CN115814059A - 一种用于治疗膝骨关节炎的温敏水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于治疗膝骨关节炎的温敏水凝胶及其制备方法，所述温敏水凝胶包括250ng/ml DKK3蛋白、2wt％羟丁基壳聚糖和去离子水。本发明的温敏水凝胶针对于不适用全膝关节置换的早中期膝骨关节炎，DKK3可以延缓疾病进展，羟丁基壳聚糖缓释药物的同时提供适宜的微环境。其制备方法简单，使用方便。

Description

一种用于治疗膝骨关节炎的温敏水凝胶及其制备方法

技术领域

本申请涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种用于治疗膝骨关节炎的温敏水凝胶及其制备方法。

背景技术

膝骨关节炎是一种以膝关节软骨变性、破坏及关节边缘和软骨下骨骨赘形成为特征的慢性退行性疾病，其主要临床表现为膝关节周围疼痛、肿胀与活动范围受限，严重影响患者的生活质量。该病发病率逐年增加，且呈年轻化趋势。

膝骨关节炎的发病机制目前尚不明确，可能是遗传、炎症、机械和代谢等因素综合作用的结果，学界仍未有具有说服力的学说。目前膝骨关节炎的治疗手段包括理疗、口服药物、关节腔内注射药物、关节镜下清理和人工膝关节置换术。其中，人工膝关节置换术是唯一有效的治愈方法，但人工关节的使用寿命有限，不适用于早期KOA患者。而现行的关节腔注射药物最常见的是透明质酸钠，主要作用为润滑关节减小摩擦，对病情进展的改善不显著。

发明内容

本发明提供了一种用于治疗膝骨关节炎的温敏水凝胶，所述温敏水凝胶包括250ng/ml DKK3蛋白、2wt％羟丁基壳聚糖和去离子水。

本发明还提供一种前述温敏水凝胶的制备方法，包括：

(1)将羟丁基壳聚糖(HBC)溶解在去离子水中得到2wt％羟丁基壳聚糖水溶液，并在4℃下储存备用。

(2)在4℃的温度和搅拌条件下，将高浓度DKK3蛋白加入到步骤(1)制备的羟丁基壳聚糖溶液中，得到DKK3浓度为250ng/ml的HBC溶液(DKK3-loaded HBC)。

具体的，羟丁基壳聚糖的制备方法包括：

将壳聚糖碱化，分散在异丙醇水中，并与1，2-环氧丁烷混合。在室温下反应96小时后，除去过量的烷化剂和未反应的部分壳聚糖，并用丙酮彻底洗涤样品，在真空干燥器中以50℃干燥。

DKK3蛋白是DKK蛋白家族中的一种分泌性糖蛋白，主要调节经典Wnt信号通路，在调节组织发育、凋亡、增殖和免疫中发挥重要作用。DKK-3在其它组织的功能表明它可能是软骨细胞稳态和维持软骨完整性的重要介质。

壳聚糖的单体与蛋白聚糖主干透明质酸的单体一致，在关节腔内不会产生排异反应，其正电性使其可以方便地包载负电性的蛋白质类药物，以保护其免受酶的降解，延长蛋白质药物在体内的生物活性。在常温下，壳聚糖既不溶于水，也不溶于普通的有机溶剂，限制了其应用，通过合适的改性，使壳聚糖衍生物具有良好的溶解性，进一步构建水凝胶，是一种使其得到更广泛应用的有效策略。

羟丁基壳聚糖(HBC)是对壳聚糖分子链的羟基和氨基进行羟丁基化的衍生物，在细胞和动物中均表现出了较好的生物相容性。在低温下，HBC为黏度较低的液体，方便与药物混合，在关节腔注射过程中侵入较小，并且可以精准注射至病变较重部位，进入关节腔后，负载药物的HBC迅速凝胶，转变为半固态的药物贮库。

