CN115814149A - 一种改性羧甲基壳聚糖止血材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改性羧甲基壳聚糖止血材料及其制备方法，其制备步骤包括：首先对壳聚糖纤维进行羧甲基化改性，得到羧甲基壳聚糖纤维，然后通过引入高岭土和Ca2+以及两者复合对羧甲基化壳聚糖纤维进行改性，制备了高岭土和或Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，研究结果表明经高岭土和或Ca2+改性后得到的改性羧甲基壳聚糖止血材料具有优异的吸液能力、快速止血性能和生物相容性，且无细胞毒性，另本发明制备方法所用原材料成本低廉、来源广泛，工艺简单，适于推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种改性羧甲基壳聚糖止血材料及其制备方法。
背景技术
意外创伤每年都会导致大量人员丧生，其中不可控的创伤出血是导致患者死亡的重要原因。在创伤初期进行快速止血不仅可以降低伤亡率，还可以减少伤者的疼痛感。目前，国内针对创伤出血的材料主要为止血海绵、止血纱布和止血带等，这些材料对于出血严重的动脉伤口的止血效果不显著。临床手术使用的止血材料价格昂贵，保存困难，不满足意外创伤急救的需要。因此，开发一种面向严重创伤出血、价格低廉的止血材料具有重要意义。
壳聚糖来源广泛、价格低，反应活性高，生物相容性好，被广泛应用到纺织、生物医用材料等领域。此外，壳聚糖分子链上氨基带有正电荷，可以和红细胞表面的负电荷产生静电作用，促进红细胞的聚集，从而起到加速止血的作用。但是，壳聚糖材料的亲水性比较差且止血效果有限，无法用于中度、重度的急救创伤出血，很大程度上限制了其应用。因此需要进一步提高壳聚糖无纺布的亲水性和快速止血能力。中国专利(申请号：202210828258.5)公开了一种壳聚糖止血材料的制备方法和应用，并具体公开了以下技术方案：将壳聚糖复合溶液的pH值调节成中性，凝胶化后经冷冻干燥工艺制备得到壳聚糖止血材料；所述壳聚糖复合溶液为壳聚糖醋酸溶液、羧甲基壳聚糖水溶液与甘油水溶液的混合溶液；冷冻干燥时间为12-48小时。该止血材料具有韧性好、吸液率高、弹性恢复率高等优点。然而，制备该止血材料的试剂价格较高、制备流程需要冷冻干燥机、耗时长等弊端。
高岭土是一种止血性能出色的粘土材料，其止血能力与沸石相当。高岭土的止血机制分为两部分。一方面，高岭土具有高孔隙率和高比表面积，当高岭土材料与血液接触时，可以通过物理吸水作用浓缩凝血因子。另一方面，高岭土是一种携带负电荷的硅铝酸盐，当血液与高岭土接触时，高岭土携带的负电荷可以直接激活凝血因子Ⅻ，从而加速内源性凝血途径。中国专利(申请号：201810263022.5)公开了一种偏高岭土基止血海绵材料及其制备方法，该方法包括步骤：1)配置壳聚糖和乙酸的混合溶液；配置羧甲基壳聚糖的水溶液；配置甘油的水溶液；配置偏高岭土盐酸悬浊液；2)将壳聚糖和乙酸的混合溶液、羧甲基壳聚糖的水溶液和甘油的水溶液混合均匀，得到第一混合液；3)搅拌条件下向第一混合液中加入偏高岭土酸性悬浊液，得到第二混合液；4)将第二混合液浇注于模具中，再将模具置于真空冷冻干燥机内冷冻干燥，即得偏高岭土基止血海绵材料。该偏高岭土基止血海绵材料具有较快的止血效果。然而，该止血海绵材料制备周期长、需要特种装备冷冻干燥机，故生产效率较低，产品成本较高。
钙离子(Ca2+)作为一种凝血因子，在整个凝血过程中发挥着重要的作用。凝血酶的生成离不开钙离子的参与，因此Ca2+可以作为一种出色的止血剂。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，本发明提出了一种改性羧甲基壳聚糖止血材料及其制备方法，该止血材料具有优异的快速止血能力和生物相容性。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其制备步骤包括：首先对壳聚糖纤维进行羧甲基化改性，得到羧甲基壳聚糖纤维，然后采用止血剂对羧甲基壳聚糖纤维进行改性，得到改性羧甲基壳聚糖止血材料；其中，所述止血剂为高岭土和Ca2+中的一种或者两种的组合。
优选地，所述改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、以壳聚糖纤维为原料，通过水刺工艺制备壳聚糖无纺布；
S2、对制备的壳聚糖无纺布进行羧甲基化改性，得到羧甲基壳聚糖无纺布；
S3、采用止血剂对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到改性羧甲基壳聚糖止血材料；
其中，所述止血剂为高岭土和Ca2+中的一种或者两种的组合。
优选地，步骤S1中，所述通过水刺工艺制备壳聚糖无纺布，具体步骤为：
A11、将壳聚糖纺丝溶液进行加压，以去除掉纺丝液中的不溶性杂质，然后将壳聚糖纺丝液加入到纺丝机中纺丝，制备壳聚糖纤维；
A12、将制备的壳聚糖纤维进行裁剪，然后使用梳理机对壳聚糖短纤维进行梳理，得到絮状纤维；
A13、将得到的絮状纤维放置到铺网机上铺成纤维网，进行牵伸、预湿，预湿后进行正反水刺加工，最后进行后整理、烘干、卷绕处理，得到壳聚糖无纺布。
