CN115814096A - 自载体球形多肽纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种自载体球形多肽纳米颗粒及其制备方法和应用。该自载体球形多肽纳米颗粒是由多个单体分子自组装形成的的具有3D结构的球形纳米多肽，所述单体分子包含疏水性分子和亲水性多肽分子，所述疏水性分子在所述球形纳米多肽的内侧，所述亲水性多肽分子在所述球形纳米多肽的外侧。所述亲水性多肽分子选自多肽抗原分子、靶向分子和穿膜肽分子中的至少一种。本申请自载体球形多肽纳米颗粒可在肿瘤部位蓄积或靶向药物递送至肿瘤细胞或其它细胞，增强药物的治疗效果。
Description
技术领域
本申请涉及药物制备技术领域，特别涉及一种自载体球形多肽纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，肿瘤已经成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。传统的手术、化疗和放疗等单一治疗方法常常难以达到理想的治疗效果，肿瘤免疫治疗逐步走进人们的视野。肿瘤免疫治疗是通过激活机体的抗肿瘤免疫反应对肿瘤细胞进行杀伤，以达到控制肿瘤生长与清除肿瘤的目的的治疗方法。目前，免疫治疗主要分为以下几类：免疫检查点抑制剂疗法、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法、肿瘤疫苗治疗、溶瘤病毒疗法和双特异性抗体治疗等。
肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗中的重要组成部分，其原理是将多种形式的肿瘤抗原(例如肿瘤抗原相关基因、肿瘤相关抗原或多肽、肿瘤细胞等)导入患者体内，打破肿瘤免疫抑制状态，重新激活机体的体液免疫和细胞免疫应答。而传统纳米多肽颗粒作为肿瘤疫苗是将多肽抗原分子包裹在纳米载体中进行递送，这样难以确保抗原的负载量。而且药物递送纳米载体的靶向性和递送效果难以达到理想要求。
发明内容
基于此，有必要针对传统的纳米颗粒的抗原负载量低及药物递送纳米载体靶向性和递送效果差等问题，提供一种自载体球形多肽纳米颗粒，该自载体球形多肽纳米颗粒是将疏水性分子与亲水性多肽分子直接连接形成两亲性单体分子，并以此作为基元，通过自组装制备而成自载体球形多肽纳米颗粒。
具体技术方案如下：
本申请的第一方面，提供一种自载体球形多肽纳米颗粒，是由多个单体分子自组装形成的具有3D结构的球形纳米多肽，所述单体分子包含疏水性分子和亲水性多肽分子，所述疏水性分子在所述球形纳米多肽的内侧，所述亲水性多肽分子在所述球形纳米多肽的外侧，所述亲水性多肽分子包括多肽抗原分子、靶向分子和穿膜肽分子中的至少一种。
其中一个实施例中，所述疏水性分子与亲水性多肽分子直接相连；可选地，通过酰胺键或二硫键化学键相连。
其中一个实施例中，所述疏水性分子包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(磷脂DOPE)、单磷酰脂质A(MPLA)、瑞喹莫德(佐剂R848)和咪喹莫特中的至少一种。
其中一个实施例中，所述亲水性多肽分子还包括环境响应性分子。
可选地，所述亲水性多肽分子选自多肽抗原分子或靶向分子或穿膜肽分子。
可选地，所述亲水性多肽分子选自环境响应性分子和多肽抗原，或选自环境响应性分子和靶向分子。
其中一个实施例中，所述多肽抗原分子包括前列腺特异抗原(PSA)、前列腺特异膜抗原(PSMA)、粘蛋白-1(MUC-1)、黑色素瘤相关抗原(gp100)、与肿瘤转移相关的新生血管有关的纤连蛋白(ED-A)和抗细胞凋亡蛋白(Survivin)中的至少一种。
所述靶向分子包括血管紧张素Ⅰ受体多肽分子AT1、整合素αvβ3受体分子iRGD、肿瘤新生血管靶向肽NGR中的至少一种。
所述穿膜肽分子包括转录反式激活蛋白(TAT)、PH响应性穿膜肽(TH)、膜型两亲性肽MPG中的至少一种。
所述环境响应性分子包括基质金属蛋白酶响应性多肽、谷胱甘肽响应性分子、酶解α-乳白蛋白多肽、H2O2响应性分子中的至少一种。
