CN115819587A - 一种抗nkg2a单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，提供了一种抗NKG2A单克隆抗体，HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo:6所示。本发明通过作用于免疫细胞上的NKG2A抑制性受体，解除NKG2A信号通路对免疫细胞的抑制作用，增强NK细胞、T细胞等的活性，激活NK细胞等对肿瘤的杀伤，该抗体是促进抗肿瘤免疫的新型检查点抑制剂，用于制备治疗癌症或免疫疾病药物。

Description

一种抗NKG2A单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗NKG2A单克隆抗体及其应用。

背景技术

随着生物医药技术的不断应用和发展，免疫疗法在癌症治疗领域取得了重大突破，例如抗PD-1/PD-L1抗体的研发和CAR-T技术在内的免疫疗法，这种免疫疗法的重点是利用患者体内的适应性免疫系统，最主要的是利用CD8+T对肿瘤细胞造成杀伤。但是，通过大量的研究发现，抗PD-1/PD-L1抗体只对20-30％的癌症病人有效，而CAR-T技术对实体瘤的疗效还不够理想，同时，越来越多的研究数据表明，很多癌症都能发展出多种策略来逃避CD8+T细胞的识别，因而需要开发针对癌症的新免疫治疗手段。

近年来，NK细胞为抗癌治疗带来了新希望，NK细胞是与T、B淋巴细胞不同的大颗粒淋巴细胞，具有识别并杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，同时能够产生免疫调节性细胞因子两大主要功能，是人体抗感染和防止癌症发展的重要免疫调节细胞。NK细胞表面多种受体蛋白参与NK细胞活性状态的调控，这些受体蛋白大致分为两类：杀伤细胞活化受体(KAR)和杀伤细胞抑制受体(KIR)。正常生理情况下，杀伤细胞活化受体与自身细胞上多糖类抗原结合产生活化信号；而杀伤细胞抑制受体与MHC-I类分子结合，生成占主导地位的抑制信号，以保证自身组织细胞不被杀伤。当MHC-I类分子发生突变或减少缺失时，其与杀伤细胞抑制受体的结合受到影响，从而不能生成抑制性信号，此时，NK细胞被活化而产生杀伤效应；NK细胞也可以通过肿瘤细胞过表达表面抗原与杀伤细胞活化受体结合而激活(此时活化信号超过抑制信号)；此外，NK细胞还可以通过ADCC作用识别并杀伤被抗体依附的肿瘤细胞。

NKG2A是C型凝集素超家族的成员，它与CD94以异源二聚体的形式组成抑制性受体，表达于约一半的外周血NK细胞、部分CD8+αβT细胞、NKT细胞及γδT细胞上。非经典HLA-Ⅰ类分子(人类的HLA-E或者小鼠的Qa-1分子)是NKG2A-CD94的主要配体，其常常在肿瘤细胞上异常高表达。NKG2A-CD94受体与其配体的结合，能抑制NK细胞和T细胞的抑瘤作用，NKG2A的胞内部分含有酪氨酸抑制基序(ITIM)，NKG2A-CD94受体与配体结合后，磷酸化的ITIM能聚集酪氨酸磷酸酶(SHP-1)，而SHP-1能向NK细胞和T细胞传递抑制性信号。肿瘤浸润的NK细胞和T细胞上NKG2A的高表达和肿瘤细胞上HLA-E的高表达，都与较差的癌症预后正相关，因此，NKG2A/HLA-E成了新的肿瘤治疗的免疫检查点而备受关注，目前，针对NKG2A这个靶标，仍没有药品上市，为此，为了能够满足癌症患者的用药需求，急需研发一种亲和力更高、药效更强的抗NKG2A单克隆抗体及其应用。

发明内容

本发明通过对免疫文库的筛选，得到了一种能够与NKG2A选择性特异结合，而不与其他NKG2家族蛋白结合的抗NKG2A单克隆抗体。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种抗NKG2A单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，所述轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

进一步的，所述单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，所述鼠源抗体分子的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示。

进一步的，所述鼠源抗体分子还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠C_k型的轻链恒定区；其中，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQID No:10所示，所述IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，所述IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:12所示，所述IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:13所示；所述鼠C_k型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:9所示。

