CN115820523A - 利用1,2-丙二醇合成丙酸的方法及其所用重组菌 - Google Patents

利用1,2-丙二醇合成丙酸的方法及其所用重组菌 Download PDF

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CN115820523A CN202211507262.8A CN202211507262A CN115820523A CN 115820523 A CN115820523 A CN 115820523A CN 202211507262 A CN202211507262 A CN 202211507262A CN 115820523 A CN115820523 A CN 115820523A
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kppdu
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石雅南
陶勇
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Abstract

本发明公开了利用1,2‑丙二醇合成丙酸的方法及其所用重组菌。本发明属于生物技术领域，特别涉及利用1,2‑丙二醇合成丙酸的方法及其所用重组菌。本发明的恶臭假单胞菌含有甘油脱水酶基因及其激活蛋白基因，还可以包含阿拉伯糖诱导型启动子PBAD表达盒，通过向恶臭假单胞菌中导入甘油脱水酶及其激活蛋白的编码基因和启动子PBAD的编码基因，并敲除lacI基因，得到的重组恶臭假单胞菌的丙酸产量显著提高，本研究为合成高纯度生物基丙酸提供了新思路。

Description

利用1,2-丙二醇合成丙酸的方法及其所用重组菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及利用1,2-丙二醇合成丙酸的方法及其所用重组菌。
背景技术
丙酸(PA)是生物体内重要的中间代谢物。丙酸和丙酸钙盐是使用最广泛的食品添加剂，人工香料和防腐剂之一，它也被食品药品监督管理局(FDA)认证为“GenerallyRecognized As Safe”(GRAS)，安全性较高。此外，丙酸还是多种工业化合物生产的重要中间体，在油漆，化妆品，药物和农药中具有广泛的应用。目前，丙酸的化学合成主要通过乙烯氢化的方法，最终原料为石油。尽管化学合成方法具有高产量和高收益，但这通常会导致严重的环境污染问题，并且原材料石油是不可再生资源，加剧了资源短缺问题。所以通过微生物细胞工厂以可再生资源为底物发酵生产丙酸的方法得到了人们的广泛关注。
恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas Putida KT2440)是一种土壤微生物，可降解各种污染物，且对植物病害具有生物防治的功能。KT2440是恶臭假单胞菌群中表征最为完善的菌株，正逐渐成为合成生物学和代谢工程领域备受关注的实验室模型菌株。KT2440被重组DNA咨询委员会(Recombinant DNA Advisory Committee)认证为生物安全性菌株，可以用来生产各种工业化学品，包括供人类直接使用的产品(Nelson2002)。而且恶臭假单胞菌KT2440胞内具有复杂的醛脱氢酶体系，赋予了其极强的氧化能力，是优秀的工业产酸菌株。
马超等设计了从L-苏氨酸转化合成丙酸的路径，并在恶臭假单胞菌KT2440中实现了丙酸的高效催化合成(专利号：ZL 201811381133.2；申请号：201910572968.4；申请号：202111253877.8)，但是从L-苏氨酸到丙酸的理论得率仅为0.62g/g，原子经济性不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提高微生物的丙酸产率。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种重组恶臭假单胞菌。
本发明提供的重组恶臭假单胞菌含有KPpdu基因簇，所述KPpdu基因簇编码甘油脱水酶和甘油脱水酶激活蛋白。
所述重组恶臭假单胞菌还含有启动所述KPpdu基因簇转录的启动子，所述启动子的名称PBAD启动子，PBAD启动子为下述任一种DNA分子:
1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列1的第880至1229核苷酸的DNA分子；
