姬姆萨染色。A：正常组；B：模型组(OVA)；C：低剂量组(200mg/kg)；D：中剂量组(400mg/kg)；E：高剂量组(800mg/kg)；F：阳性组(2mg/kg)。黑色箭头：淋巴细胞；蓝色箭头：单核细胞；红色箭头：嗜中性粒细胞。

图3七味冬青叶颗粒剂对OVA诱发的哮喘小鼠IL-17的影响。(a)IL-17在BALF中的表达；(b)IL-17在肺组织中的表达；#,P<0.05,##,P<0.01，与正常组对比；*,P<0.05,**,P<0.01，与模型组对比(values are mean±SD.,n＝6)。

图4小鼠肺组织和气管的免疫组化检测。(A)各组免疫组化病理形态比较；(B)七味冬青叶颗粒剂对OVA诱发的哮喘小鼠肺组织和气管中TGF-β1表达的影响。#,P<0.05,##,P<0.01，与正常组对比；*,P<0.05,**,P<0.01，与模型组对比(values are mean±SD.,n＝3)。

具体实施方式

下面仅以实施例的方式结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1TGF-β1和IL-17升高所致过敏性哮喘小鼠模型制备

将84只雌性BALB/c小鼠随机分为六组，每组14只，分别为正常组，OVA组(OVA诱发的哮喘模型组，5mg/kg)，OVA-DQS(L)组(七味冬青叶颗粒剂低剂量组，200mg/kg)，OVA-DQS(M)组(七味冬青叶颗粒剂中剂量组，400mg/kg)，OVA-DQS(H)组(七味冬青叶颗粒剂高剂量组，800mg/kg)和OVA-DXMS组(地塞米松阳性对照组，2mg/kg)。建立了OVA诱导的哮喘小鼠模型和治疗方案，在第1天和第14天通过腹腔注射OVA(0.5mg/mL，200mL生理盐水以及100mgOVA和2mg氢氧化铝)引起小鼠致敏，正常组小鼠注射生理盐水。致敏后，在第27至34天，使用超声雾化器对小鼠进行1％OVA(OVA500mg溶于50mL生理盐水，现用现配。)的雾化激发刺激小鼠气道，每天持续30分钟。同时，在雾化激发的过程中观察小鼠的行为状态，是否出现呼吸急促，频繁挠鼻，腹肌抽搐，四肢无力等哮喘发作时的症状，并且记录上述症状首次出现的时间点，正常组的小鼠采用100mL生理盐水进行雾化激发。实验过程中，从21天至第34天，每天给OVA-DQS(L，M，H)组的小鼠不同浓度七味冬青叶颗粒剂进行灌胃给药治疗，DXMS组进行腹腔注射地塞米松(2mg/kg)进行治疗，正常组和OVA组给予生理盐水灌胃。在第35天，对动物实施安乐死，采集相关样品。

末次OVA激发后24h，水合氯醛(100μL/10g)麻醉小鼠，摘眼球取血，收集血样本置于4℃，5000rpm转速离心10min，取上清液，-80℃储存备。随后将小鼠固定在解剖板上，用9％生理盐水提取支气管肺泡灌洗液(BALF)进行检测，将小鼠颈部剪开一个小切口，避免剪到劲动脉，剥离支气管上的结缔组织，采用钝化后的注射器针头插入小鼠气管中，手术线绳进行固定，用1mL生理盐水进行肺泡灌洗，注入30s后回收BALF，连续注入三次进行灌洗，回收率约70％-80％，收集BALF于EP管中，4℃低温条件下3000r/min离心10min后取下层沉淀物进行细胞计数，收集上清液置于-20℃保存，待测细胞因子TGF-β1和IL-17水平，离心沉淀物进行细胞分类计数和瑞氏-姬姆萨染色。

取出肺组织及气管，将其用生理盐水洗净进行称重记录。取右下叶肺和部分气管以3倍体积的4％多聚甲醛固定24小时后，包埋在石蜡中进行组织学分析。取100mg肺组织，制备成10％的组织匀浆液，4℃下3500rpm/10min离心，取上清适用于氧化指标的试剂盒检测。剩余组织样本置于-80℃储存，用于蛋白印迹实验检测。