优选地，所述壳聚糖纺丝溶液的浓度为1.5～3.5％。
优选地，步骤S2中，所述对制备的壳聚糖无纺布进行羧甲基化改性，得到羧甲基壳聚糖无纺布，具体步骤为：
A21、将壳聚糖无纺布裁剪后置于反应容器中，然后向反应容器中加入氢氧化钠和异丙醇的水溶液，进行溶胀和碱化0.5-2h；
A22、向反应容器中加入氯乙酸，加热至50-60℃，反应20-35min，然后用乙醇反复洗涤，干燥，得到羧甲基壳聚糖无纺布。
优选地，所述氢氧化钠、氯乙酸与异丙醇的质量体积配比为1.35g：0.3-1g：40ml；所述异丙醇的水溶液中，异丙醇与水的体积配比为4：1。
优选地，步骤S3中，当采用高岭土作为止血剂，对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到改性羧甲基壳聚糖止血材料，具体步骤为：
A31、配制浓度为0.1-0.5wt％的
溶液，然后加入高岭土，得到高岭土溶液，将高岭土溶液加热搅拌反应0.5-2h；
A32、将制得的羧甲基壳聚糖无纺布加入到上述溶液中，浸渍0.2-2h后取出，干燥，得到高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料。
优选地，步骤S3中，采用Ca2+作为止血剂，对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，具体步骤为：
B31、配制浓度为0.1-0.5wt％的
溶液，加入氯化钙搅拌，得到氯化钙溶液；
B32、将制得的羧甲基壳聚糖无纺布加入到上述氯化钙溶液中，浸渍0.2-2h后取出，干燥，得到Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料。
优选地，步骤S3中，同时采用高岭土和Ca2+作为止血剂，对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到高岭土/Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，具体步骤为：
C31、配制质量分数0.1-0.5wt％的
溶液，加入高岭土搅拌，得到高岭土溶液；
C32、再加入氯化钙溶液搅拌，将制得的羧甲基壳聚糖无纺布加入到上述溶液中，浸渍0.2-2h后取出，干燥，得到高岭土/Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料。
优选地，所述高岭土溶液的浓度为0.3-3wt％，进一步优选为1wt％。
优选地，所述干燥温度为40-120℃，干燥时间为10-60min。
优选地，所述氯化钙溶液的浓度为0.2-1wt％，进一步优选为0.5wt％。
本发明的目的还在于提供上述制备方法制得的改性羧甲基壳聚糖止血材料。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
本发明通过对壳聚糖纤维进行羧甲基化改性，然后分别引入高岭土和氯化钙(Ca2 +)以及两者复合对羧甲基化壳聚糖纤维进行改性，制备了高岭土和或Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，研究结果表明经高岭土和或Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料具有优异的亲水性和吸液能力，且快速止血性能优异、无细胞毒性、生物相容性好。本发明制备方法所用原材料成本低廉、来源广泛，工艺简单，适于推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为壳聚糖无纺布和羧甲基壳聚糖无纺布的SEM图；
图1B为CMCS2-1～CMCS2-4的SEM图；
图1C为CMCS2-5～CMCS2-8的SEM图；
图1D为CS9和CMCS2-9的SEM图；
图2为壳聚糖无纺布与羧甲基壳聚糖无纺布的红外光谱图；
图3A为经高岭土溶液改性处理后得到的CMCS2-3元素分布图；
图3B为经氯化钙溶液改性处理后得到的CMCS2-7元素分布图；
图3C为经高岭土与钙离子复合改性处理后得到的CMCS2-9元素分布图；
图4为高岭土改性羧甲基壳聚糖无纺布的吸水率结果(a)和钙离子改性羧甲基壳聚糖无纺布的吸水率结果(b)；
图5A为高岭土改性处理后的羧甲基壳聚糖材料的溶血试验结果图(a)和氯化钙改性处理后的羧甲基壳聚糖无纺布溶血试验结果图(b)；
图5B为高岭土和氯化钙复合改性处理后的羧甲基壳聚糖材料的溶血试验结果图；
图6A为高岭土改性处理后的羧甲基壳聚糖材料与抗凝兔血混合后的体外凝血时间和凝血指数结果图；
图6B为氯化钙改性处理后的羧甲基壳聚糖材料的体外凝血时间和凝血指数结果图；
图6C为高岭土和氯化钙复合改性处理后得到的CS9和CMCS2-9与商用的Quikclot的体外凝血时间和凝血指数结果图；
图7A为高岭土改性处理后得到的各试样的APTT和PT试验结果图；
图7B为氯化钙改性处理后得到的各试样的APTT和PT试验结果图