其中一个实施例中，所述自载体球形多肽纳米颗粒的内部还包载抗原分子、内涵体逃逸分子、佐剂分子和亲水性化疗药物中的一种或多种。
可选地，所述抗原分子包括PSA、PSMA和MUC-1多肽中的至少一种；
可选地，所述内涵体逃逸分子包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽中的至少一种。
可选地，所述佐剂分子包括CpG ODN、QS21、IL-1、IL-2和IFN-γ中的至少一种。
可选地，所述亲水性化疗药物包括紫杉醇、阿霉素和吉西他滨中的至少一种。
其中一个实施例中，所述自载体球形多肽纳米颗粒包括所述单体分子的种类为一种或多种。
本申请的第二方面，提供上述任一项所述自载体球形多肽纳米颗粒的制备方法，包括将亲水性多肽分子与疏水性分子直接相连形成自载体球形多肽纳米颗粒。
其中一个实施例中，所述自载体球形多肽纳米颗粒的制备方法还包括所述纳米颗粒将抗原分子、内涵体逃逸分子、佐剂分子和亲水性化疗药物中的一种或多种进行包载。
本申请的第三方面，提供上述的自载体球形多肽纳米颗粒在制备疾病治疗的纳米制剂中的应用。
与现有技术相比较，本申请具有如下有益效果：
本申请提供的自载体球形多肽纳米颗粒，是由多个单体分子自组装形成的具有3D结构的球形纳米多肽；单体分子包含疏水性分子和亲水性多肽分子；疏水性分子在球形纳米多肽的内侧，亲水性多肽分子在球形纳米多肽的外侧；亲水性多肽分子包含多肽抗原分子、靶向分子和穿膜肽分子中的至少一种。
进一步地，亲水性多肽分子包含多肽抗原作为自载体分子构成球形多肽纳米颗粒，可作为多肽纳米疫苗使用，实现抗原的精确负载和提高疫苗的疗效。同时，该纳米颗粒经静脉注射或皮下注射入机体后，由于EPR效应和靶向性可在肿瘤部位良好蓄积，作用于肿瘤微环境中的免疫细胞，且其自身可作为抗原肽和疏水性佐剂分子共同构建的具有佐剂功能的自载体纳米颗粒，能够实现抗原佐剂共递送至抗原提呈细胞，激活机体的抗原特异性免疫反应，抑制肿瘤的生长。
进一步地，亲水性多肽分子还可以替换任意功能性多肽，如由穿膜肽分子构建的球形穿膜肽纳米颗粒，作为药物纳米递送载体，可大大提高所载药物的递送效率；而由靶向多肽分子形成的球形多肽纳米颗粒，可以作为纳米载体负载其它的药物或者mRNA进行靶向递送，可大幅度提高负载mRNA或其它药物的靶向递送效率，实现高效靶向递送。
更进一步，本申请的自载体球形多肽纳米颗粒制备方法操作简单，合成效率高，且合成后的多肽纳米颗粒稳定，不易聚集。
附图说明
图1为本发明一实施例MPLA-MUC1的纳米颗粒粒径分布图，其中，图1中的A为MPLA与MUC1不同摩尔比的粒径图，图1中的B为MPLA与MUC1摩尔比1:1时的粒径图；
图2为本发明一实施例DOPE-S-S-Survivin的纳米颗粒粒径分布图；
图3为本发明一实施例DOPE-谷胱甘肽响应性分子-gp100纳米颗粒透射电子显微镜图；
图4为本发明一实施例MPLA-MPG纳米颗粒透射电子显微镜图；
图5为本发明一实施例咪喹莫特-iRGD纳米颗粒的体外稳定性研究；
图6为本发明一实施例MPLA-PSMA纳米颗粒，其中，图6中的A为MPLA-PSMA纳米颗粒促进DC摄取抗原的情况；图6中的B为MPLA-PSMA纳米颗粒结构示意图；
图7本发明一实施例佐剂DOPE-AT1多肽包载细胞因子IL-2的纳米颗粒与Treg细胞孵育后细胞因子分泌情况；
图8为本发明一实施例R848-PSA纳米颗粒对BMDCs细胞的促成熟情况；
图9为本发明一实施例DOPE-MMP2-iRGD包载紫杉醇PTX构建的纳米制剂，其中图9中的A为DOPE-MMP2-iRGD包载紫杉醇PTX的纳米制剂对荷瘤小鼠肿瘤质量的影响；图9中的B为DOPE-MMP2-iRGD纳米颗粒的药物载量情况；
图10为本发明一实施例咪喹莫特-ED-A球形多肽纳米疫苗对荷瘤小鼠生存期变化的影响；