2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
所述重组恶臭假单胞菌不含有lacI基因，所述lacI基因编码转录调控因子蛋白。
所述KPpdu基因簇来源于肺炎克雷伯氏菌。
上述重组恶臭假单胞菌中，所述甘油脱水酶包含如下甘油脱水酶大亚基pduC、甘油脱水酶中亚基pduD和甘油脱水酶小亚基pduE三种蛋白质：
所述甘油脱水酶大亚基pduC为氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
所述甘油脱水酶中亚基pduD为氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；
所述甘油脱水酶小亚基pduE为氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。
所述甘油脱水酶激活蛋白包含如下甘油脱水酶激活蛋白α亚基pduG和甘油脱水酶激活蛋白β亚基pduH的蛋白质：
所述甘油脱水酶激活蛋白α亚基pduG为氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；
所述甘油脱水酶激活蛋白β亚基pduH为氨基酸序列是序列表中序列6的蛋白质；
所述pduC基因是如下任一种DNA分子：
C1)编码序列是SEQ ID NO.1的第1230至2894位所示的DNA分子；
C2)与C1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码所述蛋白质pduC的DNA分子；
C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述pduD基因是如下任一种DNA分子：
D1)编码序列是SEQ ID NO.1的第2905至3594位所示的DNA分子；
D2)与D1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码所述蛋白质pduD的DNA分子；
D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述pduE基因是如下任一种DNA分子：
E1)编码序列是SEQ ID NO.1的第3609至4133位所示的DNA分子；
E2)与E1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码所述蛋白质pduE的DNA分子；
E3)在严格条件下与E1)或E2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述pduG基因是如下任一种DNA分子：
G1)编码序列是SEQ ID NO.1的第4146至5978位所示的DNA分子；
G2)与G1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码所述蛋白质pduG的DNA分子；
G3)在严格条件下与G1)或G2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述pduH基因是如下任一种DNA分子：
H1)编码序列是SEQ ID NO.1的第5968至6318位所示的DNA分子；
H2)与H1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码所述蛋白质pduH的DNA分子；
H3)在严格条件下与H1)或H2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
本发明还提供了构建上述重组恶臭假单胞菌的方法，所述方法包括向受体恶臭假单胞菌中导入上述KPpdu基因簇，得到所述重组恶臭假单胞菌，培养重组恶臭假单胞菌，表达得到所述重组蛋白KPpdu。
上述方法中，所述KPpdu基因簇通过DNA片段导入所述受体恶臭假单胞菌，所述DNA片段含有所述KPpdu基因簇和启动所述KPpdu基因簇转录的启动子，所述启动子的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第880-1229位核苷酸。所述KPpdu基因簇是DNA分子，KPpdu基因簇的核苷酸序列为序列1的第1230-6318位。