本发明的有益效果包括：

本发明针对于不适用全膝关节置换的早中期膝骨关节炎。DKK3可以延缓疾病进展，羟丁基壳聚糖缓释药物的同时提供适宜的微环境。其制备方法简单，使用方便，不同于现有的以对症治疗为主的方案，本发明制备的温敏水凝胶在疾病机制层面发挥效果。该凝胶系统不需要添加额外的交联剂，因而毒性较小，在溶胀状态下，水凝胶柔软且呈橡胶状，在很大程度上与活组织相似，提供几乎正常的软骨细胞生长环境，包载其中的DKK3在扩散作用和水凝胶崩解的双重作用下缓慢释出，将局部的药物浓度长期平稳保持在治疗窗口内，避免了峰谷现象。

附图说明

图1为不同浓度DKK3作用于软骨细胞的COL2A1蛋白印迹照片；

图2为不同浓度DKK3作用于软骨细胞的COL2A1免疫荧光照片；

图3为HBC溶液和DKK3-loaded HBC溶液的溶胶-凝胶转变示意图；

图4为DKK3和HBC浸取液作用于软骨细胞在1，3，5，7天的相对生存率；

图5为DKK3-loaded HBC的体外缓释曲线图；

图6为温敏水凝胶对骨关节炎组织修复的Micro-CT扫描三维重建图；

图7为温敏水凝胶对骨关节炎组织修复的H&E染色图；

图8为温敏水凝胶对骨关节炎组织修复的OARSI评分；

图9为温敏水凝胶对骨关节炎组织修复免疫组化染色图；

图10为温敏水凝胶抑制MMP-13、ADAMTS-5分泌和保护COL2A1、ACAN的定量评价。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、一种用于治疗膝骨关节炎的温敏水凝胶

温敏水凝胶包括250ng/ml DKK3蛋白、2wt％羟丁基壳聚糖和去离子水，其制备方法如下：

(1)将壳聚糖碱化，分散在异丙醇水中，并与1，2-环氧丁烷混合。在室温下反应96小时后，除去过量的烷化剂和未反应的部分壳聚糖，并用丙酮彻底洗涤样品，在真空干燥器中以50℃干燥，得到羟丁基壳聚糖(HBC)。将羟丁基壳聚糖(HBC)溶解在去离子水中得到2wt％羟丁基壳聚糖水溶液，并在4℃下储存备用。

(2)在4℃的温度和搅拌条件下，将高浓度DKK3蛋白(购于Abclonal公司(武汉))加入到步骤(1)制备的羟丁基壳聚糖溶液中，得到DKK3浓度为250ng/ml的HBC溶液(DKK3-loaded HBC)。

实施例2、不同DKK3含量的温敏水凝胶治疗膝骨关节炎的体外效果试验

从骨关节炎患者全膝关节置换下的胫骨平台分离人软骨细胞。将软骨细胞传代至P2种板，按照实施例1的方法分别配置DKK3浓度为125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的DKK3-loaded HBC溶液。将配置好的不同浓度的DKK3-loaded HBC溶液从低温处取出后迅速注射到骨关节炎患者的软骨细胞培养基内，以DKK3浓度为0ng/ml的HBC溶液为对照组(Ctrl)。干预2天取样。

不同浓度DKK3作用于软骨细胞的COL2A1蛋白印迹结果如图1所示，不同浓度DKK3作用于软骨细胞的COL2A1免疫荧光结果如图2所示。通过蛋白印迹和免疫荧光分析可见，250ng/ml处理组COL2A1表达最多。COL2A1是软骨基质二型胶原的主要成分，骨关节炎越重表达量越少,COL2A1表达最多，说明骨关节炎越轻，DKK3的治疗效果越好，因此温敏水凝胶中DKK3的浓度确定为250ng/ml。

实施例3、本发明温敏水凝胶的温敏特性及安全性试验

温敏特性试验

分别在4℃和37℃条件下观察实施例1步骤(1)制备的HBC溶液和步骤(2)制备的DKK3-loaded HBC溶液，结果如图3所示。从图3中可以看出，在4℃条件下HBC溶液和DKK3-loaded HBC溶液均为流动性良好的溶胶状在37℃条件下水凝胶展现为不可流动的固态凝胶。说明加入DKK3并未影响HBC的溶胶-凝胶转变特性。

