CN115813938A - 果糖在制备增强细胞内激活的cGAS-STING天然免疫信号通路药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种果糖在制备增强细胞内激活的cGAS‑STING天然免疫信号通路的药物、增强干扰素IFNβ表达的药物、增强CXCL10表达的药物、抗HSV‑I感染药物、增强STING对IRF3的招募的药物中的应用。本发明还提供诱导KHK表达的物质在制备增强干扰素IFNβ表达的药物中的应用。

Description

果糖在制备增强细胞内激活的cGAS-STING天然免疫信号通路 药物中的应用

技术领域

本发明专利涉及医药技术领域，尤其是指果糖注射液在增强细胞内激活的cGAS-STING天然免疫信号通路中的应用。

背景技术

作为机体免疫防御的第一道防线，天然免疫在识别病原体方面发挥着关键的作用(Pandey etal,2014)。大多数模式识别受体都属于以下几种类型，包括：Toll样受体(tolllike receptor,TLR)、C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CLR)、维甲酸诱导基因甲酸诱导基因-Ⅰ(retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-I)样受体样受体(RIG-I likereceptor,RLR)、NOD样受体样受体(nucleotide binding oligomerization domain likereceptor,NLR)和环磷酸鸟苷和环磷酸鸟苷-腺苷合成酶腺苷合成酶(cGAS)(Chen et al,2016)。

在病原体入侵和繁殖的过程中其DNA会释放出来并且病原体的入侵也会影响原本正常的细胞导致细胞损伤细胞内的DNA也被释放出来。这些来自肿瘤细胞、死亡细胞、病毒、细菌和自身的游离于细胞质中DNA都会被细胞质中的cGAS有效识别，游离于细胞质中的DNA被识别后会在细胞质中与cGAS形成复合物，cGAS的活性位点发生构象变化，使得cGAS被活化(Mackenzie,etal,2017)。活化后的cGAS会以细胞质中的ATP和GTP为原料来合成环状磷酸鸟苷-磷酸腺苷(cGAMP)即成为了第二信使。cGAMP则与锚定在内质网上的干扰素基因刺激蛋白(Harding et al,2017)。随后结合了cGAMP的STING从内质网迁移到高尔基体，在此过程中STING会募集并激活TBK1和IRF3,进而诱导炎症因子的表达，增强了免疫反应(Ablasser,et al,2013)。

生命获得营养物质的两个最基本目的：一是维持生命，二是防御感染。因此，营养代谢和免疫炎症密切相关。在机体维持生存和抗感染过程中，免疫细胞不断改变和调整自己的状态，从而有效发挥免疫防御、免疫监视和免疫自稳功能，这常常需要代谢系统也作出相应的改变，以提供合适的能量和基础营养物质。同时，代谢系统的改变也会影响到免疫细胞发挥作用的程度和应对方式，这就使得免疫系统与基础代谢组织作为一个整体紧密关联，共同参与到人体各种生命活动过程中。

长期以来，免疫和代谢的研究学者们大多在各自的领域独自进行研究，很少有人关注到代谢与免疫的相互作用。直到2011年2月，《Nat Rev Immunol》杂志在评论中才第一次提出了代谢免疫学的概念，代谢免疫学作为现代医学一个新兴的领域才正式走入了人们的视野，目前已经是国际上研究的热点。

因此，提供一种调节天然免疫反应的物质显得很有必要。

发明内容

发明人在天然免疫信号通路、病毒复制与逃逸和细胞代谢之间的关系有较长时间的研究，之前的研究发现了乙型肝炎病毒(Hepatitis B)借助细胞糖代谢进行免疫逃逸的新机制。在当前的研究中，发明人发现果糖代谢在调节cGAS-STING介导的天然免疫反应中具有重大作用。

首先发明人发现当激活天然免疫cGAS-STING通路时，干扰素β和趋化因子CXCL10具有高表达。在随后的研究中，发明人还发现果糖注射液的加入可以增加HTDNA诱导的IFN-β和CXCL10的表达。随着果糖注射液处理时间及其浓度的增加，我们发现果糖注射液具有增强抑制单纯疱疹病毒I型的复制效果。