进一步的，所述单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。

进一步的，所述单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：

HA-1：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示；

HA-2：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示。

进一步的，所述人源化抗体分子还包括人源抗体恒定区。

进一步的，所述人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型或IgG4型的重链恒定区和人C_k型的轻链恒定区，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:18所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:19所示，所述人C_k型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:20所示。

本发明还提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码所述的抗NKG2A单克隆抗体。

本发明进一步提供了一种重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体包含上述所述的多核苷酸分子。

本发明还提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；

优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。

本发明还提供了一种药物，所述药物包含所述的抗NKG2A单克隆抗体。

本发明还提供了所述的抗NKG2A单克隆抗体特异性结合NKG2A，解除NKG2A信号通路对NK细胞的抑制作用，激活NK细胞对肿瘤的杀伤，并用于制备治疗癌症或自身免疫疾病药物中的应用；

所述癌症包括结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤；

所述自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

本发明还提供了所述的抗NKG2A单克隆抗体和免疫调节药物或抗炎症因子药物联合用于制备治疗癌症或自身免疫疾病药物中的应用；

所述免疫调节药物选自抗PD-1单克隆抗体、抗PD-L1单克隆抗体、抗CTLA4单克隆抗体、抗4-1BB单克隆抗体、抗OX-40单克隆抗体、抗PD-L2单克隆抗体、抗LAG-3单克隆抗体、抗TIGIT单克隆抗体、抗GITR单克隆抗体、抗ICOS单克隆抗体、抗PVR单克隆抗体、抗PVRIG单克隆抗体、抗VISTA单克隆抗体或抗TIMS单克隆抗体；

所述抗炎症因子药物选自：抗TNFa单克隆抗体、抗IL-1β单克隆抗体或IL-1受体拮抗剂、抗IL-6R单克隆抗体、抗IL-8单克隆抗体、重组IL-15或IL-15激动剂；

所述癌症包括结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤；

所述自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

本发明的有益效果如下：本发明提供的抗NKG2A单克隆抗体可以通过作用于免疫细胞上的NKG2A抑制性受体，解除NKG2A信号通路对免疫细胞的抑制作用，增强NK细胞、T细胞等细胞活性，从而激活NK细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤，该单克隆抗体是促进抗肿瘤免疫的新型检查点抑制剂，主要用于制备治疗癌症或自身免疫疾病药物；此外，抗NKG2A单克隆抗体还可以和免疫调节药物或抗炎症因子药物联合用于治疗癌症或自身免疫疾病，尤其是当肿瘤细胞通过MHC-I的低表达而逃避CD8+T细胞的杀伤时，激活的免疫细胞无需MHC-I的配合就可以对肿瘤细胞进行杀伤，癌症包括但不限于结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤；自身免疫疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的抗体生物筛选方法中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；

图2为本发明实施例3中梯度稀释ELISA抗NKG2A噬菌体单克隆抗体的亲和力的比较图；

图3为本发明实施例5提供的抗NKG2A全抗体的表达质粒pTSE的图谱；

图4为本发明实施例6中鼠源抗体与NKG2A的结合能力比较图；

图5为本发明实施例7中抗NKG2A单克隆抗体MA-1与NKG2A、NKG2C、NKG2E的结合曲线图；

图6为本发明实施例13中人源化抗体分子与NKG2A的结合能力比较图；

图7为本发明实施例14中抗NKG2A单克隆抗体激活人PBMC杀伤HL-60的效果图；

图8为本发明实施例15单克隆抗体体内抑瘤模型图。

具体实施方式

为了更加容易理解本发明，描述实施例之前，先对本发明某些技术和科学术语作以下说明：

本文所使用的术语“抗体”，包含全抗体及其任一抗原结合片段，抗体包括鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体，抗体也可以是Fab、F(ab)2、Fv或ScFv(单链抗体)，抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突变、缺失、置换等)的抗体。

本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”，即为抗体重链和轻链靠近N段的序列区为可变区(V区)，靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)，可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR)，每条轻链可变区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成，重链的3个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。