所述DNA片段由PBAD启动子、调节蛋白基因araC、KPpdu基因簇接而成，其中序列1的第1-879为调节蛋白基因araC序列，序列1的第880-1229位为PBAD启动子序列，序列1的第1230-6318为KPpdu基因簇编码序列。其中核苷酸序列是序列1的第1230-2894位的DNA编码甘油脱水酶大亚基pduC蛋白(氨基酸序列是序列2的蛋白质)，核苷酸序列是序列1的第2905-3594位的DNA编码甘油脱水酶中亚基pduD蛋白(氨基酸序列是序列3的蛋白质)，核苷酸序列是序列1的第3609-4133位的DNA编码甘油脱水酶小亚基pduE蛋白(氨基酸序列是序列4的蛋白质)，核苷酸序列是序列1的第4146-5978位的DNA编码甘油脱水酶激活蛋白α亚基pduG蛋白(氨基酸序列是序列5的蛋白质)，核苷酸序列是序列1的第5968-6318位的DNA编码甘油脱水酶激活蛋白β亚基pduH蛋白(氨基酸序列是序列6的蛋白质)。
上述方法中，所述KPpdu基因簇通过DNA片段整合入所述受体恶臭假单胞菌的lacI基因位点为将所述受体恶臭假单胞菌的lacI基因敲除，所述lacI基因编码转录调控因子蛋白。
本发明还提供了重组恶臭假单胞菌在制备丙酸中的应用。
本发明还提供了制备丙酸的方法。
本发明提供的制备丙酸的方法，包括培养所述重组恶臭假单胞菌，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到丙酸。
本文研究了从1,2-丙二醇到丙酸的生物转化新途径(图1)。1,2-丙二醇是一种生物基原料，已经实现了工业化生物生产，适用于生物基丙酸生产。1,2-丙二醇首先通过甘油脱水酶催化生成丙醛并产生一分子H2O，然后在KT2440自身酶的作用下氧化生成丙酸。1,2-丙二醇和丙酸都属于三碳化合物，转化过程中原子损失率非常低，H2O是唯一的副产物，质量转化率高达97.36％。
甘油脱水酶是一种辅酶B12依赖型的酶，对氧敏感，且对底物甘油和1,2-丙二醇存在自杀性失活效应，可通过共表达其“激活蛋白”重新激活。本发明将来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的KPpdu基因簇(包含甘油脱水酶pduCDE(pduC、pduD和pduE)及其激活蛋白pduGH(pduG和pduH))导入野生型P.putida KT2440中，得到过表达KPpdu的重组菌株TVG01。过表达KPpdu的重组菌株TVG01在24小时内分别产生149.5mM丙酸和125.3mM副产物丙醇，剩余8.1mM 1,2-丙二醇。
为了进一步提高丙酸转化率，降低副产物丙醇的产量，本发明对甘油脱水酶的表达及转化工艺进行了优化。在假单胞菌中严谨调控程度最高的诱导型启动子——阿拉伯糖诱导型启动子PBAD，将启动子PBAD和甘油脱水酶及其激活蛋白基因形成的KPpdu基因簇整合到假单胞菌的lacI位点，得到工程菌TVG02。在培养过程中通过控制诱导剂添加浓度来调控甘油脱水酶的表达。实验发现，当诱导剂L-阿拉伯糖浓度为0.02％(0.02g/100mL)时，甘油脱水酶的表达强度与假单胞菌自身的醛脱氢酶强度相匹配，中间产物丙醛无积累，可以被迅速持续转化为终产物丙酸，24小时的最终丙酸摩尔转化率达99％。本发明为合成高纯度生物基丙酸提供了新思路。
附图说明
图1为1，2-丙二醇到丙酸的生物转化途径。
图2为菌落PCR验证pUCP18-KPpdu质粒。
图3为重组菌株TVG01反应24小时色谱峰图。其中A为1，2-丙二醇，丙酸和丙醇的标准品色谱峰图。1，2-丙二醇标准品出峰时间19.7min(浓度为50mM),丙酸标准品出峰时间21.5min(浓度为50mM),丙醇标准品出峰时间31.6min(浓度为50mM)；B为重组菌株TVG01反应24小时色谱峰图。19.7min出峰物质为1，2-丙二醇，21.5min出峰物质为丙酸，31.6min出峰物质为丙醇。
图4为Klebsiella pneumoniae来源的甘油脱水酶及其激活蛋白在P.putidaKT2440中过表达后丙酸的生产情况。
图5为重组菌株TVG02反应24小时色谱峰图。A为1，2-丙二醇，丙酸和丙醇的标准品色谱峰图。1，2-丙二醇标准品出峰时间19.7min(浓度为50mM),丙酸标准品出峰时间21.5min(浓度为50mM),丙醇标准品出峰时间31.6min(浓度为50mM)；B为重组菌株TVG02反应24小时色谱峰图，21.5min出峰物质为丙酸。