图7C为高岭土和氯化钙复合改性处理后得到的各试样的APTT和PT试验结果图；
图8为CS9、CMCS2-9、商用Quikclot的大鼠肝脏损伤止血模型的止血时间和出血量结果图；
图9为CS9、CMCS2-9、商用Quikclot的细胞毒性的测试结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、以壳聚糖纤维为原料，通过水刺工艺制备壳聚糖无纺布：
A11、配置浓度为3.5％的壳聚糖纺丝溶液，通过加压去除掉纺丝液中的不溶性杂质，然后将壳聚糖纺丝液加入到纺丝机中纺丝，制备壳聚糖纤维；
A12、将制备的壳聚糖纤维裁剪为3～5cm的纤维丝束，使用梳理机对壳聚糖短纤维进行梳理，得到絮状纤维；
A13、将得到的絮状纤维然放置到铺网机上铺成纤维网，进行牵伸、预湿，预湿后进行正反水刺加工，最后进行后整理、烘干、卷绕处理，得到壳聚糖无纺布，并将该样品命名为CS；
S2、对制备的壳聚糖无纺布进行羧甲基化改性，得到羧甲基壳聚糖无纺布，具体步骤为：
A21、将制备的壳聚糖无纺布裁剪成5cm×5cm，置于反应容器中，称量1.35g氢氧化钠和40ml异丙醇的水溶液(异丙醇与水的体积比为4：1)加入到反应容器中，进行溶胀和碱化1h；
A22、称取0.6g氯乙酸加入到上述反应容器中，加热至50℃，保持在此条件下反应20min，取出，然后用75％乙醇反复洗涤，干燥，得到羧甲基壳聚糖无纺布，并将该样品命名为CMCS2，并用电导法测定出该样品的羧甲基取代度；
S3、采用高岭土作为止血剂，对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料，具体步骤为：
A31、配制0.1wt％的
溶液，然后加入高岭土，配制浓度为0.3wt％的高岭土溶液，加热搅拌2h；
A32、将制得的羧甲基壳聚糖无纺布(CMCS2)加入到上述溶液中，浸渍1h后取出，置于60℃烘箱中干燥30min，得到高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-1。
实施例2
与实施例1步骤基本相同，不同之处在于：本实施例中所配制的高岭土溶液的浓度为0.5wt％，得到高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-2。
实施例3
与实施例1步骤基本相同，不同之处在于：本实施例中所配制的高岭土溶液的浓度为1wt％，得到高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-3。
实施例4
与实施例1步骤基本相同，不同之处在于：本实施例中所配制的高岭土溶液为3wt％，得到高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-4。
实施例5
与实施例1步骤基本相同，不同之处在于：本实施例中使用Ca2+作为止血剂，具体配制浓度为0.2wt％的氯化钙溶液来代替实施例1中浓度为0.3wt％的高岭土溶液，得到Ca2+(钙离子)改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-5。
实施例6
与实施例5步骤基本相同，不同之处在于：本实施例中所配制的氯化钙溶液的浓度为0.5wt％，得到Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-6。
实施例7
与实施例5步骤基本相同，不同之处在于：本实施例中所配制的氯化钙溶液的浓度为1wt％，得到Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-7。
实施例8
与实施例1步骤基本相同，不同之处在于：本实施例中同时采用高岭土和氯化钙(提供Ca2+)作为止血剂，具体配制浓度为1wt％的高岭土溶液和浓度为0.5wt％的氯化钙溶液来代替实施例1中浓度为0.3wt％的高岭土溶液，具体步骤为：配制质量分数0.1wt％的
溶液，然后加入高岭土，配制浓度为1wt％的高岭土溶液，置于磁力搅拌器加热搅拌2h，再加入一定质量的氯化钙，配制浓度为0.5wt％的氯化钙溶液，然后将羧甲基壳聚糖无纺布(CMCS2)加入到上述溶液中，浸渍1h后取出，置于60℃烘箱中干燥30min，得到高岭土/Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-9。
对比例1
与实施例9步骤基本相同，不同之处在于：本实施例中使用壳聚糖无纺布代替羧甲基壳聚糖无纺布，得到高岭土/Ca2+改性壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CS9。
对比例2
与实施例5步骤基本相同，不同之处在于：本对比例中所配制的氯化钙溶液的浓度为2wt％，得到Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，并将该样品命名为CMCS2-8。
性能测试
(1)表观形貌
