CN115820594A - 一种病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物酶技术领域，具体涉及病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法及其用途。一种病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法，包括：对病毒来源的几丁质合成酶基因序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列；将优化后的基因序列全基因合成至表达载体上；含有表达载体的宿主经培养、诱导、裂解和离心，获得含病毒来源的几丁质合成酶的膜组分。本发明提供了一种病毒来源的几丁质合成酶的纯化方法，利用大肠杆菌异源表达与类生物膜体系分离纯化的策略，通过该策略可以获得高纯度的病毒来源的几丁质合成酶。并提供了一种合成低聚几丁寡糖的新方法，且反应体系组成简单，产物易于分离纯化。

Description

一种病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法及其用途

技术领域

本发明属于生物酶技术领域，具体涉及病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法及其用途。

背景技术

几丁寡糖（chitin oligosaccharides）是由2-20个N-乙酰葡萄糖胺（NAG）通过β-（1，4）糖苷键连接而成的低聚物，其溶解度随聚合度的降低而提高。低聚合度，尤其是聚合度小于等于六的几丁寡糖，由于分子量较小、溶解度更高，因此更容易被吸收利用，广泛应用于生物材料、医药行业、美容保健以及工农业中，具有重要的应用和经济价值。目前，几丁寡糖主要通过几丁质（chitin）的降解进行制备。物理、化学降解法能源消耗多，环境污染大，且无法制备特定分子量的几丁寡糖；微生物降解法反应条件温和，但发酵周期长，副产物多，不利于下游的分离纯化；酶解法产物得率高，但由于需要使用大量的降解酶，因此无法实现工业化生产。

近年来，培养异源表达几丁寡糖合成酶的基因工程菌也可以实现几丁寡糖的合成。有报道通过构建能够异源表达根瘤菌(Azorhizobium caulinodans) （(Samain andDrouillard et al., 1997; Ling and Wu et al., 2022）来源，百脉根瘤菌（Mesorhizobium loti）（Zhang and Wang et al., 2007）来源或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae) (CN202110770920)的几丁寡糖合成酶基因nod C的大肠杆菌或芽孢杆菌工程菌并进行发酵培养，能够实现几丁寡糖的合成。这些方法均选取根瘤菌的几丁寡糖合成酶基因nodC作为关键基因构建入工程菌中，并在工程菌的培养体系中加入单糖N-乙酰氨基葡萄糖作为受体实现几丁寡糖的合成。但在培养过程结束后需要使用特殊的色谱柱对菌体裂解液和发酵液进行分离纯化以去除众多的发酵副产物等。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明将病毒来源的几丁质合成酶基因按照大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化并全基因合成，利用大肠杆菌进行了异源表达。通过类生物膜体系纯化方法获得了病毒来源的几丁质合成酶。在不含有受体N-乙酰氨基葡萄糖的反应体系中，加入本发明纯化获得的病毒来源的几丁质合成酶，即可直接利用尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖作为底物合成聚合度范围为三到六的低聚几丁寡糖，主要为几丁五糖。且反应体系简单，产物易于分离纯化，是一种简单高效的合成低聚几丁寡糖的方法。

本发明首先提供一种病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法，该方法包括：对病毒来源的几丁质合成酶基因序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，得到核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的基因序列；将优化后的基因序列全基因合成至表达载体上；含有表达载体的宿主经培养、诱导、破碎和离心，获得含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分。

进一步地，获得含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分后使用两亲性分子对其进行纯化，纯化步骤包括：构建类生物膜体系；采用金属亲和层析去除杂蛋白，并洗脱、浓缩；采用分子排阻层析对浓缩液进行纯化。

进一步地，类生物膜体系的构建中，将含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分，按照膜组分与溶液质量体积比1 g：（20-40） mL加入置换缓冲液；所述置换缓冲液的成分中包含去垢剂。

进一步地，所述去垢剂包含浓度为0.5%-10%的 LMNG和浓度为0.01%-5%的CHS。

进一步地，所述去垢剂包含浓度为0.5%-10%的 DDM和浓度为0.01%-5%的CHS。

进一步地，金属亲和层析中，除杂缓冲液的成分中去垢剂为浓度0.01%-10%的GDN。

进一步地，金属亲和层析中，除杂缓冲液的成分中去垢剂为浓度0.01%-10%的digitonin。

进一步地，金属亲和层析中，除杂缓冲液的成分中去垢剂为浓度0.01%-10%的LMNG和0.01%-5%CHS。

本发明还提供了病毒来源的几丁质合成酶的用途，该病毒来源的几丁质合成酶利用尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖作为底物合成聚合度范围为三到六的低聚几丁寡糖。