本文所使用的术语“鼠源抗体分子”，其来源是用NKG2A抗原免疫注射小鼠后得到的抗体。

本文所使用的术语“嵌合抗体分子”，是将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源抗体在人体内诱发的免疫应答反应。嵌合抗体是利用DNA重组技术，将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，这样表达的抗体分子中轻重链的可变区是鼠源的，而恒定区是人源的，整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了鼠源抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。

本文所使用的术语“人源化抗体分子”，其是将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。

术语“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；术语“HEK293细胞”为人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293cell)，术语“NS0细胞”为小鼠NS0胸腺瘤细胞。

下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

本发明实施例1提供了一种抗NKG2A单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQID No:4所示；轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，具体序列如下。

实施例2抗原制备及噬菌体抗体库的构建与筛选

本发明通过用NKG2A抗原(NKG2A蛋白胞外段)免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库并建立抗原位点筛选方法，具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下：

1、NKG2A抗原免疫小鼠：

实验动物：

种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；

体重：18-20g；

实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。

2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人NKG2A(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。

3、噬菌体抗体库的构建与筛选

取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库(VH)及轻链可变区基因库(VL)，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，PscFv-DisB-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。

4、噬菌体库的富集筛选

以huFc-NKG2A/CD94为抗原包被免疫管，抗原包被量为4μg/500μl/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为10⁹～10¹²个，室温反应1h后，使用PBST-洗去未结合的噬菌体，通过0.1M pH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。

将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。

将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选。

5、噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选

经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃条件下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约10¹⁰的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。4000rpm，4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定：

将抗原huFc-NKG2A/CD94包被浓度为0.5μg/ml，一抗为100μl 1:3稀释的噬菌体上清，用封闭液作为阴性对照。HRP-anti-M13二抗孵育后用TMB底物显色，显色20min后在酶标仪中检测OD 450nm，读值>0.3的视为阳性克隆。

使用阳性克隆上清进行抗体特异性初筛：用上述ELISA法检测各噬菌体上清与不同抗原huFc-NKG2A/CD94,huFc-NKG2C/CD94或huFc-NKG2C/CD94的结合，选择上清与NKG2A结合时OD450nm读值高于与NKG2C/E结合时读值的三倍以上的单克隆分子进行后续筛选，此时，共筛选出1个单克隆分子，命名为MA-1。

鼠源抗体分子	重链可变区序列	轻链可变区序列
			MA-1	SEQ ID No:7	SEQ ID No:8

具体的，SEQ ID No:7(MA-1的重链可变区的氨基酸序列)：

EVKLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSDYDMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCTSPRQVGLRKAFDYWGQGTTLTVSS；

SEQ ID No:8(MA-1的轻链可变区的氨基酸序列)：

DIVVTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKSWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKRAD。

实施例3梯度稀释ELISA比较抗NKG2A噬菌体单克隆抗体的亲和力

将实施例2中获得的鼠源抗体分子(MA-1)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，具体方法如下：

用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被NKG2A抗原，100ng/孔/100μL，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例2中筛选得到的噬菌体单克隆抗体MA-1分别用PBST五倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自Bio-viewshine，货号：GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H₂SO₄终止后，酶标仪在450nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：

通过上述数据及如图2所示，实施例2筛选出的鼠源抗体分子MA-1能够与NKG2A结合，本发明提供的鼠源抗体分子MA-1与NKG2A均具有较高的亲和力。

实施例4

本发明实施例4在实施例2的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠C_k型的轻链恒定区；其中，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:10所示，IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:11所示，IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:12所示，IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:13所示；鼠C_k型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:9所示；具体序列如下：

SEQ ID No:9(鼠C_k型的轻链恒定区氨基酸序列)：

ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；

SEQ ID No:10(鼠的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：

AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG；

SEQ ID No:11(鼠的IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列)：

AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK；

SEQ ID No:12(鼠的IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列)：

AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK；

SEQ ID No:13(鼠的IgG3型的重链恒定区氨基酸序列)：

ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA。

实施例5鼠源全抗分子制备

本发明实施例5在实施例2的基础上，将实施例2中筛选鉴定的单克隆抗体MA-1中提取质粒，将重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有小鼠IgG2a重链(氨基酸序列如SEQ ID No:11所示)和鼠C_k型的轻链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:9所示)基因的载体pTSE，pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。

瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得完整的单克隆抗体分子。

实施例6鼠源抗体与NKG2A的结合能力

用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被NKG2A，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的MA-1鼠源抗体，全抗体的起始最高浓度是5μg/ml，分别经过3倍稀释后每个抗体均做12个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST1:10000稀释的Anti-Mouse Fc-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，然后用2MH₂SO₄终止显色。在450nm下读数，并计算对应的EC50值，数据如图4所示。

通过图4可知，筛选出的鼠源抗体MA-1能够与NKG2A进行结合，且具有较高的亲和力。

实施例7鼠源抗NKG2A单克隆抗体与NKG2A、NKG2C、NKG2E的结合特异性实验

用ELISA法检测实施例5得到的单克隆抗体MA-1同huFc-NKG2A/CD94、huFc-NKG2C/CD94或huFc-NKG2E/CD94结合的EC50值，其中，NKG2C(NKG2C蛋白胞外段)和NKG2E(NKG2E蛋白胞外段)均与NKG2A序列一致性较高，且为NK细胞活化型受体：

将抗NKG2A单克隆抗体MA-1做梯度稀释作为一抗，抗鼠Ig-HRP作二抗，分别与NKG2A、NKG2C和NKG2E结合，ELISA检测后做剂量-读值曲线并做非线性回归曲线，计算各抗体分别与三个抗原结合的EC50值，抗NKG2A单克隆抗体MA-1与NKG2蛋白的结合曲线如图5所示。

通过图5所示，本发明筛选的抗NKG2A单克隆抗体MA-1能够与NKG2A特异结合而不与NKG2C和NKG2E等其他NKG2家族蛋白结合。

实施例8

本发明实施例8进一步的限定了单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子，嵌合抗体分子包括鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型或IgG4型的重链恒定区和人C_k型的轻链恒定区，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:19所示，所述人C_k型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:20所示；

SEQ ID No:18(人的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

SEQ ID No:19(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列)：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；

SEQ ID No:20(人的C_k链的轻链恒定区氨基酸序列)：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

实施例9嵌合抗体分子的制备

本发明实施例9在实施例8的基础上进一步优选的人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:18所示)和人C_k型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:20所示)。

具体的制备方法：

将筛选出来的理想的抗NKG2A单克隆抗体分子MA-1的重链可变区VH(SEQ ID No:7)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:8)保持鼠源序列不变，分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上，重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQID NO:18所示)，轻链恒定区为人的C_k型(氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)。瞬时转染HEK293E细胞(购买自：中国医学科学院基础医学研究所，货号为：GNHu43)，进行抗体表达，得到嵌合抗体CA-1。

实施例10鼠源抗体分子MA-1进行人源化

首先使用实施例2中鼠源抗体分子MA-1的序列和人抗体种系数据库(v-base)比较，寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列，然后将鼠源抗体分子MA-1的CDR的序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体的轻、重链可变区分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，然后再连接到瞬时表达载体上，对人源化得到的轻重链组合分析，得到如下人源化抗体分子：HA-1，HA-2，上述筛选到的2个单克隆抗体序列如下：：

人源化抗体分子	重链可变区序列	轻链可变区序列
			HA-1	SEQ ID No:14	SEQ ID No:15
HA-2	SEQ ID No:16	SEQ ID No:17

具体的，SEQ ID No:14(HA-1的重链可变区的氨基酸序列)：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSPRQVGLRKAFDYWGQGTTVTVSS；

SEQ ID No:16(HA-2的重链可变区的氨基酸序列)：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSPRQVGLRKAFDYWGQGTTVTVSS；

SEQ ID No:15(HA-1的轻链可变区的氨基酸序列)：

DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCSASSSVSYMYWYQQKPDQAPKLLIKLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK；