果糖是一种能量和体液补充剂。果糖比葡萄糖更易形成糖原，主要在肝脏通过果糖激酶代谢，易于代谢为乳酸，迅速转化为能量。在人体内果糖一般通过被动运输跨膜进入细胞。被转运至细胞内的果糖主要通过己酮糖激酶(Ketohexokinase,KHK)进行代谢。KHK也被称为果糖激酶，它将果糖磷酸化为1-磷酸果糖(F1P)，然后被醛缩酶B分解为磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛(GA)DHAP和GA都可以形成3-磷酸甘油醛(GA3P)以进入糖酵解来进行进一步的代谢。

在机制方面，发明人发现细胞经果糖处理和刺激物刺激后，KHK与STING具有相互作用并增强了STING对IRF3的招募从而增强了天然免疫信号通路。这一发现为抗病毒和增强干扰素、趋化因子的表达等研究提供了新思路。

本发明公开了果糖在增强细胞内激活的cGAS-STING天然免疫信号通路中的应用，果糖注射液的加入可以增加HTDNA诱导的IFN-β和CXCL10的表达。随着果糖处理时间及其浓度的增加，发明人发现果糖具有抑制单纯疱疹病毒I型的复制效果。通过分子生物学手段发明人发现经果糖处理和刺激物刺激后，细胞内KHK与STING具有相互作用并增强了STING对IRF3的招募从而增强了天然免疫信号通路。本项研究为果糖注射液进一步开发提供理论和实验基础并且发现果糖代谢与cGAS-STING天然免疫信号通路之间的联系。

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供果糖在制备增强细胞内激活的cGAS-STING天然免疫信号通路的药物中的应用。

在本发明的一个或多个实施例中，所述激活为经HTDNA或HSV-I刺激激活。

在本发明的第二方面，本发明提供果糖在制备增强干扰素IFNβ表达的药物中的应用。

在本发明的第三方面，本发明提供果糖在制备增强CXCL10表达的药物中的应用。

在本发明的第四方面，本发明提供果糖在制备抗HSV-I感染药物中的应用。

在本发明的第五方面，本发明提供果糖在制备增强STING对IRF3的招募的药物中的应用。

在本发明的一个或多个实施例中，所述药物制剂为颗粒剂、注射剂、胶囊剂中的一种。

在本发明的第六方面，本发明提供诱导KHK表达的物质在制备增强干扰素IFNβ表达的药物中的应用。

在本发明的第七方面，本发明提供KHK在制备增强干扰素IFNβ表达的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种果糖在制备增强细胞内激活的cGAS-STING天然免疫信号通路的药物、增强干扰素IFNβ表达的药物、增强CXCL10表达的药物、抗HSV-I感染药物、增强STING对IRF3的招募的药物中的应用。