图11为本发明一实施例DOPE-S-S-TH包载吉西他滨的纳米疫苗对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将对本申请进行更详细的描述。但是，应当理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。出于说明本申请各种实施方式的目的给出如下实施例，并非意图以任何方式限制本申请。本领域技术人员将理解，如权利要求的范围所限定的，其中的变化和其它用途包括在本申请精神范围内。下列实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请一实施方式提供了一种自载体球形多肽纳米颗粒，是由多个单体分子自组装形成的具有3D结构的球形纳米多肽；单体分子包含疏水性分子和亲水性多肽分子；疏水性分子在所述球形纳米多肽的内侧，亲水性多肽分子在所述球形纳米多肽的外侧；亲水性多肽分子包括多肽抗原分子、靶向分子和穿膜肽分子中的至少一种。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子包括磷脂DOPE、单磷酰脂质A、佐剂R848及咪喹莫特中的至少一种。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子与亲水性多肽分子直接相连，可选地，可通过酰胺键或二硫键化学键直接相连。自载体球形多肽纳米颗粒被DC细胞摄取后可以以一整个纳米载体共同作用，也可断开化学键以个体形式分别作用。
可选地，亲水性多肽分子选自多肽抗原分子或靶向分子或穿膜肽分子。
在其中一个具体的示例中，亲水性多肽分子还包括环境响应性分子。
可选地，亲水性多肽分子选自环境响应性分子和多肽抗原，或选自环境响应性分子和靶向分子。
当亲水性多肽分子存在多种时，连接顺序会根据不同的目的进行不同的设计，例如依次连接疏水性分子-环境响应性分子-多肽抗原的球形多肽纳米颗粒，依次连接疏水性分子-环境响应性分子-靶向分子的球形多肽纳米颗粒，当球形多肽纳米颗粒进入体内时，靶向分子首先靶向到肿瘤细胞，随后MMP2断裂，化疗药被释放出来，起到杀伤肿瘤细胞的作用。
在其中一个具体的示例中，环境响应性分子选自基质金属蛋白酶响应性多肽、谷胱甘肽响应性分子、酶解α-乳白蛋白多肽、H2O2响应性分子中的至少一种，形成的球形多肽纳米颗粒作为纳米载体，可负载其它药物，实现环境响应性药物共递送，能够提高药物在体内的递送效率，实现靶向给药。
在其中一个具体的示例中，多肽抗原分子前列腺特异抗原、前列腺特异膜抗原、粘蛋白-1、黑色素瘤相关抗原gp100、与肿瘤转移相关的新生血管有关的纤连蛋白抗原多肽ED-A和抗细胞凋亡蛋白Survivin中的至少一种，形成球形多肽纳米疫苗。
在其中一个具体的示例中，靶向分子包括AT1、iRGD、LHRH、NGR、RVG、YIGSR中的至少一种，形成的球形多肽纳米颗粒可作为纳米载体进行靶向递送药物或基因。
在其中一个具体的示例中，穿膜肽分子包括TAT、TH、R9-TAT、K9、Pen和MPG中的至少一种，形成的球形多肽纳米颗粒可高效递送药物至肿瘤细胞或其他细胞，增强药物的治疗效果。
在其中一个具体的示例中，自载体球形多肽纳米颗粒的内部还可包载抗原分子、内涵体逃逸分子、佐剂分子和亲水性化疗药物中的一种或多种。自载体球形多肽纳米颗粒中加入化疗药，得到包载化疗药的多肽纳米制剂，能够有效地抑制肿瘤的生长。自载体球形多肽纳米颗粒与化疗药联合使用能够起到协同治疗的效果。
可选地，抗原分子包括PSA、PSMA和MUC-1多肽中的一种或多种。可选地，内涵体逃逸分子包括LLKKLLKKLLKK(SEQ ID NO.1)和LLHHLLHHLLHH(SEQ ID NO.2)中的一种或多种。可选地，佐剂分子包括CpG ODN、QS21、IL-1、IL-2和IFN-γ中的一种或多种。可选地，亲水性化疗药物包括紫杉醇、阿霉素及吉西他滨等中的一种或多种。
在其中一个具体的示例中，自载体球形多肽纳米颗粒包括单体分子的种类为一种或多种。
