CN115838811A - 一种鉴定德国小蠊所食蚤蝇种类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定德国小蠊所食蚤蝇种类的方法，该方法包括以下步骤：采集现场德国小蠊的完整肠道并提取全部DNA，所得全部DNA为待鉴定样品；采集现场不同蚤蝇的DNA并设计特异性引物；将所述蛆症异蚤蝇的特异性引物、东亚异蚤蝇的特异性引物和通用引物分别对待鉴定样品进行PCR扩增；对扩增后的产物用一定质量浓度的琼脂糖凝胶进行电泳；若有对应的蚤蝇DNA片段条带，则待鉴定样品中有对应的蚤蝇。本发明应用于环境相对密闭的死亡现场，判断现场提取到的德国小蠊是否取食的尸体上的蛆症异蚤蝇和东亚异蚤蝇，本发明通过设计这两种蚤蝇的特异性引物，只需经过电泳，判断对应条带的有无即可进行判断，具有操作简便、节约时间的优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测及法医鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定德国小蠊所食蚤蝇种类的方法。
背景技术
利用法医昆虫学证据进行最短死亡时间推断时，第一步就是对嗜尸性蝇类进行准确的种类鉴定。在相对密闭环境中，能够到访的嗜尸性蝇类种类会受到限制，体积较小的蚤蝇则具有较大优势，尤其是蛆症异蚤蝇和东亚异蚤蝇，它们会通过门窗缝隙及下水道进入室内并入侵尸体。同时，作为居室中常见的昆虫，蟑螂的到访(尤其是德国小蠊)可能会对尸体上的蚤蝇种类，甚至是具有重要法医学意义的老龄蝇类造成影响。因此需要判断案件现场的德国小蠊是否取食尸体上的蚤蝇，以及蚤蝇的种类是什么，以进一步全面利用相关嗜尸性蝇类的生长发育数据进行最短死亡时间推断。
但是关于嗜尸性蝇类种类鉴定的方法中，传统的形态学方法对鉴定人员要求较高，需要具备丰富的形态学鉴定知识，大多数法医工作人员难以满足。尤其是蛆症异蚤蝇和东亚异蚤蝇的幼虫、蛹的形态很像，普通法医工作者难以辨认。利用嗜尸性蝇类COI序列的通用引物进行种类鉴定，很好的解决了对形态学知识储备不足的缺点，普适性高，但是需要通过测序，之后对测序结果进行比对，增加了时间和金钱成本。而且在上述环境的特殊案件中，通用引物并不能满足需求，无法对德国小蠊是否取食这两种蚤蝇进行区分。
发明内容
鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种鉴定德国小蠊所食蚤蝇种类的方法，本发明应用于环境相对密闭的死亡现场，判断现场提取到的德国小蠊是否取食的尸体上的蛆症异蚤蝇和东亚异蚤蝇。本发明通过设计这两种蚤蝇的特异性引物，只需经过电泳，判断对应条带的有无即可进行判断，具有操作简便、节约时间的优势。
为了达到上述目的，本发明提供一种鉴定德国小蠊所取食蚤蝇种类的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采集现场德国小蠊的完整肠道并提取全部DNA，所得全部DNA为待鉴定样品；
步骤2：采集现场不同蚤蝇的DNA并设计特异性引物；
其中，所述特异性引物包括蛆症异蚤蝇的特异性引物和东亚异蚤蝇的特异性引物；所述蛆症异蚤蝇的特异性引物序列为：
F：5'-ACCCCGGTGCTTTAATTGGT-3'；
R：5'-ATTGGATCTCCCCCTCCTGC-3'；
所述东亚异蚤蝇的特异性引物序列为：
F：5'-TTTTGGTGCTTGAGCTGGGA-3'；
R：5'-GCTCCAGCTAATACAGGAAGAGA-3'；
步骤3：将所述蛆症异蚤蝇的特异性引物、东亚异蚤蝇的特异性引物和通用引物分别对待鉴定样品进行PCR扩增；
其中，所述通用引物的引物序列为：
F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
R：5'-RAAACTTCAGGRTGACCAAAGAATCA-3'；
步骤4：对扩增后的产物用一定质量浓度的琼脂糖凝胶进行电泳；若有对应的蚤蝇DNA片段条带，则待鉴定样品中有对应的蚤蝇。
依照本发明的一个方面，所述步骤1和步骤2中，所述DNA的提取具体采用的试剂盒为SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒。
依照本发明的一个方面，所述步骤3中，所述PCR扩增的体系为：2×TSINGKEMasterMix(Blue)12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，无酶水补足25μL。
依照本发明的一个方面，所述步骤3中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性1min；94℃1min，45℃1.5min，72℃1.5min，共5个循环；94℃1min，50℃1.5min，72℃1min，共35个循环；72℃延伸8min。