2、本发明提供诱导KHK表达的物质在制备增强干扰素IFNβ表达的药物中的应用。

附图说明

图1为经HTDNA或HSV-I刺激激活THP-1细胞中cGAS-STING信号通路促进IFN-β和CXCL10表达的结果示意图。

图2为果糖可以促进HTDNA诱导的THP-1细胞中IFN-β和CXCL10表达的结果示意图。

图3为果糖处理浓度、处理时间对抑制HSV-I的复制的效果对比结果示意图。

图4为KHK与STING具有相互作用的结果示意图。

图5为含不同浓度(0、10、20、40mM)果糖的培养基培养HepG2细胞，细胞KHK和STING的蛋白表达水平比较结果示意图。

图6为KHK与STING细胞共定位的结果示意图。

图7为KHK促进STING招募IRF3的结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

实施例1：检测激活THP-1的cGAS-STING通路后会诱导表达的细胞因子和趋化因子

用PMA(10ng/ml)诱导THP-1细胞48小时后，换成完全培养基继续分化24小时，使悬浮的THP-1细胞分化为贴壁的巨噬细胞。分别向细胞中转染HTDNA(5μg/ml)6小时和12小时、用HSV-1感染细胞6小时和12小时。每孔加入1ml的Trizol，剧烈晃动，室温放置15-30分钟，让细胞裂解，之后用枪轻轻吹打，使裂解充分，并将裂解液吸出到1.5ml的EP管中，做好标记。每个管中加入200微升的三氯甲烷，剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟。于冷冻离心机以4度12000rpm离心15分钟。离心结束后，小心取出EP管，转移上清到新的RNase-free的EP管中。再加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟或负20℃放置放置1小时，使RNA沉淀。于冷冻离心机以4℃，12000rpm离心15分钟。此时管底出现白色沉淀，吸出上清并丢弃。于冷冻离心机以冻离心机以4℃，12000rpm离心30秒，去除残余的异丙醇。加入1ml由DEPC水配制的水配制的75％的乙醇，轻轻颠倒摇晃，使沉淀浮起，以洗去RNA表面的离子和杂质。于冷冻离心机以4℃，12000rpm离心5分钟。小心取出EP管，吸出上清并丢弃，在酒精灯前烘干管底的白色沉淀，干燥的RNA粉末易飘，故要轻拿轻放，勿震动，待白色沉淀变为透明时，加入20-30微升的DEPC水，轻轻震荡混匀。用超微量核酸蛋白测定仪检测每管RNA的浓度，并做好标记。直接进行逆转录或放-80℃冰箱暂存。用无RNA酶的枪头操作，按照以下用量配制逆转录体系：

配置好逆转录体系后，在PCR管上做好标记，放入PCR仪进行逆转录。

逆转录程序如下：

实时荧光定量PCR检测细胞内干扰素IFN-α和IFN-β、促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α以及趋化因子CCL2、CCL5和CXCL10的mRNA表达水平。

实时荧光定量PCR的体系配制如下：

每个目的基因的在点样时需要设置三个重复的孔，样品上在96孔板中，加完样后将板子封闭好，放入荧光定量PCR仪中，设置好PCR的程序，如下：

等到程序完成后，根据得到的Ct值和溶解曲线等信息来分析实验结果。结果如图1所示，由图可知，双链DNA会激活天然免疫应答，诱导THP-1分化而来的巨噬细胞大量表达IFN-β和CXCL10。

实施例2：影响cGAS-STING信号通路的糖类筛选

用PMA(10ng/ml)诱导THP-1细胞48小时后，换成完全培养基继续分化24小时，使THP-1分化巨噬细胞。

分别用含有25mM果糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖和乳糖的培养基继续培养细胞24小时(不同糖类)，同时设置一组不额外添加糖类的对照组(CTRL)，之后转染HTDNA(5μg/ml)刺激6小时(HTDNA+不同糖类)，同时设置一组不额外添加糖类的培养基继续培养细胞24小时向细胞中转染HTDNA(5μg/ml)刺激6小时(HTDNA)，实时荧光定量PCR检测细胞内IFN-β和CXCL10的mRNA表达水平。结果如图2所示，由图可知，只有经过添加了果糖的培养基培养后细胞中IFN-β和CXCL10的mRNA表达水平有显著提高，果糖可以促进HTDNA诱导的IFN-β和CXCL10表达。

实施例3：果糖抑制HSV-1的复制

用PMA(10ng/ml)诱导THP-1细胞48小时后，换成完全培养基继续分化24小时，使悬浮的THP-1细胞分化为贴壁的巨噬细胞。用含有25mM果糖的培养基继续培养细胞0、6、12、24和48小时。用HSV-1刺激细胞12小时。实时荧光定量PCR检测HSV-1的ICP-27基因的mRNA表达水平，具体步骤参照实施例1。结果如图3中的左图所示，由图可知，随着果糖注射液处理时间的增加，HSV-I的复制被抑制。