分别对制备的CS、CMCS2、CMCS2-1～CMCS2-9和CS9样品进行喷金处理通过扫描电子显微镜对无纺布表面形貌进行表征。同时利用元素分析仪对不同的样品进行元素分析，观察元素的分布情况。结果见图1A～1D和图3A～3C。
如图1A所示，壳聚糖无纺布(见图1A(a))由形状规则的壳聚糖纤维交叉缠绕形成，表面光滑平整，纤维交错没有规律，纤维之间存在大小不一的孔隙，经测试壳聚糖无纺布(CS样品)的孔隙率为85.9％。与壳聚糖无纺布相比，经过羧甲基取代的无纺布(见图1A(c))表面形貌没有发生显著变化，纤维表面依旧光滑规整。通过电导法测定了羧甲基改性的取代度为19.7％，壳聚糖无纺布的羧甲基化，使得无纺布变得更加蓬松多孔，导致其孔隙率进一步提高，经测量孔隙率高达86.9％，孔隙率的提高有利于空气流通和液体吸收，符合医用敷料的基本要求。
如图1B所示，经过不同浓度的高岭土溶液改性处理后得到的CMCS2-1、CMCS2-2、CMCS2-3、CMCS2-4样品表面上可清晰观察到高岭土的附着(见图1B(a)、(b)、(c)、(d))。这里
表面活性剂的使用有利于高岭土在羧甲基壳聚糖无纺布上的附着。
如图1C所示，经过不同浓度的氯化钙溶液改性处理后得到的CMCS2-5、CMCS2-6、CMCS2-7、CMCS2-8样品表面也可以清晰看到固态颗粒存在(见图1C(a)、(b)、(c)、(d))，随着氯化钙浓度的增加，固体颗粒的数量也随之增加。
如图1D所示，经高岭土和氯化钙复合改性处理后得到的CS9样品和CMCS2-9样品表面均可以看到很多颗粒的附着，止血剂(高岭土和钙离子)颗粒不仅分布在纤维与纤维的间隙中，在纤维的表面也可以清楚看到止血剂颗粒附着，
表面活性剂的使用提高了高岭土与钙离子两种止血剂在无纺布上的负载效率。
(2)红外光谱
实施例1中制备的CS样品(壳聚糖无纺布)与CMCS2样品(羧甲基壳聚糖无纺布)的红外光谱如图2所示，由图2结果可知，壳聚糖的特征峰位于3455cm-1(羟基拉伸)、1598-1600cm-1(N-H弯曲)和1094cm-1(C-O拉伸)。与壳聚糖无纺布相比，羧甲基壳聚糖无纺布的振动吸收峰在1597-1650cm-1和1414-1401cm-1分别对应于羧基(与N-H弯曲重叠)和羧甲基，在光谱中比纯壳聚糖更强。这表明壳聚糖中成功地引入了羧甲基。本发明实施例1成功地制备了羧甲基壳聚糖无纺布。
(3)元素分布
如图3A的元素分布图所示，经高岭土溶液改性处理后得到的CMCS2-3样品中可以看到Si、Al两种元素存在，进一步证实了高岭土分布在羧甲基壳聚糖无纺布中。如图3B的元素分布图所示，经氯化钙溶液改性处理后得到的CMCS2-7样品中可以看到Ca、Cl两种元素存在。进一步证实了氯化钙分布在羧甲基壳聚糖无纺布中。如图3C的元素分布图所示，可以看到Si、Al、Ca三个特征元素存在，证实了高岭土与氯化钙两种止血剂均在无纺布上成功附着。不同止血剂的负载率结果如下表1所示。
表1.不同止血剂的负载效率
| 样品名称 | 高岭土浓度/wt％ | 氯化钙浓度/wt％ | 负载率/％ |
| CMCS2-1 | 0.3 | — | 58.0 |
| CMCS2-2 | 0.5 | — | 137.1 |
| CMCS2-3 | 1 | — | 190.9 |
| CMCS2-4 | 3 | — | 230.6 |
| CMCS2-5 | — | 0.2 | 34.6 |
| CMCS2-6 | — | 0.5 | 65.8 |
| CMCS2-7 | — | 1 | 107.3 |
| CMCS2-8 | — | 2 | 150.7 |
| CMCS2-9 | 1 | 0.5 | 245.9 |
| CS9 | 1 | 0.5 | 230.4 |
由表1结果可知，随着止血剂(高岭土溶液和氯化钙溶液)浓度的增加，相应止血剂在羧甲基壳聚糖无纺布的负载率也逐步增加。
(4)吸液能力
吸水率是止血材料很重要的一个指标，当吸水性好的材料与伤口处的血液接触时，可以通过物理作用吸收大量水分，浓缩凝血因子，从而起到加速止血的作用。这里采用比重法来测试无纺布样品的吸水率，首先将制备的CS、CMCS1、CMCS2、CMCS3试样进行干燥处理，将干燥后的样品称重记为m2，将样品浸泡在去离子水中至吸水饱和，用吸水纸除去样品表面的水分，称重记为m3，根据公式(1)计算不同样品的吸水率W。
由图4(a)结果可知，高岭土改性羧甲基壳聚糖无纺布具有非常高的吸水率，均可以吸收自身重量十五倍以上的水分。随着高岭土浓度的提高，负载在纤维上的高岭土微米颗粒越多，无纺布的吸水率增加，当高岭土溶液浓度大于1wt％后，吸水率随浓度的变化便不再明显，过高浓度的高岭土溶液会导致纤维之间的孔隙被堵塞。
由图4(b)结果可知，钙离子和壳聚糖螯合作用后也能吸附大量的水分，随着钙离子浓度的增加，无纺布的吸水率逐渐下降。总体分析改性后的无纱布能够在短时间内吸收大量的水分，符合止血材料的基本要求。
(5)溶血试验
溶血是指红细胞破裂，血红蛋白逸出的过程，溶血会对生物体的正常生理健康造成影响，因此医用材料要满足低溶血的要求。