依照本发明的一个方面，所述步骤4中，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为1％。
依照本发明的一个方面，所述步骤4中，所述电泳条件为：100V、25min，TS-GelRed核酸凝胶染色、TAE缓冲液。
本发明的有益效果：
本发明主要应用于相对封闭的死亡现场，判断现场提取到的德国小蠊是否取食尸体上的蚤蝇。本发明利用蛆症异蚤蝇和东亚异蚤蝇已经发布的CO1序列，设计特异性引物，并通过电泳验证其特异性，及是否在在德国小蠊中扩增，从而筛选出各自特异性引物。本发明提取检案中德国小蠊肠道内容物，利用筛选出的蛆症异蚤蝇和东亚异蚤蝇的特异性引物以及通用引物进行PCR扩增，后进行电泳，检验有无条带出现。若对应引物的泳道有条带出现，则说明德国小蠊肠道内容物中有该种蚤蝇，进而说明德国小蠊是否取食蚤蝇以及蚤蝇的种类。
附图说明
图1为本发明实施例1中分别利用蛆症异蚤蝇、东亚异蚤蝇的特异性引物和通用引物分别对样品进行PCR扩增后的电泳结果对比图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，下文所用专业术语和本领域专业技术人员所理解的含义一致；除非特殊说明，本文所涉及的原料、试剂均可从市场购买，或通过公知的方法制得。
本发明实施例中，本发明提及到的提取DNA的方法按照DNA提取试剂盒的说明书进行。提取DNA采用的试剂盒为SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，2×TSINGKEMasterMix(Blue)、TS-GelRed核酸凝胶染料购自北京擎科新业生物技术有限公司。
实施例1
一种鉴定德国小蠊所取食蚤蝇种类的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采集现场德国小蠊的完整肠道并提取全部DNA，所得全部DNA为待鉴定样品，并设置第1对照组；
具体步骤为：提取从相对封闭环境的现场采集两只德国小蠊的肠道完整取出，并用SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒提取肠道内所有的DNA，分别标记为B.germanicaGut1和B.germanicaGut2，分别作为第1实验组和第2实验组；任意取一只德国小蠊的腿部剪碎，并用SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒提取所有的DNA，作为第1对照组，标记为B.germanicaCtrl。
步骤2：采集现场不同蚤蝇的DNA并设计特异性引物，并设置第2对照组和第3对照组；
具体步骤为：取适量蛆症异蚤蝇组织，并用SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒提取所有的DNA，标记为M.scalaris，作为第2对照组；取适量东亚异蚤蝇组织，并用SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒提取所有的DNA，标记为M.spiracularis，作为第3对照组；利用蛆症异蚤蝇和东亚异蚤蝇已经发布的CO1序列，设计以下特异性引物：
其中，所述特异性引物包括蛆症异蚤蝇的特异性引物和东亚异蚤蝇的特异性引物；所述蛆症异蚤蝇的特异性引物(简称：QP1)序列为：
F：5'-ACCCCGGTGCTTTAATTGGT-3'，如SEQ ID NO.1所示；
R：5'-ATTGGATCTCCCCCTCCTGC-3'，如SEQ ID NO.2所示；
所述东亚异蚤蝇的特异性引物(简称：DP1)序列为：
F：5'-TTTTGGTGCTTGAGCTGGGA-3'，如SEQ ID NO.3所示；
R：5'-GCTCCAGCTAATACAGGAAGAGA-3'，如SEQ ID NO.4所示；
步骤3：将所述蛆症异蚤蝇的特异性引物、东亚异蚤蝇的特异性引物和通用引物分别对第1-2实验组和第1-3对照组进行PCR扩增；
其中，所述通用引物的引物(简称：barcode658)序列为：
F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，如SEQ ID NO.5所示；
R：5'-RAAACTTCAGGRTGACCAAAGAATCA-3'，如SEQ ID NO.6所示；