安全性试验

将HBC溶液以1：4的比例浸入α-MEM中，在37℃下浸泡24h，得到HBC浸取液，收集其上清液作为100％HBC提取液(HBC extraction solution)，并稀释成两种不同浓度的25％(25％HBC extraction solution)和50％HBC(50％HBC extraction solution)提取液。使用DKK3和不同浓度的HBC浸取液培养软骨细胞进行CCK-8实验，计算软骨细胞在1，3，5，7天的相对生存率(RGR)，结果如图4所示。

从图4中可以看出，细胞生存率在90％以上，证明了DKK3和HBC的安全性。

实施例4、本发明温敏水凝胶的DKK3缓释情况检测

模拟人体温度，在37℃条件下孵育DKK3-loaded HBC溶液，每隔24小时收集释放介质并等体积更新，将收集到的释放介质进行ELISA实验，计算DKK3从DKK3-loaded HBC的释放曲线。结果如图5所示。

从图5中可以看出，DKK3在一天内快速释放，在七天内平稳释放。

实施例5、本发明温敏水凝胶的动物试验

将18只大鼠随机分为三组：

第1组：麻醉后切开大鼠右肢关节腔，找到前叉韧带不切断，缝合消毒，作为Ctrl(假手术组)；

第2组：麻醉后切开大鼠右肢关节腔，行前叉韧带离断术，消毒缝合，作为Model(OA造模)；

第3组：在OA造模4周后，每周注射一次0.1g DKK3-loaded HBC，注射三次，作为DKK3-loaded HBC。

一周后取材，进行Micro-CT、H&E染色、OARSI评分及免疫组化分析。

Micro-CT结果如图6所示，从图中可见，DKK-loaded HBC组减少了骨关节炎造模带来的溶骨性改变。

H&E染色结果如图7所示，从图中可见，DKK-loaded HBC减少了骨关节炎造模带来的软骨面损伤骨化，软骨退变和潮线模糊。

OARSI评分结果如图8所示，OARSI评分是基于关节软骨病理切片分析评分的方法。主要包括两个方面：关节软骨损伤及骨赘生成情况。评分越低代表骨关节炎越轻。

免疫组化染色结果如图9所示，其中COL2A1和ACAN是软骨基质的主要成分，在骨关节炎中被破坏，MMP-13和ADAMTS-5是COL2A1和ACAN的主要分解酶，在骨关节炎中表达增加。

温敏水凝胶抑制MMP-13、ADAMTS-5分泌和保护COL2A1、ACAN的定量评价结果如图10所示。

通过上述结果可以看出，采用本申请的水凝胶对骨关节炎有一定的治疗效果。

Claims (5)

1.一种用于治疗膝骨关节炎的温敏水凝胶，其特征在于，所述温敏水凝胶包括250ng/ml DKK3蛋白、2wt％羟丁基壳聚糖和去离子水。

2.根据权利要求1所述的温敏水凝胶，其特征在于，所述膝骨关节炎为早中期膝骨关节炎。

3.根据权利要求1所述的温敏水凝胶，其特征在于，将所述温敏水凝胶注射到骨关节炎患者的关节腔内使用。

4.权利要求1-3任一项所述的用于治疗膝骨关节炎的温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将羟丁基壳聚糖溶解在去离子水中得到2wt％羟丁基壳聚糖水溶液；

(2)在4℃的温度和搅拌条件下，将高浓度DKK3蛋白加入到步骤(1)制备的羟丁基壳聚糖溶液中，得到DKK3浓度为250ng/ml的HBC溶液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述羟丁基壳聚糖的制备方法如下：

将壳聚糖碱化，分散在异丙醇水中，并与1，2-环氧丁烷混合。在室温下反应96小时后，除去过量的烷化剂和未反应的部分壳聚糖，并用丙酮彻底洗涤样品，在真空干燥器中以50℃干燥。

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