具体测试步骤：将抗凝兔血在1000rpm条件下离心15min，除去上层中的富血小板血浆和白细胞，得到红细胞(RBC)。使用PBS溶液对RBC进行多次(2000rpm，5min)洗涤，直至上清液呈无色透明状态。然后将RBC稀释成5％RBC悬浊液备用。将5mg待测样品(CMCS2-1～CMCS2-9和CS9样品)和1mL的5％RBC悬浮液加入到离心管中，37℃条件下孵育2h。阳性对照组为RBC加入到去离子水中，阴性对照组为将RBC加入到PBS缓冲溶液中。孵育完成后，离心除去红细胞，取100μL上清液置96孔板中，使用酶标仪测定540nm处血红蛋白的吸光度。根据下式(2)测定不同样品的溶血率H：
式中，ODt为实验组吸光度值；ODn为阴性对照组吸光度值；ODp为阳性对照组吸光度值。不同样品的溶血率结果如图5A(a)、图5A(b)和图5B所示。
如图5A(a)所示，CMCS2-1、CMCS2-2、CMCS2-3、CMCS2-4的溶血率均非常低，数值上均小于2％，说明了负载高岭土的羧甲基壳聚糖止血材料不会引起红细胞溶血，符合生物医用材料的基本要求。
如图5A(b)所示，CMCS2-5、CMCS2-6的溶血率均小于2％，CMCS2-7、CMCS2-8溶血率分别为6.4％、8.5％。该实验结果表明，当Ca2+浓度过高时会导致明显溶血。因此，为满足血液相容性，羧甲基无纺布中Ca2+含量应该控制在较低的范围，即用于改性处理无纺布的氯化钙溶液浓度不应高于1wt％。
如图5B所示，CS9、CMCS2-9的溶血率均远小于2％，说明了同时负载高岭土和钙离子的羧甲基壳聚糖止血材料不会引起明显的红细胞溶血，该无纺布具有良好的血液相容性。
(6)体外止血性能表征
体外凝血时间(BCT)是指血液与止血材料接触到凝血所需要的时间，BCT可以直观检测出止血材料对止血的影响，是最能直观看出止血材料止血效果的一个指标。
BCT的测定步骤如下：分别裁剪3mg的CMCS2-1～CMCS2-9、CS9、商用Quikclot样品试样，加入到15mL离心管中。将300μL抗凝兔血滴加到试样上，将离心管放置在恒温环境中反应2min。随后移取30μL 0.2mol/L的CaCl2溶液到离心管中，氯化钙溶液的作用是与血液中的抗凝剂成分反应，使血液恢复正常状态。加入氯化钙后开始计时，并不时倾斜离心管，观察血液的动态变化。当离心管中的血液彻底不再流动时为完全凝血，此时记录下整个过程所需要的时间。
凝血指数(BCI)是反应凝血效果的一个指标，其实际意义表示血液与止血材料充分作用后，没参与凝血过程的血细胞被去离子水涨破所释放的血红蛋白的含量。BCI数值越高，说明血红蛋白含量越多，未参与凝血的血细胞越多，凝血效果越差，形成的凝血块稳定性越差。
BCI的测定步骤如下：分别裁剪3mg的CMCS2-1～CMCS2-9、CS9、商用Quikclot样品试样，加入15mL离心管中，在每一组止血材料上滴加100μL血液，将离心管放置在恒温环境中反应2min，加入与上述凝血时间步骤中等浓度的氯化钙溶液10μL。将离心管放置到恒温摇床中反应10min。当血液与止血材料反应结束后加入10mL去离子水，等待10min。阳性对照组为去离子水加入到全血溶液中，阴性对照组为将PBS缓冲溶液加入到全血中。将离心管静置一段时间，取200μL上清液于96孔板中，使用酶标仪测试在540nm处血红蛋白的吸光度。根据公式(3)测定BCI结果：
式中，ODa为待测试样组吸光度值；ODb为阳性对照组吸光度值；ODc为阴性对照组吸光度值。
实验结果：由图6A(a)结果可知，不加任何材料的空白组止血时间在544s左右，商用的止血海绵止血时间为177s，高岭土溶液改性处理后得到的CMCS2-1、CMCS2-2、CMCS2-3、CMCS2-4的体外凝血时间均比止血海绵要短，止血效果最好的是CMCS2-3、CMCS2-4两组样品，止血时间为67s，比空白组缩短了477s，比商用的止血海绵缩短了110s。从试验结果还可以看出，当高岭土溶液浓度比较低时，随着浓度提升，止血效果也更好，当浓度大于1％后，浓度再增加，对止血的影响变得不显著，因此选取1％高岭土溶液作为最佳止血剂浓度。凝血指数试验结果如图6A(b)所示，由图6A(b)结果可知，BCI越小，说明无纺布的止血效果越好，形成的血凝块越稳固，与空白组相比，止血海绵的BCI缩短了71.1％，CMCS2-3、CMCS2-4分别比空白组缩短了89.4％和89.6％，说明两者的止血效果较好。BCI的试验结果与BCT的试验结果具有一致性，均说明CMCS2-3、CMCS2-4具有很好的体外止血能力。
由图6B(c)可知，氯化钙改性处理得到的CMCS2-5、CMCS2-6的止血时间比商用的止血海绵短，CMCS2-5止血时间为145s，CMCS2-6止血时间为114s，实验结果说明，在浓度较低时，随着钙离子浓度增加，材料的止血效果也会增加。但是从图中可以看出CMCS2-7、CMCS2-8的止血时间超过了空白组，说明这两组样品对止血产生了一定的抑制作用，并且钙离子的浓度越高，对止血的抑制作用也越强。凝血指数试验结果如图6B(d)所示，由图6B(d)结果可知，CMCS2-5、CMCS2-6凝血指数低于商用的止血海绵，CMCS2-7、CMCS2-8的凝血指数大于商用的止血海绵。综上结果可以看出，过高浓度的钙离子会对止血产生一定的抑制作用，原因是钙离子携带正电荷，钙离子含量过高时，会导致红细胞破裂，从而抑制了凝血过程。