进一步地，所述的低聚几丁寡糖主要为几丁五糖。

本发明还提供了一种合成低聚几丁寡糖的方法，在含有尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖为底物的反应体系中，加入获得的病毒来源的几丁质合成酶，合成低聚几丁寡糖；其中反应体系中，所述尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖底物的浓度为0.125-20 mM；所述病毒来源的几丁质合成酶的浓度为0.25-16 μM。

本发明还提供一种病毒来源的几丁质合成酶基因，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。

本发明提供了一种病毒来源的几丁质合成酶的纯化方法，利用大肠杆菌异源表达与类生物膜体系分离纯化的策略，通过该策略可以获得高纯度的病毒来源的几丁质合成酶。并利用纯化的病毒来源的几丁质合成酶提供了一种不需要加入受体N-乙酰氨基葡萄糖即能合成以几丁五糖为主的低聚几丁寡糖的新方法，且反应体系组成简单，产物几丁寡糖易于分离纯化。

附图说明

图1为本发明实施例1中低聚几丁寡糖合成酶分子排阻层析色谱图（a）和SDS-PAGE凝胶电泳检测图（b）；

图2为本发明实施例2中低聚几丁寡糖合成酶分子排阻层析色谱图（a）和SDS-PAGE凝胶电泳检测图（b）；

图3为本发明实施例3中低聚几丁寡糖合成酶分子排阻层析色谱图（a）和SDS-PAGE凝胶电泳检测图（b）；

图4为本发明实施例4中低聚几丁寡糖合成酶分子排阻层析色谱图（a）和SDS-PAGE凝胶电泳检测图（b）；

图5为本发明实施例5中低聚几丁寡糖合成酶分子排阻层析色谱图（a）和SDS-PAGE凝胶电泳检测图（b）；

图6为本发明实施例6中低聚几丁寡糖合成酶反应体系质谱结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。下面给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

本申请的发明人团队根据几丁质合成酶，纤维素合成酶及玻尿酸合成酶等多糖合成酶的糖基转移模块（GT-domain）的保守序列在NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行基因挖掘，发现了存在于病毒中的几丁质合成酶基因序列，该酶具有保守的GT-domain，猜测同样具有几丁质的合成功能。而病毒来源的序列与根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）的AcNodC，百脉根瘤菌(Mesorhizobium loti)的MlNodC及苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)的SmNodc的氨基酸序列分别仅具有24.86％，24.36％和23.70％的同源性，且未见任何期刊进行功能验证的报道。

本发明实施例中使用的去垢剂LMNG，DDM，CHS，GDN及digitonin粉末购自Anatrace公司，其他缓冲盐及盐离子购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例一 病毒来源的几丁质合成酶的获得

1.小球藻病毒（Chlorella virus）来源的几丁质合成酶的密码子优化与基因合成：

将核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的病毒来源的几丁质合成酶核苷酸序列按照大肠杆菌（Escherichia coli）的密码子偏好性进行密码子优化和全基因合成，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，目的基因密码子优化和全基因合成交由北京擎科生物科技有限公司完成。

2.病毒来源的几丁质合成酶异源表达菌株的构建：

将北京擎科生物科技有限公司交付的含有SEQ ID NO. 1所示的病毒来源的几丁质合成酶核苷酸序列的pET-28a质粒通过化学法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将转化复苏液涂布至含有50 μg /mL卡那霉素抗生素的LB琼脂平板上，37 ℃，静置培养14 h。从上述平板上挑取单克隆进行测序验证，测序结果正确的为表达病毒来源的几丁质合成酶的基因工程菌。

3.病毒来源的几丁质合成酶的异源表达与纯化，步骤如下：

（1）菌株培养与诱导表达：将实施例1中含有病毒来源的几丁质合成酶的基因工程菌接种至含有50 μg /mL卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，37 ℃，200 rpm培养16 h作为种子液；将种子液按照体积比0.1%-0.2%接种至含有100 μg/mL卡那霉素抗生素的Autoinduction液体培养基中，37 ℃，220 rpm培养至OD600=0.8-1.0；在培养物中加入终浓度100 mg/mL的IPTG，转移至16 ℃，220rpm培养14-16 h；

