CN115819428A - 一种甲氧苄啶@八元瓜环包合物及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲氧苄啶@八元瓜环（TMP@Q[8]）包合物的制备方法及应用。本发明制备的TMP@Q[8]具有抗菌和促凝血活性，可用于制备抗菌止血药物，治疗细菌引起的出血性感染疾病。本发明操作简单，TMP@Q[8]包合物易于制备，药物疗效明细，易于大规模生产应用。

Description

一种甲氧苄啶@八元瓜环包合物及其制备与应用

技术领域

本发明涉及化合物领域，特别是一种甲氧苄啶@八元瓜环（TMP@Q[8]）包合物及其制备及应用。

背景技术

甲氧苄啶（Trimethoprim），化学名：5-[(3,4,5-三甲氧基苯基)-甲基]-2,4-嘧啶二胺；简称TMP，是一种有机化合物，化学式为C₁₄H₁₈N₄O₃。TMP属磺胺类抗菌素，是细菌二氢叶酸还原酶抑制剂，其抗菌作用原理为干扰细菌的叶酸代谢，从而抑制细菌的生长繁殖。甲氧苄啶对多数革兰阳性菌及革兰阴性菌有抗菌活性；此外，甲氧苄啶对疟原虫及某些真菌，如奴卡菌、组浆菌，酵母菌也有一定作用。

瓜环具有内疏水，外亲水的特殊笼体结构，能够与多种药物分子通过笼体作用、氢键、范德华力等非键作用力形成稳定的主-客体包结配合物，是一种安全，无毒的药物载体。八元瓜环具有促凝血作用。

瓜环分子与客体药物形成主客体化合物时，有三种情况，一是对药物的生物活性影响较小，二是降低药物的生物活性、三是增加药物的生物活性，瓜环分子中以七、八元瓜环Q[8]最为常用。

人体外伤后往往伴随着出血及伤口感染，及时止血和抗菌治疗是救助病人的有效措施。目前尚未发现甲氧苄啶与瓜环结合产生新的化合物，本发明研究甲氧苄啶和瓜环结合下产生新的药物作用，扩大了药物的应用范围。

发明内容

本发明涉及一种甲氧苄啶@八元瓜环（TMP@Q[8]）包合物的制备方法及应用。TMP@Q[8]具有抗菌和促凝血活性，可用于制备抗菌止血药物，治疗细菌引起的出血性感染疾病。

本发明的技术方案：

一种甲氧苄啶@八元瓜环包合物,所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的分子式：N₃₂C₅₆O₁₇H₁₆；所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的模拟结构式为：

所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的分子量为：1453.30。

前述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的制备方法，所述制备方法：称取八元瓜环和甲氧苄啶分别用去离子水溶解完全后混合均匀得到甲氧苄啶@八元瓜环的溶液，在室温下，用真空旋转蒸发仪旋干溶剂后得到的固体粉末物质，即得甲氧苄啶@八元瓜环。

具体的说，前述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的制备方法，所述制备方法：称取0.4001 g八元瓜环和0.0999g甲氧苄啶分别用1000 mL的去离子水溶解完全后混合均匀得到甲氧苄啶@八元瓜环的溶液，在室温下，用真空旋转蒸发仪旋干溶剂后得到的固体粉末物质，即得甲氧苄啶@八元瓜环。

更具体的说，前述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的制备方法，所述八元瓜环与甲氧苄啶的摩尔比为1﹕1。

前述甲氧苄啶@八元瓜环包合物在制备治疗抗菌止血药物中的应用。

一种治疗抗菌止血的药物，所述药物包括甲氧苄啶@八元瓜环包合物。

一种治疗抗菌止血的药物，所述药物主要由甲氧苄啶@八元瓜环包合物制备而成。

本发明的有益效果

1.本发明制备的TMP@Q[8]具有显著抑制金黄色葡萄球菌(SA菌)的作用，同时缩短APTT，极显著地降低FIB，表现出促凝血作用，即通过内源性、外源性途径促使血液凝固。

2.本发明操作简单，TMP@Q[8]包合物易于制备，药物疗效明细，易于大规模生产应用。

附图说明

图1 TMP与Q[8]相互作用的核磁共振氢谱图；

图2 包合物TMP@Q[8]的ESI-TOF质谱图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1：

TMP@Q[8]包合物的制备方法：

称取0.4001g Q[8]和0.0999gTMP(Q[8]与TMP的摩尔比为1﹕1)分别用1000mL去离子水溶解完全后混合均匀得到TMP@Q[8]的溶液，在室温下，用真空旋转蒸发仪旋干溶剂后得到的固体粉末物质，即TMP@Q[8]。