可选地，单体分子选自一种疏水性分子与一种多肽抗原；可选地，单体分子选自一种疏水性分子与靶向分子；可选地，单体分子选自一种疏水性分子与一种穿膜肽分子；可选地，单体分子选自一种疏水性分子与环境响应分子-多肽抗原；可选地，单体分子选自一种疏水性分子与环境响应分子-靶向分子。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自单磷酰脂质A，亲水性多肽分子选自MUC-1抗原，内部或可包载分子为结合内涵体逃逸分子的抗原分子(LLHHLLHHLLHHSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP，SEQ ID NO:3)。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自DOPE，亲水性多肽分子选自Survivin多肽抗原。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自DOPE，亲水性多肽分子选自H2O2响应性分子和gp100抗原。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自单磷酰脂质A，亲水性多肽分子选自膜型两亲性肽MPG。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自咪喹莫特，亲水性多肽分子选自iRGD穿膜肽。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自单磷酰脂质A，亲水性多肽分子选自PSMA抗原。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自DOPE，亲水性多肽分子选自血管紧张素Ⅰ受体多肽分子AT1并包载细胞因子IL-2。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自R848，亲水性多肽分子选自PSA抗原多肽。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自DOPE，亲水性多肽分子选自基质金属蛋白酶2MMP2和iRGD穿膜肽并包载化疗药紫杉醇。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自咪喹莫特，亲水性多肽分子选自与肿瘤转移相关的新生血管有关的纤连蛋白抗原ED-A抗原。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子选自DOPE，亲水性多肽分子选自PH响应性穿膜肽TH并包载化疗药吉西他滨。
可以理解的是，在其他具体示例中，自载体球形多肽纳米颗粒不限于上述所列举的，还可以为其他形式的自载体球形多肽纳米颗粒。
在其中一个具体的示例中，自载体球形多肽纳米颗粒的粒径可为80～500nm。可选地，自载体球形多肽纳米颗粒的粒径可为80～200nm，在此范围内自载体球形多肽纳米颗粒对疾病的治疗效果更好，具体粒径可以为80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm。
进一步，本申请一实施方式提供了上述的自载体球形多肽纳米颗粒的制备方法，包括将亲水性多肽分子与疏水性分子直接连接形成自载体球形多肽纳米颗粒。反应条件是在20℃～30℃下搅拌进行，反应时间为12小时～16小时。具体的，搅拌温度可以为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，反应时间可以为12小时、14小时、16小时。
进一步地，上述形成的自载体球形多肽纳米颗粒还可将抗原分子、内涵体逃逸分子、佐剂分子和亲水性化疗药物中的一种或多种进行包载。反应条件是在20℃～30℃下搅拌进行，反应时间为2小时～4小时。具体的，搅拌温度可以为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，反应时间可以为2小时、3小时、4小时。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子与亲水性多肽分子通过酰胺键或二硫键化学键直接相连。自载体球形多肽纳米颗粒被DC摄取后可以以一整个纳米载体共同作用，也可断开化学键以个体形式分别作用。