（2）细胞破碎与膜组分收集：将步骤（1）诱导培养获得的菌液于4 ℃，8000 rpm离心10 min收集菌体；使用FPLC 缓冲液（25 mM MES, 150 mM NaCl，10%甘油，pH6.5）重悬菌体；加入终浓度为1 mM PMSF，使用高压均质机于700-800 psi压力下破碎5-10 min，至菌液透明；将破碎液于4 ℃，12500 rpm离心20 min去除未破碎的细胞碎片与细胞器；将上清于4℃，42000 rpm离心1 h收集沉淀为膜组分，若不立即使用则液氮速冻后于-80 ℃保存；

（3）病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化：

（a）类生物膜体系的构建

取步骤（2）制备的含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分，按照膜组分与溶液质量体积比（1：20-40）加入置换缓冲液（25 mM MES, 150 mM NaCl，10%甘油，1% LMNG，0.1%CHS，pH6.5），均质后于4 ℃旋转孵育1 h-12 h；将上述旋转孵育后的含有膜组分的置换缓冲液于4 ℃，42000 rpm离心30 min（Beckman离心机，Type45 Ti转子），收集上清。

（b）金属亲和层析

将上清与Ni-NTA填料（0.75 mL 填料/g膜）4 ℃旋转孵育1-2 h；待液体流出后，依次使用10-50个柱体积的除杂 1 缓冲液（25 mM MES，1 M NaCl，10% 甘油，20 mM 咪唑，0.03% GDN，pH 6.5），除杂 2 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，40 mM 咪唑，0.03% GDN，pH 6.5）冲洗柱填料以去除杂蛋白；使用10-50个柱体积的洗脱 缓冲液（25 mMMES，150 mM NaCl，10% 甘油，250 mM 咪唑，pH 6.5）洗脱所述的病毒来源的几丁质合成酶。使用超滤管对洗脱的病毒来源的几丁质合成酶进行浓缩。

（c）分子排阻层析

浓缩完成后使用已经FPLC 缓冲液平衡的分子排阻层析柱（Superdex 200Increase 10/300 GL或Superose 6 Increase 10/300 GL）进行纯化，并通过SDS-PAGE对纯化的病毒来源的几丁质合成酶进行纯度检测，结果如图1所示，FPLC峰图显示为单峰，SDS-PAGE显示单一条带，说明纯化出了高纯度的病毒来源的几丁质合成酶。

实施例二 本实施例中，对病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化步骤采用不同于实施例一中的去垢剂，具体为：

病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化：

（a）类生物膜体系的构建

取步骤（2）制备的含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分，按照膜与溶液质量体积比1 g：（20-40） mL加入置换缓冲液（25 mM MES, 150 mM NaCl，10%甘油，1% LMNG，0.1%CHS，pH6.5），均质后于4 ℃旋转孵育1 h-12 h；将上述旋转孵育后的含有膜组分的置换缓冲液于4 ℃，42000 rpm离心30 min（Beckman离心机，Type45 Ti转子），收集上清。

（b）金属亲和层析

将上清与Ni-NTA填料（0.75 mL 填料/g膜）4 ℃旋转孵育1-2 h；待液体流出后，依次使用10-50个柱体积的除杂 1 缓冲液（25 mM MES，1 M NaCl，10% 甘油，20 mM 咪唑，0.03% digitonin，pH 6.5），除杂 2 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，40 mM 咪唑，0.03% digitonin，pH 6.5）冲洗柱填料以去除杂蛋白；使用10-50个柱体积的洗脱 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，250 mM 咪唑，pH 6.5）洗脱所述的病毒来源的几丁质合成酶。使用超滤管对洗脱的病毒来源的几丁质合成酶进行浓缩。

（c）分子排阻层析

浓缩完成后使用已经FPLC 缓冲液平衡的分子排阻层析柱（Superdex 200Increase 10/300 GL或Superose 6 Increase 10/300 GL）进行纯化，并通过SDS-PAGE对纯化的病毒来源的几丁质合成酶进行纯度检测，结果如图2所示，FPLC峰图虽有肩峰，但FPLC主峰通过SDS-PAGE显示单一条带，说明纯化出了高纯度的病毒来源的几丁质合成酶。

实施例三 本实施例中，对病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化步骤采用不同于实施例一中的去垢剂，具体为：

病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化：

（a）类生物膜体系的构建

取步骤（2）制备的含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分，按照膜与溶液质量体积比1 g：（20-40） mL加入置换缓冲液（25 mM MES, 150 mM NaCl，10%甘油，1% LMNG，0.1%CHS，pH6.5），均质后于4 ℃旋转孵育1 h-12 h；将上述旋转孵育后的含有膜组分的置换缓冲液于4 ℃，42000 rpm离心30 min（Beckman离心机，Type45 Ti转子），收集上清。