本发明的实验例

1.试药试剂

甲氧苄啶(TMP,分析纯98%以上，购自上海源叶有限公司)，八元瓜环（Q[8]，纯度97% 以上,贵州省大环化学及超分子化学重点实验室制备）

2.实验仪器

JNM-ECZ400sMHz型核磁共振仪（NMR，日本电子公司），安捷伦液相色谱-G6500系列四极杆-飞行时间质谱联用仪（安捷伦科技（中国）有限公司公司），RE-52A 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)

3.实验方法

3.1 TMP@Q[8]包合物的制备方法:

称取0.4001g的Q[8]和0.0999g的TMP(Q[8]与TMP的摩尔比为1﹕1)分别用去离子水溶解完全后混合均匀得到TMP@Q[8]的溶液，在室温下，用真空旋转蒸发仪旋干溶剂后得到的固体粉末物质，即TMP@Q[8]。

3.2 TMP@Q[8]包合物的结构表征

3.2.1 核磁氢谱实验

核磁共振作为一种分析主客体相互作用的重要方法，当客体分子位于瓜环空腔时，客体分子的质子特征峰将向高场移动；当位于瓜环端口时，向低场移动。

以D₂O为溶剂，分别配置10^-2mol/L的甲氧苄啶(TMP)和八元瓜环(Q[8])储备液。取三支相同的核磁管，分别加入50 μL的TMP (10^-2mol/L)、50 μL的TMP (10^-2mol/L)和50 μL的Q[8](10^-2mol/L)、50 μL的Q[8] (10^-2mol/L)，后用D₂O定容至500 μL。常温下，用JNM-ECZ400s MHz 核磁共振仪记录¹H NMR谱。

TMP和Q[8]相互作用的核磁氢谱图见图1，向TMP体系加入Q[8]后，TMP上所有质子峰均向高场移动，由此推断TMP与Q[8]相互作用，且Q[8]空腔包结了TMP整个分子。

质谱实验

分别配置10^-4mol/L的TMP和Q[8]的水溶液后，按照V(TMP) : V(Q[8])=1:1混合均匀得到TMP@Q[8]的水溶液，过滤后用安捷伦液相色谱-G6500系列四极杆-飞行时间质谱联用仪测得谱图。

质谱结果表明TMP@[8]的母离子峰位于m/z 1619.5388[M+H]⁺(计算值为1619.5378 [M+H]⁺)，如图2所示，可推断TMP与Q[8]之间的作用比为1:1，两者形成1:1的包合物。

包合物的抑菌实验（测定方法采用试管二倍稀释法）

3.3.1材料准备

菌株：金黄色葡萄球菌

实验药物：TMP@Q[8]

培养基：本试验采用pH为7.2-7.4的普通牛肉膏培养基，其液体培养基配方为：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、水1000 mL。固体培养基为每100 mL液体培养基加入1.5g琼脂。

试管二倍稀释法测定

（1）菌液制备:

在试管中倒入5 mL普通牛肉膏液体培养基，灭菌冷却后接种细菌，在恒温摇床中28℃下震荡(200 r/min)培养6-8 h。采用平板计数法计数，用液体培养基稀释菌液至1×10⁷cfu/mL，置4℃冰箱中保存备用。

（2）药液制备:

以DMSO为溶剂，配置0.08 mol/L的TMP@Q[8]母液，121℃高压灭菌20 min，置冰箱中保存备用。

（3）最低抑菌浓度(MIC)的测定:

测定方法采用试管二倍稀释法^[1]，样本用试管8支，依次编号，其中第1支作为空白对照（不接种细菌），第2支做溶剂对照（含50% DMSO的细菌培养液），第3支做阳性对照为TMP，其浓度为1×10^-6mol/L，其余5支用液体培养基对试验样本进行二倍梯度稀释；每管各加入细菌悬液50 µL，置28℃摇床中震荡(200 r/min)培养24 h，然后取出与空白对照管对比观察，无混浊现象所对应的药物浓度就为样本对所测细菌的最低抑菌浓度(MinimalInhibitory Concentration，简称MIC)。

结果

TMP、TMP@Q[8]对SA的最低抑制浓度见表1，结果表明TMP、TMP@Q[8]对SA菌均有很强的抑制活性，最低抑菌浓度为1.0×10^-5mol/L。

表1 TMP、TMP@Q[8]对金黄色葡萄球菌(SA)

的最低抑制浓度(MIC)