图6为重组菌株TVG02在0.02％ L-阿拉伯糖诱导后丙酸生产情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pUCP18和pK18Gm质粒质粒已记载于Ma,C.,Mu,Q.,Wang,L.etal.Bio-production of high-purity propionate by engineering L-threoninedegradation pathway in Pseudomonas putida.Appl Microbiol Biotechnol(104),5303–5313(2020).公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pRB1k中质粒已记载于Qingxuan Mu,Ya’nan Shi,Rongshan Li,Chao Ma,Yong Tao,and Bo Yu.Production of Propionate by a SequentialFermentation-Biotransformation Process via L-Threonine.Journal ofAgricultural and Food Chemistry 2021 69(46),13895-13903.公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明所用的菌株Pseudomonas putida KT2440已记载于Ma,C.,Mu,Q.,Wang,L.et al.Bio-production of high-purity propionate by engineering L-threoninedegradation pathway in Pseudomonas putida.Appl Microbiol Biotechnol(104),5303–5313(2020).公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、重组菌株TVG01的构建
1.重组表达载体pUCP18-KPpdu的构建及转化
质粒pUCP18经内切酶BamHⅠ和HindⅢ(New England Biolabs Inc.USA)双酶切开环，得到线性化质粒骨架。KPpdu基因簇(由甘油脱水酶基因pduCDE及其激活蛋白基因pduGH连接而成)从前人构建的质粒中克隆得到核苷酸序列是序列表中序列7的2234-7374位的KPpdu的PCR产物。线性化质粒骨架与KPpdu的PCR产物经Gibson重组(Gibson Assembly)连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，得到转化子，提取转化子的质粒，送样测序分析，得到构建好的重组表达质粒pUCP18-KPpdu，核苷酸序列是序列表中序列7。
将pUCP18-KPpdu电转化Pseudomonas putida KT2440(受体菌)。100μL的Pseudomonas putida KT2440感受态细胞转入1μg质粒。电转条件：使用BioRad的电转仪，1mm电击杯，1.8kV放电，放电时间4-5秒。将转化细胞全部涂庆大霉素抗性平板(浓度50μg/mL)，30℃静止过夜培养，挑取单菌落利用引物KPpdu-F和KPpdu-R进行菌落PCR验证。
表1菌落PCR验证引物
引物名称 引物序列5’-3’
KPpdu-F ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCAATGAGATCGAAAAGATTTGAAG
KPpdu-R GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTTAAGCATGGCGATCCCGAAATG
PCR验证结果如图2所示，获得条带大小为5.1Kb左右，阳性克隆即为含有pUCP18-KPpdu质粒的重组恶臭假单胞菌，简称重组菌株TVG01，质粒核苷酸序列为序列表中序列7。重组恶臭假单胞菌含有编码序列(CDS)是序列7第2260-7348位核苷酸的基因簇KPpdu，其中核苷酸序列是序列7的第2260-3924位的DNA编码甘油脱水酶大亚基pduC蛋白(氨基酸序列是序列2的蛋白质)，核苷酸序列是序列7的第3935-4624位的DNA编码甘油脱水酶中亚基pduD蛋白(氨基酸序列是序列3的蛋白质)，核苷酸序列是序列7的第4639-5163位的DNA编码甘油脱水酶小亚基pduE蛋白(氨基酸序列是序列4的蛋白质)，核苷酸序列是序列7的第5176-7008位的DNA编码甘油脱水酶激活蛋白α亚基pduG蛋白(氨基酸序列是序列5的蛋白质)，核苷酸序列是序列7的第6998-7348位的DNA编码甘油脱水酶激活蛋白β亚基pduH蛋白(氨基酸序列是序列6的蛋白质)。
菌落PCR验证pUCP18-KPpdu质粒构建成功。左一泳道为商用1kb DNA分子量标准(天根生化科技有限公司，MD111)。