（b）金属亲和层析

将上清与Ni-NTA填料（0.75 mL 填料/g膜）4 ℃旋转孵育1-2 h；待液体流出后，依次使用10-50个柱体积的除杂 1 缓冲液（25 mM MES，1 M NaCl，10% 甘油，20 mM 咪唑，0.05% LMNG，0.005% CHS，pH 6.5），除杂 2 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，40mM 咪唑，0.05% LMNG，0.005% CHS，pH 6.5）冲洗柱填料以去除杂蛋白；使用10-50个柱体积的洗脱 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，250 mM 咪唑，pH 6.5）洗脱所述的病毒来源的几丁质合成酶。使用超滤管对洗脱的病毒来源的几丁质合成酶进行浓缩。

（c）分子排阻层析

浓缩完成后使用已经FPLC 缓冲液平衡的分子排阻层析柱（Superdex 200Increase 10/300 GL或Superose 6 Increase 10/300 GL）进行纯化，并通过SDS-PAGE对纯化的病毒来源的几丁质合成酶进行纯度检测，结果如图3所示，FPLC峰图虽有肩峰，但FPLC主峰通过SDS-PAGE显示单一条带，说明纯化出了高纯度的病毒来源的几丁质合成酶。

实施例四 本实施例中，对病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化步骤采用不同于实施例一中的去垢剂，具体为：

病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化：

（a）类生物膜体系的构建

取步骤（2）制备的含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分，按照膜与溶液质量体积比1 g：（20-40） mL加入置换缓冲液（25 mM MES, 150 mM NaCl，10%甘油，1% DDM，0.1%CHS，pH6.5），均质后于4 ℃旋转孵育1 h-12 h；将上述旋转孵育后的含有膜组分的置换缓冲液于4 ℃，42000 rpm离心30 min（Beckman离心机，Type45 Ti转子），收集上清。

（b）金属亲和层析

将上清与Ni-NTA填料（0.75 mL 填料/g膜）4 ℃旋转孵育1-2 h；待液体流出后，依次使用10-50个柱体积的除杂 1 缓冲液（25 mM MES，1 M NaCl，10% 甘油，20 mM 咪唑，0.05% digitonin，pH 6.5），除杂 2 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，40 mM 咪唑，0.05% digitonin，pH 6.5）冲洗柱填料以去除杂蛋白；使用10-50个柱体积的洗脱 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，250 mM 咪唑，pH 6.5）洗脱所述的病毒来源的几丁质合成酶。使用超滤管对洗脱的病毒来源的几丁质合成酶进行浓缩。

（c）分子排阻层析

浓缩完成后使用已经FPLC 缓冲液平衡的分子排阻层析柱（Superdex 200Increase 10/300 GL或Superose 6 Increase 10/300 GL）进行纯化，并通过SDS-PAGE对纯化的病毒来源的几丁质合成酶进行纯度检测，结果如图4所示，FPLC峰图显示出双峰，将FPLC第二个峰通过SDS-PAGE检测，目的分子量位置处的条带浓度最高，说明纯化出了病毒来源的几丁质合成酶。

实施例五 本实施例中，对病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化步骤采用不同于实施例一中的去垢剂，具体为：

病毒来源的几丁质合成酶的分离与纯化：

（a）类生物膜体系的构建

取步骤（2）制备的含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分，按照膜与溶液质量体积比1 g：（20-40） mL加入置换缓冲液（25 mM MES, 150 mM NaCl，10%甘油，1% DDM，0.1%CHS，pH6.5），均质后于4 ℃旋转孵育1 h-12 h；将上述旋转孵育后的含有膜组分的置换缓冲液于4 ℃，42000 rpm离心30 min（Beckman离心机，Type45 Ti转子），收集上清。

（b）金属亲和层析

将上清与Ni-NTA填料（0.75 mL 填料/g膜）4 ℃旋转孵育1-2 h；待液体流出后，依次使用10-50个柱体积的除杂 1 缓冲液（25 mM MES，1 M NaCl，10% 甘油，20 mM 咪唑，0.05% LMNG，0.005% CHS，pH 6.5），除杂 2 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，40mM 咪唑，0.05% LMNG，0.005% CHS，pH 6.5）冲洗柱填料以去除杂蛋白；使用10-50个柱体积的洗脱 缓冲液（25 mM MES，150 mM NaCl，10% 甘油，250 mM 咪唑，pH 6.5）洗脱所述的病毒来源的几丁质合成酶。使用超滤管对洗脱的病毒来源的几丁质合成酶进行浓缩。