用PMA(10ng/ml)诱导THP-1细胞48小时后，换成完全培养基继续分化24小时，使悬浮的THP-1细胞分化为贴壁的巨噬细胞。用含有0、5、10、20、40mM果糖的培养基继续培养细胞24小时。用HSV-1刺激细胞12小时。实时荧光定量PCR检测HSV-1的ICP-27基因的mRNA表达水平，具体步骤参照实施例1。结果如图3中的右图所示，由图可知，随着果糖处理浓度的增加，HSV-I的复制被抑制。

果糖的摄入会刺激KHK(果糖激酶)的表达。

实施例4：验证KHK与STING的相互作用

用含有果糖浓度为25mM的培养基培养293T细胞24小时；向细胞中转染HTDNA(5μg/ml)刺激6小时。收取细胞样品。吸出细胞培养液并丢弃，每孔加入PBS缓冲液，洗涤细胞。加入胰蛋白酶消化细胞，使贴壁的细胞掉落。将细胞转移到EP管中并做好标记，于离心机中以3000rpm离心5分钟,吸出上清并丢弃。加入NP-40细胞裂解液、蛋白酶抑制剂，重悬细胞，然后将EP管置于冰上半小时以裂解细胞。4℃、12000rpm离心15分钟，将含有蛋白质的上清转移至新的1.5mlEP管中并做好标记。测定样品的蛋白浓度，各个样品取出相同量的蛋白进行后续的实验。得到KHK与STING蛋白样品。

从各个样品中分别各取100ug的蛋白样至新的EP管中，做好标记,加入5×loadingbuffer吹打混匀，煮样5分钟，该样品作为input备用。向剩余的样品中加入protein A/Gbeads，于4℃的旋转摇床上摇1小时。取出EP管于4度3000rpm离心3分钟，缓慢吸取上清，转移至新的EP管中并做好标记。向管中加入相应的一抗，于4℃的旋转摇床上孵育过夜。之后，向其中再加入protein A/G beads，于4℃的旋转摇床上孵育2小时。将相同体积的NP-40细胞裂解液和1M的NaCl溶液混合,制备成漂洗液。4℃、3000rpm离心3分钟，缓慢吸出上清并丢弃。向管中加入1ml的漂洗液，上下颠倒十几次，使珠子重悬进行漂洗4℃、3000rpm离心3分钟,重复漂洗珠子5次。最后一次漂洗离心完小心吸出上清并丢弃。向管中加入1×SDS溶液和5ul的5×loading buffer，吹打均匀，于沸水中煮样5分钟。于离心机中以12000rpm离心3分钟，此为IP样品。根据目的蛋白的大小，配制合适浓度的SDS-PAGE凝胶，配制1×Gly的跑胶电泳缓冲液。根据实验需要，将合适量的蛋白质样品加入到上样孔中，并加入蛋白质Marker，以对照参考蛋白的大小。

加样完毕后盖好电泳槽的盖子，连接电源，整个电泳的过程根据目的蛋白大小和凝胶浓度的不同大约控制在2到3小时。从电泳槽中取下胶板，切去浓缩胶的部分和不需要的部分，将剩下的进行转膜。以200mM的恒定电流进行转膜，一般转膜2到3小时。转膜完成后需要对膜进行封闭。用TBST和脱脂奶粉配制浓度为5％的封闭液，将放入封闭液的膜置于摇床上以常温摇晃封闭1到2小时。将脱脂牛奶封闭液倒出丢弃，加入TBST漂洗3次，洗去残余的牛奶。之后加入10ml用TBST以合适比例稀释过的一抗，稀释比例按照抗体说明书来操作，一抗和膜置于4℃摇床上孵育过夜。回收一抗，加入TBST洗膜三次，每次10分钟。用TBST和脱脂牛奶配制浓度为3％的二抗孵育液，向配好的脱脂牛奶溶液中加入二抗，将二抗和膜置于摇床上室温摇晃孵育40分钟到1个小时。倒出二抗并丢弃，用TBST洗膜三次，每次15分钟。将膜置于LAS-4000化学发光成像仪中进行曝光，曝光时间可根据实际情况进行调整，保存所得图片并分析实验结果。结果如图4所示，从图4的结果来看KHK与STING具有相互作用。