在其中一个具体的示例中，疏水性分子与亲水性多肽分子的摩尔比为(1:5)～(3:1)，优先地，该摩尔比为(1:1)～(1:4)，在此范围区间制备的自载体球形多肽纳米颗粒成球性更好，粒径均一稳定，分散均匀，具体摩尔比可以为1:1、1:2、1:3、1:4。
上述自载体球形多肽纳米颗粒可以作为疾病治疗的纳米制剂使用。可选地，疾病可以是肿瘤也可以是其他疾病。可选地，肿瘤治疗的纳米制剂包括肿瘤疫苗和纳米载体。
以下结合具体实施例对本申请的自载体球形多肽纳米颗粒及其制备方法做进一步详细的说明。
以下实施例中所涉及的多肽及其的氨基酸序列如下所示：
MUC1：APDTRPAPG，SEQ ID NO:4；
Survivin：LMLGEFLKL，SEQ ID NO:5；
gp100：YLEPGPVTA，SEQ ID NO:6；
MPG：GALFLGFLGAAGSTMGA，SEQ ID NO:7；
iRGD：CDPGKDGRC，SEQ ID NO:8；
PSMA：ESWTKKSPSPEFSGM，SEQ ID NO:9；
AT1：GGGGDRVYIHPF，SEQ ID NO:10；
PSA：VLSNDVCAQV，SEQ ID NO:11；
MMP2：GILGVP，SEQ ID NO:12；
TH：AGYLLGHINLHHLAHL，SEQ ID NO:13。
可理解，在其他实施例中，该自载体球形多肽纳米颗粒所使用的多肽及多肽的氨基酸序列不限于此。
实施例1 MPLA-MUC1纳米颗粒的制备
本申请自载体球形多肽纳米颗粒中疏水分子与亲水性多肽分子的摩尔比为(1:4)～(3:1)。以MPLA-MUC1纳米颗粒为例，将MPLA和MUC1按不同摩尔比例制备自载体球形多肽纳米颗粒，结果如图1中的A所示，按大于1:1和小于1:4的比例制备球形多肽纳米颗粒时，均不能形成粒径均一的纳米颗粒；按(1:1)～(1:4)比例制备MPLA-MUC1纳米颗粒时，纳米颗粒径为50～500nm，粒径均一稳定。
利用酰胺键制备MPLA-MUC1纳米颗粒的具体步骤示例如下：将单磷酰脂质A(MPLA)与N,N'-羰基二咪唑按照摩尔比1:(1～3)混合，室温反应2h以活化羟基，再加入与单磷酰脂质A相同摩尔的MUC1多肽，混合后，室温搅拌反应12h。透析收集分子量较大的物质，得到MPLA-MUC1纳米颗粒。通过马尔文粒径仪测量该纳米颗粒的粒径和电位，图1中的B显示其粒径为159.85±4.05nm，电位为-19.10±1.00。
实施例2磷脂DOPE-S-S-Survivin纳米颗粒的制备
利用二硫键构建还原响应性抗细胞凋亡蛋白Survivin纳米颗粒，具体操作步骤如下：(1)将磷脂DOPE和交联剂SPDP按照摩尔比1：1.5混合，室温反应4～8h，再加入3倍摩尔体积的还原剂二硫苏糖醇DTT，继续反应2小时后透析，冻干。(2)将抗细胞凋亡蛋白/多肽Survivin和交联剂SPDP按照摩尔比1：2混合，室温反应4～8h后透析、冻干。(3)将步骤(1)和(2)得到的冻干后的混合物按照摩尔比1：1.5混合，室温下搅拌反应24小时，透析后即为DOPE-S-S-Survivin纳米颗粒。如图2所示，该纳米颗粒粒径大小为85.23±5.34nm，电位-23.87±1.20。
实施例3磷脂DOPE-谷胱甘肽响应性分子-gp100纳米颗粒的制备
利用二硫键制备谷胱甘肽响应性肿瘤疫苗即DOPE-谷胱甘肽响应性分子-gp100纳米颗粒，操作原理如下：利用交联剂SPDP和还原剂二硫苏糖醇DTT将磷脂DOPE的氨基转变成巯基。再利用交联剂SPDP将谷胱甘肽响应性分子-gp100的氨基转化成吡啶二硫醇。将冻干后两种粉末按照摩尔比1：1.2混合，室温下搅拌反应24小时，透析后即为DOPE-谷胱甘肽响应性分子-gp100纳米颗粒。通过透射电镜下观察其形貌。如图3所示，该纳米颗粒呈大小均一、分散均匀的球形颗粒。
实施例4 MPLA-MPG纳米颗粒的制备
利用酰胺键将疏水性佐剂MPLA与穿膜肽MPG按摩尔比1：1构建MPLA-MPG纳米颗粒，具体步骤可参照实施例1。图4透射电镜结果显示该纳米粒镜下呈球状，分散性良好，粒径在200nm左右。
实施例5疏水性佐剂咪喹莫特-iRGD纳米颗粒制备及其体外稳定性研究