SEQ ID No:17(HA-2的轻链可变区的氨基酸序列)：

DIVVTQSPAFLSVTPGEKVTITCSASSSVSYMYWYQQKPDQAPKLLIKLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK。

实施例11人源化全抗分子的制备

本发明实施例11在实施例10的基础上进一步的限定了人源化抗体分子还包括人源抗体恒定区，人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型或IgG4型的重链恒定区和人C_k型的轻链恒定区，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:19所示，人C_k型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:20所示。

上述人源抗体恒定区具体序列与实施例8相同。

将上述实施例10中人源化得到的2个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，每个人源化抗体分子选择IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID No:19所示)的重链恒定区，选择人C_k型(氨基酸序列如SEQ ID No:20所示)的轻链恒定区制备全抗分子，瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得1个单克隆抗体，具体如下。

人源化抗体分子	人源化全抗分子
		HA-1	HA-1-IgG1
HA-2	HA-2-IgG1

实施例12

本发明实施例12在上述实施例的基础上进一步的限定了如下方案：

本发明还提供了一种多核苷酸分子，多核苷酸分子编码抗NKG2A单克隆抗体。

本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含多核苷酸分子。

本发明还提供了一种转染上述限定的重组DNA表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；

优选的，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。

本发明还提供了一种药物，药物包含抗NKG2A单克隆抗体。

本发明还提供了抗NKG2A单克隆抗体特异性结合NKG2A，解除NKG2A信号通路对NK细胞的抑制作用，激活NK细胞对肿瘤的杀伤，并用于制备治疗癌症或自身免疫疾病药物中的应用；

癌症包括但不限于：结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤；

自身免疫疾病包括但不限于：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

本发明还提供了抗NKG2A单克隆抗体和免疫调节药物或抗炎症因子药物联合用于制备治疗癌症或自身免疫疾病药物中的应用；

免疫调节药物包括但不限于：抗PD-1单克隆抗体、抗PD-L1单克隆抗体、抗CTLA4单克隆抗体、抗4-1BB单克隆抗体、抗OX-40单克隆抗体、抗PD-L2单克隆抗体、抗LAG-3单克隆抗体、抗TIGIT单克隆抗体、抗GITR单克隆抗体、抗ICOS单克隆抗体、抗PVR单克隆抗体、抗PVRIG单克隆抗体、抗VISTA单克隆抗体或抗TIMS单克隆抗体；

抗炎症因子药物包括但不限于：抗TNFa单克隆抗体、抗IL-1β单克隆抗体或IL-1受体拮抗剂、抗IL-6R单克隆抗体、抗IL-8单克隆抗体、重组IL-15或IL-15激动剂；

癌症包括但不限于结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤；

自身免疫疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

实施例13人源化全抗分子与NKG2A蛋白的结合实验

用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被NKG2A抗原，200ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-1、HA-2和实施例9中制备的嵌合抗体CA-1，3个抗体的起始最高浓度均是50μg/mL，分别经过3倍稀释后每个抗体均做10个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti HumanIgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2304)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色5min，然后用2M H₂SO₄终止显色。酶标仪在450nm下读数，并计算对应的EC50值，实验结果如图6所示。

通过图6可知，2个不同的人源化抗体分子均能与NKG2A进行结合，且2个人源化抗体分子的EC50值均与嵌合抗体CA-1较为接近，说明人源化后的抗体分子保留了鼠源亲本抗体MA-1与NKG2A的高结合能力。

实施例14抗NKG2A单克隆抗体体外杀伤效果检测

选择高表达HLA-E的HL-60肿瘤细胞作为靶细胞，选择人PBMC细胞作为效应细胞，调整靶细胞和效应细胞的密度，等体积混匀后使效靶比为50：1，加入96孔板中相应位置。对不同抗体进行样品稀释，加入板中，使其作用终浓度为50μg/ml。37℃CO₂培养箱孵育18h后取上清液检测LDH的释放，计算细胞杀伤率，结果如图7所示。