Pseudomonas putida KT2440(受体菌)利用引物KPpdu-F和KPpdu-R进行菌落PCR不能得到特异PCR产物，说明Pseudomonas putida KT2440不含有融合基因Kppdu。
将pUCP18空载体按照上述步骤电转化Pseudomonas putida KT2440，获得空白对照菌株pUCP18-kt。
实施例2、全细胞转化生产丙酸的方法
将上述重组菌株TVG01和空白对照菌株pUCP18-kt挑取单克隆至培养基LB+50ug/mL庆大霉素(向LB培养基中加入庆大霉素至庆大霉素含量为50μg/mL得到的液体培养基)培养基中，30℃，200rpm，过夜培养，1％转接至新鲜培养基(LB+50μg/mL庆大霉素+5mg/LVB12)培养18小时。
离心收集菌体，50mM pH 7.0的PBS(8.0g/L NaCl,0.2g/L KCl,2.9g/L Na2HPO4·12H2O,0.24g/L KH2PO4)缓冲液重悬，洗涤两次。将菌体加入100mL广口瓶，再加入50mM pH7.0的PBS，1,2-丙二醇和维生素VB12，得到体积为50mL的反应体系，该反应体系中菌体含量为30OD600nm/mL，1,2-丙二醇的含量为300mM，VB12的含量为5mg/L。反应在恒温水浴锅中(37℃，500rpm)进行，实时监测反应pH，通过自动泵入1M Ca(OH)2中和反应生成的丙酸，控制反应pH保持在7.0左右。每隔一段时间取样，24小时反应结束。实验重复3次。
反应结束后，测定反应液中1,2-丙二醇、丙醇和生成的丙酸含量。具体测定方法为：将取样得到的反应液离心，取上清，用去离子水稀释10倍后，取1mL稀释液，用0.22um的滤膜过滤，所得滤液即为待测样品，将该样品进行HPLC分析。
以国药集团化学试剂有限公司(产品目录号为81011918)，Innochem公司(产品目录号为KYFJQ22)，国药集团化学试剂有限公司(产品目录号为80109118)，为标准品根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析丙酸、1,2-丙二醇和丙醇含量。HPLC分析中，柱子为伯乐HPX-87H柱(7.8×300mm,9μm)；流动相为6mM硫酸水溶液；流速为0.5ml/min；进样量为10μl；检测器为示差折光检测器(RID)。
图3中A为1，2-丙二醇，丙酸和丙醇的标准品色谱峰图。1，2-丙二醇标准品出峰时间19.7min(浓度为50mM),丙酸标准品出峰时间21.5min(浓度为50mM),丙醇标准品出峰时间31.6min(浓度为50mM)。
图3中B为重组菌株TVG01反应24小时色谱峰图，19.7min出峰物质为1，2-丙二醇，21.5min出峰物质为丙酸，31.6min出峰物质为丙醇。
重组菌株TVG01转化1,2-丙二醇生产丙酸的测定结果如图4所示，其中pUCP18-kt代表含有空质粒pUCP18的Pseudomonas putida KT2440在24小时的底物剩余和产物生产情况。TVG01代表过表达KPpdu的重组Pseudomonas putida KT2440菌株在24小时的底物剩余和产物生产情况。根据HPLC测定结果，pUCP18-kt菌株24小时仍有211.4mM 1，2-丙二醇剩余，丙醇和丙酸的产量分别为43.2mM和42.9mM。TVG01则在24小时内分别产生149.5mM丙酸和125.3mM副产物丙醇，剩余8.1mM 1,2-丙二醇。
实施例3、基因KPpdu整合至Pseudomonas putida KT2440染色体组lacI位点
从Pseudomonas putida KT2440染色体组中PCR扩增得到lacI位点的上下游同源臂各600bp，PCR扩增上游同源臂所用引物为表2中的LacI-up-F和LacI-up-R，PCR扩增下游同源臂所用引物为表2中的LacI-down-F和LacI-down-R。从质粒pUCP18-KPpdu中PCR扩增得到KPpdu基因簇序列，所用引物为表2中的PBAD-KPpdu-F和PBAD-KPpdu-R。
利用表2中的引物PBAD-F和PBAD-R从质粒pRB1k中PCR扩增得到启动子PBAD及其上游调节蛋白基因araC序列。