实施例5：果糖浓度影响KHK的表达

分别用含有浓度为0、10、20、40mM果糖的培养基培养HepG2细胞24小时，之后用Western Blot检测细胞KHK和STING的蛋白表达水平。具体步骤参照实施例4。结果如图5所示，从结果来看随着加入的果糖浓度的增高，细胞内KHK的表达也显著增高。

实施例6：KHK与STING的细胞共定位

将细胞铺在专用的confocal小皿中，铺皿的细胞密度在50％左右，待细胞贴壁后用含有果糖浓度为25mM的培养基培养293T细胞24小时。向细胞中转染HTDNA(5μg/ml)刺激6小时。从细胞培养箱中取出小皿，吸出皿里的培养基并丢弃，向其中加入1ml的PBS缓冲液，放在摇床上室温摇晃5分钟，吸出PBS并丢弃，如此重复三次，以洗去皿中残留的培养基和杂质。向皿中加入1ml的4％多聚甲醛，室温静置15分钟，以固定皿中的细胞。固定完成后吸出多聚甲醛并丢弃。向皿中加入1ml终浓度为0.2％的TritonX-100，于4℃冰箱静置20分钟，使细胞透化。透化完成后吸出皿中液体并丢弃，加入1ml的PBS缓冲液，放在摇床上室温摇晃10分钟，吸出PBS并丢弃，如此重复三次。向皿中加入封闭液封闭1小时，封闭液是终浓度为0.3％的TritonX-100、5％ BSA的PBS溶液。吸出封闭液并丢弃，加入1ml的PBS缓冲液，放在摇床上室温摇晃10分钟，吸出PBS并丢弃，如此重复三次。将一抗以1:100的比例稀释于终浓度为0.3％的TritonX-100、1％的BSA的PBS溶液中，将100μl的一抗稀释液加入皿中央，于4℃冰箱孵育过夜或者室温孵育3-4小时。吸出一抗并丢弃，加入1ml的PBS缓冲液，放在摇床上室温摇晃10分钟，吸出PBS并丢弃，如此重复三次。向皿中加入对应种属的荧光标记的二抗，二抗稀释于终浓度为3％的BSA的PBS溶液中。二抗于37℃避光孵育1小时。吸出二抗并丢弃，加入1ml的PBS缓冲液，放在摇床上室温避光摇晃10分钟，吸出PBS并丢弃，如此重复三次。向皿中加入DAPI染色液，DAPI以1:100的比例稀释于甲醇中，于37℃避光孵育5分钟。吸出DAPI并丢弃，加入1ml的PBS缓冲液，放在摇床上室温避光摇晃10分钟，吸出PBS并丢弃，如此重复三次。样品制备完成，可将小皿置于激光共聚焦显微镜下观察。结果如图6所示，由图可知，KHK与STING具有细胞共定位。

实施例7：KHK增强STING对IRF3的募集

分别在293T细胞中共转染Flag-STING和Myc-IRF3并转染和不转染HA-KHK。向细胞中转染HTDNA(5μg/ml)刺激6小时。收取细胞并制备蛋白样品，具体步骤参照实施例4。进行coIP实验，具体步骤参照实施例4。Western Blot检测，具体步骤参照实施例4。结果如图7所示，由图可知，KHK的存在可以增强STING对IRF3的募集。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.果糖在制备增强细胞内激活的cGAS-STING天然免疫信号通路的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激活为经HTDNA或HSV-I刺激激活。

3.果糖在制备增强干扰素IFNβ表达的药物中的应用。

4.果糖在制备增强CXCL10表达的药物中的应用。

5.果糖在制备抗HSV-I感染药物中的应用。

6.果糖在制备增强STING对IRF3的招募的药物中的应用。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述果糖为以果糖为活性成分的药物制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物制剂为颗粒剂、注射剂、胶囊剂中的一种。

9.诱导KHK表达的物质在制备增强干扰素IFNβ表达的药物中的应用。

10.KHK在制备增强干扰素IFNβ表达的药物中的应用。

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