通过图7可以得出，本发明提供的抗NKG2A单克隆抗体HA-1和HA-2均能激活并促进人PBMC细胞对HL-60肿瘤细胞的杀伤效应。

实施例15抗NKG2A单克隆抗体HA-1对小鼠体内MC38-NKG2A结直肠癌的抑制实验

1、实验动物：

种属品系：C57BL/6JGpt，小鼠；

周龄：6-8周；

实验动物提供商:百奥塞图(北京)医药科技股份有限公司。

2、细胞培养：

MC38肿瘤细胞(YK-CL-256-02)(购自：普如汀生物技术(北京)有限公司(Biovector NTCC Inc.)，货号：NTCC-MC38)为原始细胞，构建MC38-NKG2A肿瘤细胞株。

每只小鼠右侧背部皮下接种稳转了MC38肿瘤细胞，成瘤后取18只肿瘤大小接近的小鼠随机分成三组，每组6只。腹腔注射本发明中提供的抗NKG2A单克隆抗体HA-1(10mg/kg)，同时设置对照组注射等量的Z270对照组，对照抗体Z270及其人源化抗体huZ270的VH及VL序列(来自专利US8993319B2)，阴性对照组注射等量的同型IgG，每周给药两次，每周测两次瘤体积并测体重。观察记录瘤生长情况，当有肿瘤体积超过3000mm³，断颈法处死小鼠，用手术剪镊小心分离出各个肿瘤，称重。结果见图8。

如图8所示，注射抗NKG2A单克隆抗体HA-1的肿瘤体积显著小于阴性对照组的肿瘤体积，注射抗NKG2A单克隆抗体HA-1的肿瘤体积与对照组抗体Z270的肿瘤体积较为接近。可见本发明中的抗NKG2A单克隆抗体HA-1能显著抑制肿瘤生长。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种抗NKG2A单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，所述轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

2.如权利要求1所述的抗NKG2A单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，所述鼠源抗体分子的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示。

3.如权利要求2所述的抗NKG2A单克隆抗体，其特征在于，所述鼠源抗体分子还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠C_k型的轻链恒定区；其中，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:10所示，所述IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，所述IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:12所示，所述IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:13所示；所述鼠C_k型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:9所示。

4.如权利要求2所述的抗NKG2A单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。

5.如权利要求2所述的抗NKG2A单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：

HA-1：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示；

HA-2：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示。

6.如权利要求5所述的抗NKG2A单克隆抗体，其特征在于，所述人源化抗体分子还包括人源抗体恒定区。

7.如权利要求4或6所述的抗NKG2A单克隆抗体，其特征在于，所述人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型或IgG4型的重链恒定区和人C_k型的轻链恒定区，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:19所示，所述人C_k型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:20所示。

8.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1-7任一项所述的抗NKG2A单克隆抗体。

9.一种重组DNA表达载体，其特征在于，所述重组DNA表达载体包含权利要求8所述的多核苷酸分子。

10.一种转染如权利要求9所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；

优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。

11.一种药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1-7任一项所述的抗NKG2A单克隆抗体。

12.权利要求1-7任一项所述的抗NKG2A单克隆抗体特异性结合NKG2A，解除NKG2A信号通路对NK细胞的抑制作用，激活NK细胞对肿瘤的杀伤，并用于制备治疗癌症或自身免疫疾病药物中的应用；

所述癌症包括结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤；

所述自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

13.权利要求1-7任一项所述的抗NKG2A单克隆抗体和免疫调节药物或抗炎症因子药物联合用于制备治疗癌症或自身免疫疾病药物中的应用；

所述免疫调节药物选自抗PD-1单克隆抗体、抗PD-L1单克隆抗体、抗CTLA4单克隆抗体、抗4-1BB单克隆抗体、抗OX-40单克隆抗体、抗PD-L2单克隆抗体、抗LAG-3单克隆抗体、抗TIGIT单克隆抗体、抗GITR单克隆抗体、抗ICOS单克隆抗体、抗PVR单克隆抗体、抗PVRIG单克隆抗体、抗VISTA单克隆抗体或抗TIMS单克隆抗体；

所述抗炎症因子药物选自：抗TNFa单克隆抗体、抗IL-1β单克隆抗体或IL-1受体拮抗剂、抗IL-6R单克隆抗体、抗IL-8单克隆抗体、重组IL-15或IL-15激动剂；

所述癌症包括结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤；

所述自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

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