质粒pK18Gm经内切酶BamHⅠ和HindⅢ(New England Biolabs Inc.USA)双酶切开环，得到质粒骨架。将上述PCR得到的DNA片段与经双酶切得到的质粒骨架Gibson重组连接，得到连接产物。将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5α，得到转化子，提取转化子的质粒，送样测序分析，pK18Gm-up-down(ΔlacI::PBAD-KPpdu)的核苷酸序列为序列表中的序列8。pK18Gm-up-down(ΔlacI::PBAD-KPpdu)含有KPpdu基因簇，KPpdu基因簇是核苷酸序列是序列8的第1230-6318位的DNA分子，序列8由PBAD启动子、调节蛋白基因araC、KPpdu基因簇连接而成，其中序列8的第1-879为调节蛋白基因araC序列，序列8的第880-1229位为PBAD启动子序列，序列8的第1230-6318为KPpdu基因簇编码序列，其中核苷酸序列是序列8的第1230-2894位的DNA编码甘油脱水酶大亚基pduC蛋白(氨基酸序列是序列2的蛋白质)，核苷酸序列是序列8的第2905-3594位的DNA编码甘油脱水酶中亚基pduD蛋白(氨基酸序列是序列3的蛋白质)，核苷酸序列是序列8的第3609-4133位的DNA编码甘油脱水酶小亚基pduE蛋白(氨基酸序列是序列4的蛋白质)，核苷酸序列是序列8的第4146-5978位的DNA编码甘油脱水酶激活蛋白α亚基pduG蛋白(氨基酸序列是序列5的蛋白质)，核苷酸序列是序列8的第5968-6318位的DNA编码甘油脱水酶激活蛋白β亚基pduH蛋白(氨基酸序列是序列6的蛋白质)，得到构建好的重组质粒pK18-up-down(ΔlacI::PBAD-KPpdu)。
pK18Gm-up-down(ΔlacI::PBAD-KPpdu)含有介导同源重组的FRT序列，FRT序列是核苷酸序列是序列8的第7412-7458位的DNA分子。
将pK18Gm-up-down(ΔlacI::PBAD-KPpdu)电转化Pseudomonas putida KT2440，方法同实施例1。转化平板过夜培养，挑取多个单克隆转化子，分别在含有20％(20g/100mL)蔗糖的LB平板上划线，30℃静置培养36小时。
挑取上述步骤新长出来的单克隆，菌落PCR验证，所用引物为表2中的ΔlacI-YF和ΔlacI-YR。KPpdu基因簇已成功整合到lacI位点且同源重组质粒pK18Gm-up-down(ΔlacI::PBAD-KPpdu)已被消除，得到重组菌株TVG02(重组恶臭假单胞菌TVG02)。重组恶臭假单胞菌TVG02是将KPpdu基因簇整合入Pseudomonas putida KT2440基因组的lacI位点并将Pseudomonas putida KT2440的lacI(核苷酸序列(CDS)是GenBank:NC_002947(10日-2月-2022年)的第1位-1351位核苷酸)基因敲除得到的重组恶臭假单胞菌。
表2实验所用引物
Figure BDA0003969604580000091
Figure BDA0003969604580000101
实施例4、优化的全细胞转化生产丙酸的方法
将实施例3中获得的菌株TVG02菌株挑取单克隆至培养基LB+50μg/mL庆大霉素(向LB培养基中加入庆大霉素至庆大霉素含量为50μg/mL得到的液体培养基)培养基中，30℃，200rpm，过夜培养，1％转接至新鲜培养基LB+50μg/mL庆大霉素培养至对数生长前期(OD600nm＝0.6-0.8，以培养基LB+50μg/mL庆大霉素为空白对照)，加入L-阿拉伯糖和维生素VB12，使培养体系中L-阿拉伯糖的含量为0.02％(0.02g/100mL)，VB12的含量为5mg/L诱导甘油脱水酶表达，继续培养16小时。离心收集菌体，50mM pH 7.0的PBS(8.0g/L NaCl，0.2g/L KCl，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，0.24g/L KH2PO4)缓冲液重悬，洗涤两次。将菌体加入lL发酵罐中，再加入50mM pH 7.0的PBS，1,2-丙二醇和维生素VB12得到体积为300mL的反应体系，该反应体系中菌体含量为30OD600nm/mL，1,2-丙二醇的含量为400mM，VB12的含量为5mg/L。搅拌速度与溶氧率关联自动控制在300-600rpm范围内，通气量为1.5L/min，以保持溶氧率在50％。反应温度为37℃，通过加入1.0M Ca(OH)2水溶液将pH控制在7.0。每隔一段时间取样，24小时反应结束。样品处理与检测方法同实施例2。实验重复3次，每次重复每个处理1个lL发酵罐。
丙酸转化率计算公式：转化率＝24小时丙酸产量(浓度，mM)/1，2-丙二醇投料量(浓度，mM)*100％