（c）分子排阻层析

浓缩完成后使用已经FPLC 缓冲液平衡的分子排阻层析柱（Superdex 200Increase 10/300 GL或Superose 6 Increase 10/300 GL）进行纯化，并通过SDS-PAGE对纯化的病毒来源的几丁质合成酶进行纯度检测，结果如图5所示，FPLC峰图在目的位置处显示出单峰，通过SDS-PAGE检测，目的分子量位置处的条带浓度最高，说明纯化出了病毒来源的几丁质合成酶。

实施例六 利用本发明方法纯化获得的病毒来源的几丁质合成酶在不含N-乙酰氨基葡萄糖的反应体系中合成低聚几丁寡糖。

在300 μL反应体系中加入2 mM 尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖底物，10 mMMnCl2，25 mM MES，150 mM NaCl，4μM病毒来源的几丁质合成酶，pH为6.5。于30 ℃反应12h。其中对照组为加入对所述的病毒来源的几丁质合成酶进行突变失活的对照组。实验分组及反应体系如表1所示。

反应结束后，将上述几丁寡糖合成体系冻干后质谱检测。结果如图6所示，实验组中含有如几丁寡糖标准品中的几丁三糖、四糖、五糖和六糖，而对照组无相应产物。因此可以证明，本发明提供的病毒来源的几丁质合成酶在不含有受体N-乙酰氨基葡萄糖的反应体系中，可以合成聚合度范围为三到六的低聚几丁寡糖，其中主要为几丁五糖。

表1 几丁寡糖合成体系

	尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖mM	MnCl<sub>2</sub> mM	MES mM	NaCl mM	几丁寡糖合成酶μM
						对照组	2	10	25	150	失活突变体，4
实验组	2	10	25	150	野生型，4

Claims (10)

1.一种病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法，其特征在于，包括：对病毒来源的几丁质合成酶基因序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，得到核苷酸序列如SEQID NO. 1所示的基因序列；并将优化后的基因序列全基因合成至表达载体上；含有表达载体的宿主经培养、诱导、裂解和离心，获得含病毒来源的几丁质合成酶的膜组分。

2.根据权利要求1所述的病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法，其特征在于：获得含病毒来源的几丁质合成酶的膜组分后使用去垢剂对其进行纯化，纯化步骤包括：构建类生物膜体系；采用金属亲和层析去除杂蛋白，并洗脱、浓缩；采用分子排阻层析对浓缩液进行纯化。

3.根据权利要求2所述的病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法，其特征在于：类生物膜体系的构建中，将含有病毒来源的几丁质合成酶的膜组分，按照膜组分与溶液质量体积比1 g：（20-40） mL加入置换缓冲液；所述置换缓冲液的成分中包含去垢剂。

4.根据权利要求3所述的病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法，其特征在于：所述去垢剂包含浓度为0.5%-10%的 LMNG和浓度为0.01%-5%的CHS。

5.根据权利要求3所述的病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法，其特征在于：所述的去垢剂包含浓度为0.5%-10%DDM和浓度为0.01%-5%的CHS。

6.根据权利要求2所述的病毒来源的几丁质合成酶的表达纯化方法，其特征在于：金属亲和层析中，除杂缓冲液的成分中去垢剂为浓度0.01%-10%的GDN；或者浓度0.01%-10%的digitonin；或者浓度0.01%-10%的LMNG和0.01%-5%CHS。

7.如权利要求1所述的方法获得的病毒来源的几丁质合成酶的用途，其特征在于：该病毒来源的几丁质合成酶利用尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖作为底物合成聚合度范围为三到六的低聚几丁寡糖。

8.根据权利要求7所述的病毒来源的几丁质合成酶的用途，其特征在于：所述的低聚几丁寡糖主要为几丁五糖。

9.一种合成低聚几丁寡糖的方法，其特征在于：在含有尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖为底物的反应体系中，加入如权利要求1所述的方法获得的病毒来源的几丁质合成酶，合成低聚几丁寡糖；其中反应体系中，所述尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖底物的浓度为0.125-20 mM；所述病毒来源的几丁质合成酶的浓度为0.25-16 μM。

10.一种病毒来源的几丁质合成酶基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。

Images