由图6C(a)可知，高岭土和氯化钙复合改性处理后得到的CS9和CMCS2-9与商用的Quikclot的凝血时间远远小于空白对照组，说明这三种止血材料的体外止血效果均很出色。CS9的凝血时间为55s，比空白对照缩短了489s。CMCS2-9的凝血时间为47s，比空白对照组缩短了497s。商用的Quikclot凝血时间为76s，比空白组缩短了468s。CMCS2-9的体外凝血时间最短，凝血效果最好。
凝血指数试验结果如图6C(b)所示，由图6C(b)可知，CS9、CMCS2-9、商用的Quikclot的凝血指数数值远远低于空白组，说明这三种试样的止血效果都非常优异，止血效果稳定，形成的凝血块稳定牢固。CS9的BCI为8.5％，比空白组缩短了87％，比商用的Quikclot组缩短了6.8％。CMCS2-9组的BCI为7.8％，比空白组缩短了87.7％，比Quikclot组缩短了7.5％。综合来看，CS9、CMCS2-9均具有非常好的体外止血效果，形成的凝血块均具有很好的稳定性。
(7)APTT和PT
APTT是评估内源性凝血途径的指标，止血材料对内源性凝血途径的影响可以用APTT来表征，PT是评价外源性凝血途径的指标。通过APTT和PT试剂盒检测样品CMCS2-1～CMCS2-9、CS9以及商用Quikclot的止血机制。
APTT的测定步骤如下：准备活化部分凝血活酶时间测定试剂盒。取抗凝兔全血进行离心制备PPP，将APTT鞣花酸溶液加热至室温，混合均匀，取PPP、APTT鞣花酸溶液各0.1ml置于离心管种混匀，然后加入3mg待测样品。将离心管置于37℃恒温培养5min。最后加入保温在37℃的CaCl2(25mM)0.1ml引发反向并进行计时，过程中需要不断震荡离心管，直到离心管中出现白色的不溶物，记录整个过程所需要的时间t，以不添加止血材料得到的实验时间t0作为空白对照。根据公式(4)测定APTT：
PT的测定步骤如下：首先购买上海太阳生物技术有限公司生产的凝血酶原时间测定试剂盒。按照之前的方法得到PPP。将PT凝血活酶溶液预热至室温，混匀，取PPP、PT凝血活酶溶液各0.1ml在离心管中混匀，加入3mg待测样品。置于37℃恒温水浴锅中孵育5min。然后加入恒温37℃的CaCl2(25mM)0.1ml引发反应并进行计时，过程中持续震荡离心管，直到离心管中出现白色的不溶物，记录整个过程所需要的时间tb，以不添加止血材料测得的时间ta作为空白对照。根据公式(4)测定PT：
实验结果：由图7A(a)结果可知，CMCS2-1、CMCS2-2、CMCS2-3、CMCS2-4的APTT时间与空白对照组相比显著降低，止血海绵的APTT与空白组相比没有显著差异，说明止血海绵不影响内源性凝血途径。与空白组APTT相比CMCS2-1缩短了32.8％，CMCS2-2缩短了46.2％，CMCS2-3缩短了53.7％，CMCS2-4缩短了56.3％。结果说明高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料是通过促进内源性凝血途径来加速止血过程的，并且高岭土的浓度越高，对内源性凝血过程的促进程度越快，这也证明了高岭土止血剂是通过激活内源性凝血系统从而促进止血。在血浆中加入组织凝血活酶，在钙离子辅助作用下，生成纤维蛋白凝块的时间为PT。由图7A(b)结果可知，与空白组相比，高岭土溶液改性处理后得到的各组试样的PT结果没有显著差异。随着高岭土浓度的增加，PT时间会有微小的缩短，原因是高岭土成分中含有微量的钙元素，钙离子可以促进外源性凝血途径。整体上看，CMCS2-1～CMCS2-4对外源性凝血途径的影响不大。上述APTT与PT试验结果表明，高岭土可以促进内源性凝血途径从而加速止血，综合考虑CMCS2-3试样的止血效果最佳。
由图7B(c)结果可知，与空白对照组相比，CMCS2-5的APTT缩短了15.5％，CMCS2-6的APTT缩短了15.6％，证明了低浓度的钙离子可以通过加速激活内源性凝血途径进一步加速止血过程。但是从CMCS2-7、CMCS2-8的结果可以看出，钙离子浓度过高时，其促进作用消失。由图7B(d)结果可知，CMCS2-5的PT结果缩短了14.7％，CMCS2-6的PT结果缩短了29.8％，说明钙离子同时可以激活外源性凝血途径从而加速止血，并且当浓度过高时，其加速止血的作用便不存在。综上分析，低浓度的钙离子既可以参与内源性凝血也能参与外源性凝血，钙离子浓度过高时，便不再发挥作用。止血效果最佳的是CMCS2-6试样。
由图7C(a)结果可知，与空白组相比，CS9的APTT结果缩短了62.4％，CMCS2-9缩短了64.6％，商用Quikclot缩短了52.2％。实验结果说明了这三组试样是通过促进内源性凝血途径来加速止血过程的。这也解释了高岭土止血的机理：当血液与带负电的高岭土分子接触时，凝血因子Ⅻ被激活为Ⅻa，然后逐步激活凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅹ。最后产生凝血酶，形成纤维蛋白凝血块，促进血液凝固。