图5中A为1，2-丙二醇，丙酸和丙醇的标准品色谱峰图。1，2-丙二醇标准品出峰时间19.7min(浓度为50mM),丙酸标准品出峰时间21.5min(浓度为50mM),丙醇标准品出峰时间31.6min(浓度为50mM)。图5中B为重组菌株TVG02反应24小时色谱峰图，21.5min出峰物质为丙酸。每升反应体系中的丙酸产量为392.3mM。
在培养过程中通过控制诱导剂添加浓度来调控甘油脱水酶的表达。当诱导剂L-阿拉伯糖浓度为0.02％(w/v)时，甘油脱水酶的表达强度与假单胞菌自身的醛脱氢酶强度相匹配，中间产物丙醛无积累，可以被迅速持续转化为终产物丙酸。由图6可知，1,2-丙二醇的24小时的生物转化过程，最终丙酸摩尔转化率达99％。本研究为合成高纯度生物基丙酸提供了新思路。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.重组恶臭假单胞菌，其特征在于：所述重组恶臭假单胞菌含有KPpdu基因簇，所述KPpdu基因簇编码甘油脱水酶和甘油脱水酶激活蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组恶臭假单胞菌，其特征在于，所述重组恶臭假单胞菌还含有启动所述KPpdu基因簇转录的启动子，所述启动子的名称PBAD启动子，PBAD启动子为下述任一种DNA分子:
1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列1的第880至1229位核苷酸的DNA分子；
2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的重组恶臭假单胞菌，其特征在于，所述重组恶臭假单胞菌不含有lacI基因，所述lacI基因编码转录调控因子蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一所述重组恶臭假单胞菌，其特征在于，所述KPpdu基因簇来源于肺炎克雷伯氏菌。
5.根据权利要求1-4中任一所述的重组恶臭假单胞菌，其特征在于，
所述甘油脱水酶包含如下甘油脱水酶大亚基pduC、甘油脱水酶中亚基pduD和甘油脱水酶小亚基pduE三种蛋白质：
1)所述甘油脱水酶大亚基pduC为氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
2)所述甘油脱水酶中亚基pduD为氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；
3)所述甘油脱水酶小亚基pduE为氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；
所述甘油脱水酶激活蛋白包含如下甘油脱水酶激活蛋白α亚基pduG和甘油脱水酶激活蛋白β亚基pduH的蛋白质：
1)所述甘油脱水酶激活蛋白α亚基pduG为氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；
2)所述甘油脱水酶激活蛋白β亚基pduH为氨基酸序列是序列表中序列6的蛋白质。
6.构建权利要求1-5中任一所述的重组恶臭假单胞菌的方法，所述方法包括向受体恶臭假单胞菌中导入权利要求1-4中任一所述KPpdu基因簇，得到所述重组恶臭假单胞菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述KPpdu基因簇通过DNA片段导入所述受体恶臭假单胞菌，所述DNA片段含有所述KPpdu基因簇和启动所述KPpdu基因簇转录的启动子，所述启动子的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第880-1229位核苷酸。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述KPpdu基因簇整合入所述受体恶臭假单胞菌的lacI基因位点将所述受体恶臭假单胞菌的lacI基因敲除，所述lacI基因编码转录调控因子蛋白。
9.权利要求1-5中任一所述的重组恶臭假单胞菌在制备丙酸中的应用。
10.制备丙酸的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求1-5中任一所述的重组恶臭假单胞菌，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到丙酸。
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