利用酰胺键将咪喹莫特和整合素αvβ3受体分子片段(iRGD)按照的摩尔比1:2制备咪喹莫特-iRGD纳米颗粒，透析后将该纳米粒置于4℃的PBS溶液中，每隔5天测量其粒径大小，以观察其稳定性。图5结果显示，该纳米颗粒能稳定存在30天以上，没有明显聚集和沉淀。
本申请其他实施例中所制备的多肽纳米颗粒的稳定性均能稳定存在30天以上。在此不再赘述。
实施例6疏水性佐剂MPLA-前列腺特异膜抗原PSMA纳米颗粒制备及其促进BMDCs摄取抗原的情况
利用酰胺键将MPLA和PSMA按照摩尔比1：3制备MPLA-PSMA纳米颗粒。为了探究MPLA-PSMA纳米颗粒能否促进BMDCs细胞对抗原的摄取，利用激光共聚焦显微镜(Leica,TCSSP5)观察标记FITC的MPLA-PSMA纳米颗粒在BMDCs中分布情况。全程避光操作，用同浓度的游离FITC-PSMA作对照。结果如图6中的A所示，MPLA-PSMA纳米颗粒能够显著促进BMDCs对PSMA的摄取。图6中的B为MPLA-PSMA纳米颗粒结构示意图。
本申请其他实施例中所制备的多肽纳米颗粒均能够显著促进BMDCs对抗原的摄取。在此不再赘述。
实施例7磷脂DOPE-AT1多肽包载细胞因子IL-2的纳米制剂的制备及其与Treg细胞孵育后细胞因子分泌情况
首先利用二硫键连接DOPE和血管紧张素受体I(AT1)靶向多肽构建还原响应性纳米递送载体DOPE-S-S-AT1纳米颗粒，再向DOPE-S-S-AT1溶液中加入一定量的细胞因子IL-2，剧烈振荡，然后用超滤管超滤，即得DOPE-AT1-IL-2NVs纳米制剂。图7结果显示该纳米制剂可显著增加心肌梗死小鼠体内抑制性T细胞Treg的增殖，促进抑制性细胞因子IL-10的分泌，促进心肌重塑。
其中，根据包封率＝[(全部IL-2量-游离IL-2量)/全部IL-2量]×100％公式，计算出IL-2的包封率为25.4±3.6％。
实施例8佐剂R848-前列腺特异抗原PSA纳米颗粒对BMDCs细胞的促成熟情况
利用酰胺键将佐剂分子R848和前列腺抗原PSA按照摩尔比1:1.5反应构建R848-PSA纳米颗粒。使用流式细胞术检测该纳米颗粒对于BMDCs细胞促成熟情况，结果如图8所示，经过R848-PSA纳米颗粒处理过的细胞，共刺激分子CD40、CD80的表达水平明显提高，这说明R848-PSA纳米颗粒能够较好地促进BMDCs的成熟。
本申请其他实施例中所制备的多肽纳米颗粒均能够较好地促进BMDCs的成熟。在此不再赘述。
实施例9磷脂DOPE-MMP2-iRGD包载紫杉醇PTX纳米颗粒的制备及其对荷瘤小鼠肿瘤质量的影响
通过化学合成DOPE-MMP2-iRGD纳米颗粒(具体参照实施例3)并将化疗药紫杉醇PTX投入反应液中剧烈振荡，超滤后即得具有肿瘤靶向的球形多肽纳米制剂，可高效递送化疗药物PTX至肿瘤局部，显著抑制小鼠乳腺癌的生长，提高荷瘤小鼠的治疗效果(图9中的A)。DOPE-MMP2-iRGD包载PTX构建的纳米制剂组治疗的小鼠平均瘤重0.496±0.13g，明显低于其他三组(PBS组5.315±0.39g，Free PTX组2.07±0.13g)。
本申请制备的DOPE-MMP2-iRGD纳米颗粒内部包载化疗药进入体内，iRGD首先靶向到肿瘤细胞，随后MMP2断裂，化疗药被释放出来，起到杀伤肿瘤细胞的作用。与直接在外部连接化疗药物相比，本申请内部包载化疗药可以实现缓控释效果，药物载量更高(图9中的B)，除此之外，内部包载方法步骤简单、合成效率高，经济成本降低。
实施例10佐剂咪喹莫特-ED-A球形多肽纳米颗粒制备及其对荷瘤小鼠生存期变化的影响
利用酰胺键共价连接佐剂咪喹莫特与肿瘤转移相关的新生血管有关的纤连蛋白抗原ED-A，按摩尔比1:2构建肿瘤新生血管靶向纳米颗粒。当该纳米颗粒进入荷瘤小鼠的肿瘤组织后，激活抗原特异性免疫反应，可显著抑制肿瘤的血管生成，从而达到抑制肿瘤生长的效果。制备小鼠黑色素瘤模型,从给药当日起记录数据并绘制小鼠生存期变化曲线。结果如图10所示，咪喹莫特-ED-A纳米颗粒能有效地抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期。