Sample	MIC ( mol/L )
		TMP	1.0×10<sup>-5</sup>
TMP@Q[8]	1.0×10<sup>-5</sup>

3.4 TMP@Q[8]包合物的促凝血实验（采用凝血四项测定法）

3.4.1样品的制备

称取TMP@Q[8]包合物5 mg，分别溶于适量生理盐水而配成1 mg/200μL，同时配制13.33 mg/mL的灯盏花素对照组溶液、5 mg/mL的云南白药对照组溶液和空白溶剂对照组。以家兔为实验动物，然后分别利用PT检测试剂盒、APPT检测试剂盒、TT检测试剂盒、FIB含量检测试剂盒进行测定。

从雄性獭兔耳缘静脉取血3.6 mL，放置在含有枸橼酸钠400 μL（0.109 mol/L）的离心管中，轻轻混匀，3000 rpm下离心15 min，取上清液。

部分活化凝血活酶时间（APTT）的测定

样品的制备方法同(1)，首先在测试杯中加入样品溶液25 μL，再加入血浆100 μL以及37 ℃预温的100 μL APTT试剂，37 ℃孵育5 min，最后再加入37 ℃预温下的的100 μLCaCl₂溶液（0.025 mol/L），记录时间，即为APTT值。

凝血酶原时间（PT）的测定

样品的制备方法同(1)。首先在测试杯中加入样品溶液25 μL，然后加入血浆100 μL，放入恒温箱中37 ℃下孵育3 min，最后加入37 ℃预温的200 μL PT试剂，记录时间，即为PT值。

凝血酶原时间（TT）的测定

样品的制备方法同(1)。在测试杯中分别加入样品溶液50 μL以及血浆200 μL，恒温箱中孵育3 min，然后加入200μL TT试剂200，记录时间，即为TT值。

纤维蛋白原（FIB）的测定

样品的制备方法同(1)。按照试剂说明书方法建立标准曲线。分别取血浆、样品和缓冲液200 μL、100μL和700μL混匀，稀释后从中取出200 μL血浆，放入恒温箱中37℃预温3min，然后加入100 μL凝血酶溶液，记录数值，为FIB值。

凝血一般分可为外源性凝血途径、内源性凝血途径以及凝血共同途径。目前，临床上主要通过测定凝血四项来反映机体内凝血系统状况。体外凝血四项实验显示，与空白组比较，TMP@Q[8]样品能极显著地缩短APTT（p<0.001），主要通过缩短APTT极显著地降低FIB，表现出促凝血作用。

表 3 在体外的四项凝血实验中，各样品的测试数据

	APTT（S）	PT（S）	TT（S）	FIB（g/L）
					空白	23.3±0.14	18.3±0.28	71.05±1.06	150.89±1.35
云南白药	19.85±0.64***	16.8±0.28*	66.4±0.28***	144.575±3.41
					灯盏花素	32.05±1.48***	19.9±0.28**	75.6±0.14**	161.8±8.03*
TMP@Q[8]	19.4±0.99***	18.55±0.07	73.4±0.98***	130.96±2.77***

注：与空白相比，0.05>P^*>0.01>P^**>0.001>P^***

综上所述，TMP@Q[8]具有一定的抑制金色葡萄球菌和体外促凝血活性，可以作为一种潜在的抗菌止血药。

Claims (7)

1.一种甲氧苄啶@八元瓜环包合物,其特征在于：所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的分子式为：N₃₂C₅₆O₁₇H₁₆；所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的模拟结构式为：

所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的分子量为：1453.30。

2.根据权利要求1所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法：称取八元瓜环和甲氧苄啶分别用去离子水溶解完全后混合均匀得到甲氧苄啶@八元瓜环的溶液，在室温下，用真空旋转蒸发仪旋干溶剂后得到的固体粉末物质，即得甲氧苄啶@八元瓜环。

3.根据权利要求2所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法：称取0.4001g八元瓜环和0.0999g甲氧苄啶分别用1000mL的去离子水溶解完全后混合均匀得到甲氧苄啶@八元瓜环的溶液，在室温下，用真空旋转蒸发仪旋干溶剂后得到的固体粉末物质，即得甲氧苄啶@八元瓜环。

4.根据权利要求3所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物的制备方法，其特征在于：所述八元瓜环与甲氧苄啶的摩尔比为1﹕1。

5.如权利要求1所述甲氧苄啶@八元瓜环包合物在制备治疗抗菌止血药物中的应用。

6.一种治疗抗菌止血的药物，其特征在于：所述药物包括甲氧苄啶@八元瓜环包合物。

7.一种治疗抗菌止血的药物，其特征在于：所述药物主要由甲氧苄啶@八元瓜环包合物制备而成。

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