PCR扩增体系为：2×TSINGKEMasterMix(Blue)12.5μL，上、下游引物各1μL(浓度为10μM)，DNA模板2μL(<1μg)，无酶水补足25μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性1min；94℃1min，45℃1.5min，72℃1.5min，共5个循环；94℃1min，50℃1.5min，72℃1min，共35个循环；72℃延伸8min。
步骤4：对扩增后的产物用质量浓度1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后置于凝胶成像系统拍照分析，其结果如图1所示。
电泳条件为：100V、25min，TS-GelRed核酸凝胶染色、TAE缓冲液。
电泳检测结果及分析：
如图1所示，第1对照组B.germanicaCtrl的结果为(-)(-)(+)，说明引物QP1和DP1在德国小蠊中不扩增；第2对照组M.scalaris的的结果为(+)(-)(+)，说明引物QP1只在蛆症异蚤蝇中扩增，引物DP1在蛆症异蚤蝇中不扩增，且扩增片段略短于通用引物barcode658的扩增片段；第3对照组M.spiracularis的结果为(-)(+)(+)，说明引物DP1只在东亚异蚤蝇中扩增，引物QP1在东亚异蚤蝇中不扩增，且扩增片段略短于通用引物barcode658的扩增片段。因此，上述3个对照组的扩增结果说明了引物QP1和DP1具有特异性。第1实验组B.germanicaGut1和第2实验组B.germanicaGut2的结果均为(+)(+)(+)，表明该案件现场提取的德国小蠊的肠道内容物中检测到了东亚异蚤蝇和蛆症异蚤蝇的DNA，认为案件现场的德国小蠊取食了蛆症异蚤蝇和东亚异蚤蝇。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种鉴定德国小蠊所取食蚤蝇种类的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采集现场德国小蠊的完整肠道并提取全部DNA，所得全部DNA为待鉴定样品；
步骤2：采集现场不同蚤蝇的DNA并设计特异性引物；
其中，所述特异性引物包括蛆症异蚤蝇的特异性引物和东亚异蚤蝇的特异性引物；所述蛆症异蚤蝇的特异性引物序列为：
F：5'-ACCCCGGTGCTTTAATTGGT-3'；
R：5'-ATTGGATCTCCCCCTCCTGC-3'；
所述东亚异蚤蝇的特异性引物序列为：
F：5'-TTTTGGTGCTTGAGCTGGGA-3'；
R：5'-GCTCCAGCTAATACAGGAAGAGA-3'；
步骤3：将所述蛆症异蚤蝇的特异性引物、东亚异蚤蝇的特异性引物和通用引物分别对待鉴定样品进行PCR扩增；
其中，所述通用引物的引物序列为：
F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
R：5'-RAAACTTCAGGRTGACCAAAGAATCA-3'；
步骤4：对扩增后的产物用一定质量浓度的琼脂糖凝胶进行电泳；若有对应的蚤蝇DNA片段条带，则待鉴定样品中有对应的蚤蝇。
2.根据权利要求1所述的鉴定德国小蠊所取食蚤蝇种类的方法，其特征在于，所述步骤1和步骤2中，所述DNA的提取具体采用的试剂盒为SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒。
3.根据权利要求2所述的鉴定德国小蠊所取食蚤蝇种类的方法，其特征在于，所述步骤3中，所述PCR扩增的体系为：2×TSINGKE Master Mix(Blue)12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，无酶水补足25μL。
4.根据权利要求1所述的鉴定德国小蠊所取食蚤蝇种类的方法，其特征在于，所述步骤3中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性1min；94℃1min，45℃1.5min，72℃1.5min，共5个循环；94℃1min，50℃1.5min，72℃1min，共35个循环；72℃延伸8min。
5.根据权利要求1所述的鉴定德国小蠊所取食蚤蝇种类的方法，其特征在于，所述步骤4中，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为1％。
6.根据权利要求1所述的鉴定德国小蠊所取食蚤蝇种类的方法，其特征在于，所述步骤4中，所述电泳条件为：100V、25min，TS-GelRed核酸凝胶染色、TAE缓冲液。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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