雾化过程中小鼠首次发生阳性反应的时间测定：

1％ OVA雾化激发30min时，正常组(生理盐水雾化)无明显变化。OVA模型组在3-6min出现频繁挠鼻、口唇紫绀、烦躁不安，10-15min内开始呼吸急促、腹肌抽搐、腹式呼吸。OVA-DQS(L)剂量组出现上述症状时间段为8-10min，15-20min，OVA-DQS(M)、OVA-DQS(H)和OVA-DXMS组出现上述症状时间段为10-20min，18-25min。

BALF细胞分类计数及染色

为了进一步研究七味冬青叶颗粒剂对气道炎症的影响，检测了BALF中的总细胞数和各种炎症细胞数，与正常组相比，OVA模型组的总细胞，嗜中性粒细胞，淋巴细胞和巨噬细胞数量明显增加(P<0.01)。与OVA组相比，OVA-DQS组中的这些细胞数量明显减少了，这与OVA-DXMS组的结果也相似(P<0.05或P<0.01)。

实施例2七味冬青叶颗粒剂对OVA诱导哮喘小鼠血清和BALF中IL-17细胞因子的影响

检测BALF和肺匀浆中IL-17细胞因子的表达水平，以探讨七味冬青叶颗粒剂对哮喘炎性介质的影响。与正常组相比，OVA诱导哮喘模型的IL-17细胞因子在BALF和肺匀浆中的表达明显增加(P<0.05)；与OVA模型组相比，OVA-DQS剂量组和OVA-DXMS组中IL-17的表达水平显著降低(P<0.05)，并且呈明显的剂量依赖性。这表明七味冬青叶颗粒剂可以抑制OVA诱发的哮喘小鼠的BALF和肺组织中IL-17的表达。

实施例3免疫组化检测OVA诱导哮喘小鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达的水平

TGF-β1的阳性表达均在胞浆，其阳性表现为细胞质呈黄褐色。通过Image proplus软件定量分析，可以发现与正常组相比较，TGF-β1蛋白的表达量在OVA模型组均显著增加(P<0.01)；与OVA模型组相比，OVA-DQS剂量组和OVA-DXMS组均可显著降低TGF-β1的表达水平。结果提示，七味冬青叶颗粒剂具有抗炎活性且对治疗哮喘炎症发挥重要作用。

Claims (7)

1.七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用，其中，所述过敏性哮喘是由TGF-β1升高所导致。

2.七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用，其中，所述过敏性哮喘是由IL-17升高所导致。

3.七味冬青叶颗粒剂在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用，其中，所述过敏性哮喘是由TGF-β1升高和IL-17升高所导致。

4.根据权利要求1，2，3任意一项权利要求所述的应用，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，由以下中药原料药制备而成：冬青叶、丹参，北沙参、沙棘、甘草、苦杏仁，天竺黄。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，由以下重量比例的中药原料药制备而成：冬青叶50-70份、丹参30-50份，北沙参30-50份、沙棘10-30份、甘草10-30份、苦杏仁10-30份，天竺黄5-15份。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，由以下重量比例的中药原料药制备而成：冬青叶60份、丹参40份，北沙参40份、沙棘20份、甘草20份、苦杏仁20份，天竺黄10份。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述七味冬青叶颗粒剂，制备方法如下：

(1)加入各原料质量之和的5～20倍的50～100％的乙醇提取1～4次，每次1-3h，合并提取液。

(2)将上步得到的提取液进行减压浓缩，浓缩至30℃时相对密度为1.10～1.30，然后干燥得到干粉。

(3)将步骤(2)制备的干粉与糊精、微晶纤维素混合后加入0.5％阿斯巴甜，然后以体积分数为70-80％乙醇为润湿剂制备成软材，过筛制粒，置于60-70℃烘箱中干燥1～2h，控制环境湿度60％以下，整粒，即得到一种预防和治疗治疗过敏性哮喘的颗粒剂成品。

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