由图7C(b)结果可知，CS9、CMCS2-9可以降低PT时间，CS9、CMCS2-9分别比空白对照组降低了34.6％和39.3％，CMCS2-9比商用Quikclot降低了10.2％。实验结果说明，高岭土和钙离子复合改性处理后得到的壳聚糖无纺布和羧甲基壳聚糖止血材料还可以促进外源性凝血途径，促进止血过程。
(8)体内止血效果表征
通过SD大鼠肝脏损伤实验检测材料的体内止血性能。实验前，SD大鼠在标准的饲养环境中饲养3天，确保SD大鼠处于正常状态，然后称重记录。手术前，采用10％(w/v)水合氯醛溶液对SD大鼠进行麻醉，用药量为0.5ml/100g。准备止血所需的材料：CS9、CMCS2-9、商用Quikclot，称重并记录m0。实验在恒温条件下进行，排除温度变化对大鼠的影响。首先对SD大鼠进行脱毛处理，然后沿SD大鼠的腹白线剪开并暴露肝脏。用手术刀(23#刀片)在SD大鼠肝脏部位划开致命的十字伤口，伤口约1.5cm长，0.3cm深。出血3s后在伤口部位施加止血材料，并记录止血时间和吸收血液后的材料重量m1，每组材料进行三次实验。实验采用未施加任何止血材料的肝损伤模型作为空白对照组。根据公式(5)计算出血量Q：
Q＝m1-m0 (5)
实验结果：大鼠肝脏损伤止血模型的止血时间和出血量如图8所示，由图8结果可知，空白组的止血时间为347s，出血量为0.84g。商用Quikclot组试样的止血时间为59s，出血量为0.28g。CS9试样止血时间为48s，比空白组缩短了299s，比商用Quikclot组缩短了11s。CS9组出血量为0.21g，比空白组减少了0.63g，比商用Quikclot组减少了0.07g。CMCS2-9组止血时间为37s，比空白组缩短了310s，比Quikclot组缩短了22s。CMCS2-9组出血量为0.19g，比空白组减少了0.65g，比商用Quikclot组减少了0.09g。通过试验数据的对比可以看出，CS9、CMCS2-9试样的体内止血效果均非常出色，止血效果要优于商用Quikclot试样。止血效果出色的原因是高岭土和钙离子通过促进外源性和内源性凝血途径加速止血过程，壳聚糖促进红细胞聚集并激活血小板起作用，此外因为其较好的吸水性，可以在短时间内吸收血液中水分，浓缩血细胞和凝血因子。体内止血试验表明，CMCS2-9试样具有很好的体内止血性能，具有临床应用的潜力。综合分析可以看出，研究制备的止血材料CMCS2-9不仅能促进内源性凝血途径还可以促进外源性凝血途径，促进作用要大于商用材料Quikclot。
(9)细胞毒性实验
细胞相容性是医用材料应用于临床必须要满足的条件，理想的止血产品应该具有低毒性和良好的细胞相容性。很多止血效果出色的止血剂因不具备细胞相容性而被淘汰。CS9、CMCS2-9、商用Quikclot的细胞毒性的测试结果如图9所示。
由图9结果可知，CS9、CMCS2-9、商用Quikclot的细胞存活率分别为95.4％、93.8％、95.6％，虽然细胞的存活率低于空白对照组，但是三种止血材料的细胞存活率均大于90％，可以认为CS9、CMCS2-9不具有细胞毒性，具有细胞相容性。
综上，本发明以壳聚糖纤维为原料，首先对其羧甲基化处理，然后分别使用高岭土与钙离子两种止血剂对羧甲基壳聚糖无纺布的止血性能进行改性处理。
(1)通过元素分析可以检测出高岭土中的特征元素Si、Al的存在，也证明了Ca2+与壳聚糖通过螯合作用结合。通过吸液能力试验得到，负载不同浓度高岭土改性处理后的羧甲基壳聚糖无纺布均可以吸收自身10倍以上的水分，并且可以吸收大量的血液。通过溶血试验检测出各试样的溶血率均小于2％，可认为试样均具有良好的血液相容性。通过体外凝血试验结果可说明高岭土在加速止血过程中起到关键的作用。通过APTT试验结果可得出，各试样是通过促进内源性凝血途径来加速止血过程的，并且高岭土的浓度越高，对内源性凝血的促进越快。综合所有结果得出，1wt％高岭土溶液处理羧甲基无纺布为最佳浓度，得到的试样综合止血性能最优异，同时不会造成材料的浪费。
通过吸液能力试验结果可得，负载不同钙离子的各试样均具有优异的吸水性，通过溶血试验发现，当处理的钙离子浓度过高(＞1％)时，会导致溶血发生，钙离子浓度较低处理的无纺布符合血液相容性的要求。通过体外凝血时间结果可得出，在钙离子浓度较低时，随着钙离子浓度增加，各试样的止血效果也会增加。通过凝血机制试验可证明低浓度的钙离子可以通过加速激活内源性凝血途径进一步加速止血过程。PT试验结果说明钙离子也可以激活外源性凝血途径从而加速止血，并且当浓度过高时，其加速止血的作用消失。综合分析，选择钙离子止血剂时应该严格控制钙离子的量，0.5％氯化钙溶液处理羧甲基无纺布为最佳浓度，得到的试样具有最佳的止血性能。