实施例11 DOPE-S-S-TH包载吉西他滨的纳米制剂的制备及其对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响
利用TH具有pH敏感性的特性按照摩尔比DOPE:TH＝1：1制备pH响应性球形细胞穿膜肽纳米颗粒，包载化疗药吉西他滨制备纳米制剂。构建小鼠胰腺癌肿瘤模型，观察该纳米疫苗对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响。结果如图11所示，与其他三组相比，DOPE-S-S-TH包载吉西他滨的纳米疫苗显著的抑制了胰腺癌肿瘤的生长，具有良好的抗肿瘤疗效。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种自载体球形多肽纳米颗粒，其特征在于，是由多个单体分子自组装形成的具有3D结构的球形纳米多肽；所述单体分子包含疏水性分子和亲水性多肽分子；所述疏水性分子在所述球形纳米多肽的内侧，所述亲水性多肽分子在所述球形纳米多肽的外侧；所述亲水性多肽分子包括多肽抗原分子、靶向分子和穿膜肽分子中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的自载体球形多肽纳米颗粒，其特征在于，所述疏水性分子包括磷脂DOPE、单磷酰脂质A、佐剂R848和咪喹莫特中的至少一种；
所述亲水性多肽分子还包括环境响应性分子。
3.根据权利要求2所述的自载体球形多肽纳米颗粒，其特征在于，所述多肽抗原分子包括PSA、PSMA、MUC-1、gp100、ED-A和Survivin中的至少一种；
所述靶向分子包括AT1、iRGD、NGR中的至少一种；
所述穿膜肽分子包括TAT、TH、MPG中的至少一种；
所述环境响应性分子包括基质金属蛋白酶响应性多肽、谷胱甘肽响应性分子、酶解α-乳白蛋白多肽、H2O2响应性分子中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的自载体球形多肽纳米颗粒，其特征在于，所述自载体球形多肽纳米颗粒的内部还包载抗原分子、内涵体逃逸分子、佐剂分子和亲水性化疗药物中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的自载体球形多肽纳米颗粒，其特征在于，所述抗原分子包括PSA、PSMA和MUC-1多肽中的至少一种；
所述内涵体逃逸分子包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和氨基酸序列如SEQID NO.2所示的多肽中的至少一种；
所述佐剂分子包括CpG ODN、QS21、IL-1、IL-2和IFN-γ中的至少一种；
所述亲水性化疗药物包括紫杉醇、阿霉素和吉西他滨中的至少一种。
6.根据权利要求1-3任一项所述的自载体球形多肽纳米颗粒，其特征在于，所述疏水性分子与亲水性多肽分子直接相连；可选地，通过酰胺键或二硫键化学键直接相连。
7.根据权利要求1-3任一项所述的自载体球形多肽纳米颗粒，其特征在于，所述自载体球形多肽纳米颗粒包括所述单体分子的种类为一种或多种。
8.权利要求1-7任一项所述的自载体球形多肽纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括将亲水性多肽分子与疏水性分子直接相连形成自载体球形多肽纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的自载体球形多肽纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒与抗原分子、内涵体逃逸分子、佐剂分子和亲水性化疗药物中的一种或多种进行包载。
10.权利要求1-7任一项所述的自载体球形多肽纳米颗粒在制备疾病治疗的纳米制剂中的应用。
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2022
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