(3)本发明还使用高岭土与钙离子两种止血剂同时对羧甲基壳聚糖无纺布复合改性，以对止血性能进行提升，通过元素分析和红外光谱分析可以检测出高岭土中的特征元素硅、铝的存在，也证明了钙离子与壳聚糖通过螯合作用结合。通过体外止血实验证明CMCS2-9材料具有很好的体外止血效果，能够在1分钟内完成止血，并形成稳定的血凝块。通过利用SD大鼠肝脏损伤止血模型证明了复合改性的CMCS2-9试样具有优异的体内止血性能。其体内止血时间为37s，出血量为0.19g。进而得出CMCS2-9试样不仅可以缩短止血时间，还可以减少出血量。APTT和PT实验证明CMCS2-9试样可以促进内源性凝血途径和外源性凝血途径，从而加速凝血过程。通过溶血试验得到CMCS2-9试样的溶血率小于2％。通过细胞毒性实验检测出CMCS2-9试样不具有细胞毒性。综上所述，经过高岭土和氯化钙改性后的羧甲基壳聚糖止血材料，止血性能优异，生物相容性好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，其制备步骤包括：首先对壳聚糖纤维进行羧甲基化改性，得到羧甲基壳聚糖纤维，然后采用止血剂对羧甲基壳聚糖纤维进行改性，得到改性羧甲基壳聚糖止血材料；其中，所述止血剂为高岭土和Ca2+中的一种或者两种的组合。
2.根据权利要求1所述的改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以壳聚糖纤维为原料，通过水刺工艺制备壳聚糖无纺布；
S2、对制备的壳聚糖无纺布进行羧甲基化改性，得到羧甲基壳聚糖无纺布；
S3、采用止血剂对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到改性羧甲基壳聚糖止血材料；
其中，所述止血剂为高岭土和Ca2+中的一种或者两种的组合。
3.根据权利要求2所述的改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述以壳聚糖纤维为原料，通过水刺工艺制备壳聚糖无纺布，具体步骤为：
A11、将壳聚糖纺丝溶液进行加压，然后加入到纺丝机中纺丝，制备壳聚糖纤维；
A12、将制备的壳聚糖纤维进行裁剪，然后使用梳理机对壳聚糖短纤维进行梳理，得到絮状纤维；
A13、将得到的絮状纤维放置到铺网机上铺成纤维网，进行牵伸、预湿，预湿后进行正反水刺加工，最后进行后整理、烘干、卷绕处理，得到壳聚糖无纺布。
4.根据权利要求2所述的改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述对制备的壳聚糖无纺布进行羧甲基化改性，得到羧甲基壳聚糖无纺布，具体步骤为：
A21、将壳聚糖无纺布裁剪后置于反应容器中，然后向反应容器中加入氢氧化钠和异丙醇的水溶液，进行溶胀和碱化0.5-2h；
A22、向反应容器中加入氯乙酸，加热至50-60℃，保温反应20-35min，洗涤，干燥，得到羧甲基壳聚糖无纺布。
5.根据权利要求2所述的改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，采用高岭土作为止血剂，对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到改性羧甲基壳聚糖止血材料，具体步骤为：
A31、配制浓度为0.1-0.5wt％的
溶液，加入高岭土，得到高岭土溶液，搅拌反应0.5h；
A32、将制得的羧甲基壳聚糖无纺布加入到上述溶液中，浸渍0.2-2h后取出，干燥，得到高岭土改性羧甲基壳聚糖止血材料。
6.根据权利要求2所述的改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，采用Ca2+作为止血剂，对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，具体步骤为：
B31、配制浓度为0.1-0.5wt％的
溶液，加入氯化钙搅拌，得到氯化钙溶液；
B32、将制得的羧甲基壳聚糖无纺布加入到上述氯化钙溶液中，浸渍0.2-2h后取出，干燥，得到Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料。
7.根据权利要求2所述的改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，同时采用高岭土和Ca2+作为止血剂，对制得的羧甲基壳聚糖无纺布进行改性，得到高岭土/Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料，具体步骤为：
C31、配制质量分数0.1-0.5wt％的
溶液，加入高岭土搅拌，得到高岭土溶液；
C32、再加入氯化钙溶液搅拌，将制得的羧甲基壳聚糖无纺布加入到上述溶液中，浸渍0.2-2h后取出，干燥，得到高岭土/Ca2+改性羧甲基壳聚糖止血材料。
8.根据权利要求5或7所述的改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，所述高岭土溶液的浓度为0.3-3wt％，进一步优选为1wt％。
9.根据权利要求6或7所述的改性羧甲基壳聚糖止血材料的制备方法，其特征在于，所述氯化钙溶液的浓度为0.2-1wt％，进一步优选为0.5wt％。
10.一种改性羧甲基壳聚糖止血材料，其特征在于，由如权利要求1-9任一项所述制备方法制得。
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